VALIDASI DAN VERIFIKASI METODE ANALISIS BAKTERI ASAM LAKTAT PADA PRODUK SUSU SKRIPSI IIN WAHYUNI F

Transkripsi

1 VALIDASI DAN VERIFIKASI METODE ANALISIS BAKTERI ASAM LAKTAT PADA PRODUK SUSU SKRIPSI IIN WAHYUNI F FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013

2 METHOD VALIDATION AND VERIFICATION FOR LACTIC ACID BACTERIA ANALYSIS IN MILK PRODUCTS Iin Wahyuni, Harsi D. Kusumaningrum Departement of Food Science and Technology, Faculty of Agricultural Technology, Bogor Agricultural University, IPB Darmaga Campus, PO BOX 220, Bogor, West Java, Indonesia. Phone: , iin.khumairah@gmail.com ABSTRACT Lactic acid bacteria (LAB) is a group of bacteria that capable converting carbohydrates (glucose) into lactic acid and mostly grow at facultatif anaerobic condition. At present, the most widely method used to enumerate LAB in some laboratory in Indonesia is incubation in aerob condition. In order to ensure that the method has a good performance, there is a need of method validation. Validation is the confirmation by examination and provision of objective evidence that particular requirements for specified intended use are fulfilled. The purpose of this study is to validate the quantitative method for enumeration of lactic acid bacteria. Two methods of enumeration of LAB in yoghurt were studied, i.e. ISO (E) as a reference method and SNI as an alternative method. The principle of this method is to grow the facultative anaerobic bacteria in aerobic and anaerobic condition incubated for 3 days at 37 o C on MRSA media. The anaerobic condition was made using Anaxomat jar whose enrich with 10% CO 2. The result obtained by these two method were compared. Therefore several parameters such as precision (RSD), relative accuracy, linearity, limit of detection, and limit of quantification were evaluated. The results showed that RSD of these methods between 0.44% and 3.03%, percent recovery of these methods between 97% and 101%, and limit of detection are 3 cfu/ml. It can be concluded that these two methods have good performance characteristics. Keywords : enumeration, lactic acid bacteria, milk products, validation

3 IIN WAHYUNI. F Validasi dan Verifikasi Metode Analisis Bakteri Asam Laktat pada Produk Susu. Di bawah bimbingan : Dr. Ir. Harsi D. Kusumaningrum RINGKASAN Bakteri asam laktat merupakan bakteri yang umumnya bersifat fakultatif anaerob. Bakteri ini umumnya mampu tumbuh dengan atau tanpa oksigen. Dalam menghitung jumlah bakteri tersebut diperlukan suatu metode yang valid, sehingga diperlukan adanya validasi metode. Pada penelitian ini dilakukan validasi metode analisis yaitu SNI sebagai metode alternatif dan ISO (E) sebagai metode acuan. Kedua metode tersebut merupakan metode yang digunakan untuk menghitung jumlah bakteri kultur starter yogurt yang merupakan bakteri asam laktat. Prinsip dari kedua metode tersebut adalah pertumbuhan bakteri fakultatif anaerob pada media MRSA dengan suhu inkubasi 37 o C selama tiga hari. Berdasarkan metode SNI inkubasi dilakukan secara aerob sedangkan menurut metode ISO inkubasi dilakukan secara anaerob. Penelitian ini bertujuan memperoleh data validasi metode analisis bakteri asam laktat pada susu, khususnya genus Lactobacillus dan membandingkan kedua metode pengujian bakteri asam laktat dengan parameter linieritas, presisi, relatif akurasi, dan limit deteksi. Penelitian dilakukan dengan beberapa tahapan yaitu tahap persiapan kultur inokulum, tahap validasi, dan tahap verifikasi terhadap beberapa sampel susu komersial. Penentuan relatif akurasi, presisi, dan linieritas dilakukan sebanyak lima kali ulangan dengan lima konsentrasi inokulum dari rendah hingga tinggi yaitu 0, 10 2, 10 4, 10 6, dan 10 8 cfu/ml. Tahap penentuan limit deteksi dan limit kuantifikasi dilakukan sebanyak enam kali ulangan dengan tiga tingkat konsentrasi inokulum rendah yaitu 3, 30, dan 60 cfu/ml. Tahapan terakhir yaitu penerapan metode tervalidasi untuk menganalisis beberapa sampel susu komersial yaitu susu cair, susu fermentasi, dan susu bubuk. Penghitungan jumlah koloni bakteri didasarkan pada aturan SNI dan ISO. Berdasarkan metode ISO jumlah koloni yang masuk ke dalam perhitungan yaitu berkisar antara 15 sampai 300 koloni, sedangkan menurut SNI adalah 25 sampai 250 koloni. Berdasarkan hasil tahap penentuan jumlah kultur uji awal yaitu Lactobacillus bulgaricus yang dilakukan sebanyak lima kali ulangan diperoleh rata-rata sebesar cfu/ml untuk inkubasi secara aerob dan cfu/ml untuk inkubasi secara anaerob. Jumlah kultur awal ini yang dijadikan acuan pengenceran yang dilakukan. Berdasarkan hasil penghitungan jumlah kultur awal diketahui bahwa untuk metode aerob RSD hitung (0.53%) dan untuk metode anerob memiliki RSD hitung sebesar 0.40%. Relatif akurasi dinyatakan dalam bentuk persen perolehan kembali (recovery). Nilai recovery untuk metode SNI dari keempat tingkatan yaitu 10 2, 10 4, 10 6, dan 10 8 cfu/ml berturut-turut 98%, 98%, 101%, dan 99%, sedangkan metode ISO 98%, 97%, 100%, dan 99%. Berdasarkan nilai persen recovery ini keakuratan dari kedua metode dapat diterima karena telah memenuhi persyaratan AOAC (2002) yaitu berada di rentang 80 hingga 120%. Presisi dalam penelitian ini dinyatakan dalam nilai relative standard deviation (RSD). Pada penetuan nilai RSD dengan mengacu pada aturan SNI (25 sampai 250 koloni/cawan) diperoleh nilai RSD pada tingkat inokulum untuk metode SNI (aerob) berturut-turut 2.47%, 1.90%, 1.07%, dan 0.74%, sedangkan untuk metode ISO (anaerob) sebesar 2.09%, 1.31%, 1.38%, dan 0.44%. Dilihat dari nilai RSD, tiga dari empat tingkatan inokulum metode ISO memiliki RSD yang lebih kecil dari metode SNI. Hal ini menunjukkan bahwa ketelitian dari metode ISO lebih baik dari pada metode SNI.

4 Analisis linearitas dilakukan dengan menggunakan kurva linear dan persamaan garis yang menggambarkan hubungan antara logaritma jumlah inokulum yang ditambahkan kedalam susu dan jumlah sel yang diperoleh dari kedua metode. Persamaan garis untuk metode SNI, y = x dan ISO y = x Rata-rata nilai koefisien determinasi (R 2 ) dari metode aerob dan anerob secara berturut-turut yaitu sebesar dan Nilai R 2 yang mendekati 1 menunjukkan hubungan linearitas yang sangat baik. Nilai koefisien determinasi ini telah memenuhi aturan yang dipersyaratkan AOAC (2002) yaitu Limit deteksi yang diperoleh dari kedua metode mencapai konsentrasi yang sangat kecil yaitu pada konsentrasi 3 cfu/ml masih dapat terdeteksi adanya koloni. Setelah dilakukan enam kali ulangan pada konsentrasi inokulum terkecil masih terdeteksi adanya bakteri asam laktat. Berdasarkan hasil perhitungan limit deteksi dan limit kuantifikasi dari persamaan linier diperoleh nilai masingmasing sebesar 2 cfu/ml dan 5 cfu/ml. Hasil verifikasi metode pada beberapa jenis susu fermentasi menunjukkan bahwa pada inkubasi secara anaerob memiliki jumlah koloni yang lebih tinggi. Akan tetapi setelah dilakukan uji lanjut kedua metode baik metode ISO maupun metode SNI tidak berbeda nyata pada taraf signifikansi 5%. Hasil verifikasi menunjukkan bahwa kedua metode memiliki presisi yang baik ditandai dengan nilai RSD yang sangat kecil yaitu berkisar antara 0.19 dan 0.66%. Hal ini menunjukkan bahwa walaupun validasi dilakukan pada media MRSA dengan Lactobacillus bulgaricus sebagai mikroorganisme uji, tetapi metode dapat digunakan untuk menguji total BAL pada susu fermentasi. Hasil pengujian menunjukkan metode SNI (aerob) memiliki perameter uji yang baik seperti halnya metode ISO (anaerob), tetapi rentan dengan kontaminasi kapang terutama untuk sampel yang kemungkinan mengandung kapang.

5 VALIDASI DAN VERIFIKASI METODE ANALISIS BAKTERI ASAM LAKTAT PADA PRODUK SUSU SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN Pada Depertemen Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Tekonologi Pertanian Institut Pertanian Bogor Oleh IIN WAHYUNI F FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013

6 Judul Skripsi Nama NIM : Validasi dan Verifikasi Metode Analisis Bakteri Asam Laktat Pada Produk Susu : Iin Wahyuni : F Menyetujui, Dosen pembimbing, (Dr. Ir. Harsi D. Kusumaningrum) NIP Mengetahui, Ketua Departemen, (Dr. Ir. Feri Kusnandar, M.Sc.) NIP Tanggal sidang : 10 Desember 2012

7 PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi dengan judul Validasi dan Verifikasi Metode Analisis Bakteri Asam Laktat pada Produk Susu adalah hasil karya saya sendiri dengan arahan Dosen Pembimbing, dan belum diajukan dalam bentuk apapun pada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Bogor, Desember 2012 Yang membuat pernyataan Iin Wahyuni F

8 Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, Tahun 2013 Hak cipta dilindungi Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin dari Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam bentuk apapun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya

9 BIODATA PENULIS Iin Wahyuni. Lahir di Sukoharjo, 31 Desember 1989 dari Bapak Siswanto dan Ibu Giyem, sebagai anak kedua dari tiga bersaudara. Penulis menyelesaikan pendidikan sekolah dasar di SD N Mranggen 3 pada tahun Pada tahun 2005 penulis menyelesaikan pendidikan sekolah menengah di SMP N 1 Mojolaban. Penulis menamatkan SMA pada tahun 2008 dari MA Al-Islam Surakarta, dan pada tahun yang sama diterima di IPB melalui jalur Beasiswa Utusan Daerah dari Departemen Agama. Penulis memilih Program Studi Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian. Selama menjalani pendidikan di IPB, penulis aktif mengikuti beberapa organisasi diantaranya Lembaga Dakwah Masjid Al-Hurriyyah pada tahun dan Forum Bina Islami, Fakultas Teknologi Pertanian pada tahun Pada tahun 2011 penulis mengikuti MTQ mahasiswa bidang Karya Tulis Ilmiah Al-Qur an tingkat IPB dan memperoleh juara I. Selain itu pada tahun yang sama mengikuti MTQ Mahasiswa bidang Karya Tulis Ilmiah Al-Qur an tingkat Nasional di Makassar, Sulawesi Selatan dan memperoleh juara IV. Selama menjadi mahasiswa penulis mengikuti berbagai kepanitiaan diantaranya Masa Perkenalan Fakultas Teknologi Pertanian (Techno-F) pada tahun 2010, Masa Perkenalan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan (BAUR) pada tahun 2010, Kajian Pangan Halal tahun 2011, dan tim pembuat soal LCTN PSBN Penulis aktif sebagai asisten praktikum kimia dasar mahasiswa Tingkat Persiapan Bersama (TPB) selama tiga periode tahun Selain itu juga penulis pernah aktif menjadi pengajar mata kuliah Fisika Dasar untuk mahasiswa TPB di Bimbingan Belajar CSS MoRA (2009) dan KATALIS (2012). ii

10 KATA PENGANTAR Puji syukur Alhamdulillah dipanjatkan kehadirat Allah SWT sehingga atas karunianya penulis dapat menyelesaikan skipsi ini. Penelitian dengan judul Validasi dan Verifikasi Metode Analisis Bakteri Asam Laktat pada Produk Susu dilaksanakan di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pangan, Institut Pertanian Bogor sejak bulan Februari sampai September Dengan selesainya penelitian hingga tersusunnya skripsi ini, penulis ingin menyampaikan penghargaan dan ungakapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1. Kedua orang tua penulis yang senantiasa memberikan motivasi, nasehat, serta doa selama penulis menempuh kuliah. 2. Dr. Ir. Harsi D. Kusumaningrum sebagai dosen pembimbing skripsi yang dengan sabar membimbing penulis dalam menyelesaikan penelitian ini. 3. Dr. Ir. Budi Nurtama, M.Agr dan Dian Herawati, STP., M.Si sebagai dosen penguji yang telah memberikan masukan untuk kesempurnaan skripsi penulis. 4. Laboratorium Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan (LDITP) yang telah mendanai penelitian yang dilakukan oleh penulis. 5. Departemen Agama yang telah memberikan beasiswa penuh selama penulis menempuh kuliah di IPB. 6. Seluruh Dosen Departemen ITP yang telah memberikan ilmu dan berbagi pengalaman terhadap penulis. 7. Kakak penulis, Joko Supriyanto, S.HI dan Siti Masjidah, S.Pd yang selalu memberi motivasi dan nasehat yang sangat berharga bagi penulis. 8. Segenap teknisi laboratorium ITP IPB, terutama teknisi laboratorium Mikrobiologi Pangan, Teh Nurul dan Mas Edi yang telah membantu penulis dalam pelaksanaan penelitian. 9. Seluruh teman sekelas ITP 45 yang telah memberikan dukungan dan kegembiraan selama perkuliahan. 10. Teman-teman satu laboratorium, Efratia, Lathifah, Nisa, Raudha, Priska, Dio, Bangun, Rista, Ichal, Ardy, Kak Kiki, Fathin, Tiur, Ahmadun yang selalu memberikan semangat kepada penulis, serta Rendy sebagai teman satu bimbingan yang selalu memberikan semangat. 11. Teman-teman kostan kamila, Intan, Icha, Ube, Irma, Eka, Arum, Wulan, Nurul, Neng, Anik, Nola, Dara, Jihan, Vio yang telah memberikan keceriaan dan kehangatan sebagai keluarga kepada penulis. 12. Kepala sekolah dan guru MA Al-Islam Jamsaren, Bapak Mufti Addin, Pak Syafi i, Pak Sigit, Pak Wakhid, Pak Joko yang telah menghantarkan penulis menjadi salah satu mahasiswi IPB. 13. Sahabat-sahabat MALISKA, Septi, Siti, Edi, Ihsan, Yanuar, dan Agus yang selalu menjadi teman terbaik penulis. 14. Teman-teman CSS Mora IPB dan FBI FATETA yang telah memberikan semangat kepada penulis. Akhirnya penulis berharap semoga tulisan ini memberikan manfaat dan kontribusi nyata terhadap perkembangan ilmu pengetahuan di bidang Teknologi pangan. Bogor, Desember 2012 Iin Wahyuni iii

11 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR ISI... iv DAFTAR TABEL... v DAFTAR GAMBAR... vi DAFTAR LAMPIRAN... vii I. PENDAHULUAN LATAR BELAKANG TUJUAN PENELITIAN MANFAAT PENELITIAN... 2 II. TINJAUAN PUSTAKA SUSU DAN PRODUK SUSU BAKTERI ASAM LAKTAT METODE ANALISIS METODE ANALISIS BAKTERI ASAM LAKTAT VALIDASI DAN VERIFIKASI METODE... 8 III. METODOLOGI PENELITIAN WAKTU DAN TEMPAT BAHAN DAN PERALATAN METODE PENELITIAN PROSEDUR VALIDASI METODE PENGOLAHAN DATA...15 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN KULTUR UJI PARAMETER UJI TERVALIDASI VERIFIKASI METODE PADA PRODUK SUSU...25 V. KESIMPULAN DAN SARAN KESIMPULAN SARAN...29 DAFTAR PUSTAKA...30 LAMPIRAN...33 iv

12 DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Komposisi susu sapi segar...3 Tabel 2. Persyaratan mutu mikrobiologi pada susu cair Tabel 3. Persyaratan mutu mikrobiologi pada produk susu bubuk...4 Tabel 4. Persyaratan mutu mikrobiologi pada produk susu fermentasi...4 Tabel 5. Karakteristik kultur yang dapat tumbuh pada media MRSA Tabel 6. Parameter verifikasi untuk uji mikrobiologi...9 Tabel 7. Jumlah awal kultur uji setelah inkubasi 24 jam pada suhu 37 o C, dihitung pada media MRSA yang diinkubasi secara aerob dan anaerob Tabel 8. Rata-rata persen perolehan kembali (n = 5) dengan perhitungan koloni mengacu pada metode SNI ( koloni/cawan), pada kondisi aerob dan anaerob Tabel 9. Rata-rata persen perolehan kembali (n = 5) dengan perhitungan koloni mengacu pada metode ISO ( koloni/cawan), pada kondisi aerob dan anaerob Tabel 10. Parameter statistik persamaan linier (n = 5) dengan perhitungan mengacu pada metode SNI ( koloni/cawan) Tabel 11. Parameter statistik persamaan linier (n = 5) dengan perhitungan mengacu pada metode ISO ( koloni/cawan) Tabel 12. Hasil verifikasi metode pada susu UHT dan pasteurisasi Tabel 13. Perbandingan jumlah bakteri asam laktat dalam susu fermentasi Tabel 14. Hasil verifikasi metode pada susu bubuk v

13 DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Diagram alir penelitian penetuan linieritas, akurasi, dan presisi Gambar 2. Diagram alir penentuan limit deteksi dan limit kuantifikasi Gambar 3. Koloni Lactobacillus bulgaricus pada media MRSA setelah inkubasi 3 hari pada suhu 37 o C Gambar 4. Hasil pewarnaan Gram bakteri Lactobacillus bulgaricus dengan perbesaran 1000 kali.. 17 Gambar 5. Jumlah koloni bakteri asam laktat yang diperoleh pada tiap tingkatan inokulum dengan perhitungan mengacu pada metode SNI ( koloni/cawan), n = Gambar 6. Jumlah koloni bakteri asam laktat yang diperoleh pada tiap tingkatan inokulum dengan perhitungan mengacu pada metode ISO ( koloni/cawan), n = Gambar 7. Presisi metode, dinyatakan sebagai nilai relative standard deviation (RSD) pada tiap tingkatan inokulum dengan perhitungan mengacu pada metode SNI ( koloni/cawan), n = Gambar 8. Presisi metode, dinyatakan sebagai nilai relative standard deviation (RSD) pada tiap tingkatan inokulum dengan perhitungan mengacu pada metode ISO ( koloni/cawan), n = Gambar 9. Linieritas metode SNI dan metode ISO dengan penghitungan mengacu pada metode SNI ( koloni/ml), n = Gambar 10. Linieritas metode SNI dan metode ISO dengan penghitungan mengacu pada metode ISO ( koloni/ml), n = Gambar 11. Hasil pewarnaan Gram koloni bakteri terduga false positif Gambar 12. Cawan yang terkontaminasi kapang vi

14 DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Jumlah awal kultur Lactobacillus bulgaricus Lampiran 2. Perhitungan RSD kultur inokulum untuk inkubasi secara aerob Lampiran 3. Perhitungan RSD kultur inokulum untuk inkubasi secara anaerob...35 Lampiran 4. Perhitungan RSD untuk inkubasi secara aerob dengan mengacu metode SNI ( koloni)...36 Lampiran 5. Perhitungan RSD untuk inkubasi secara anaerob dengan mengacu metode SNI ( koloni)...37 Lampiran 6. Perhitungan RSD untuk inkubasi secara aerob dengan mengacu metode ISO ( koloni)...38 Lampiran 7. Perhitungan RSD untuk inkubasi secara anaerob dengan mengacu metode ISO ( koloni)...39 Lampiran 8. Penentuan limit deteksi (LOD) Lampiran 9. Verifikasi metode pada beberapa merek susu fermentasi Lampiran 10. Uji t sampel susu fermentasi...42 Lampiran 11. Instruksi kerja analisis bakteri asam laktat vii

15 I. PENDAHULUAN 1.1 LATAR BELAKANG Susu merupakan bahan pangan yang bergizi tinggi karena mengandung zat-zat makanan yang lengkap dan seimbang seperti protein, lemak, karbohidrat, mineral, dan vitamin yang sangat dibutuhkan oleh manusia. Kandungan gizi yang sangat tinggi ini menjadikan susu sebagai media yang sangat baik untuk pertumbuhan mikroba. Mikroba yang umumnya ditemukan pada susu yaitu bakteri asam laktat. Selain itu, bakteri asam laktat dapat juga ditambahkan pada susu untuk menghasilkan susu fermentasi. Bakteri asam laktat adalah kelompok bakteri yang mampu mengubah karbohidrat (glukosa) menjadi asam laktat. Pada umumnya bakteri asam laktat dihubungkan dengan habitat yang kaya akan nutrisi seperti susu, daging, sayuran, tetapi beberapa merupakan mikroflora mulut, usus, dan vagina dari mamalia (Axelsson 2004). Bakteri asam laktat pada umumnya merupakan bakteri fakultatif anaerob yang dapat tumbuh pada kondisi dengan atau tanpa oksigen (Ray dan Bunia 2008). Akan tetapi ada sebagian bakteri asam laktat yang bersifat anaerob obligat yaitu genus Bifidobacterium, seperti Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, dan Bifidobacterium bifidum (Ballongue 2004). Sejauh ini diketahui bahwa bakteri asam laktat tidak bersifat patogen dan aman untuk dikonsumsi sehingga dapat dipakai untuk meningkatkan kesehatan. Asam laktat yang dihasilkan bakteri asam laktat dalam saluran pencernaan dapat mencegah pertumbuhan bakteri yang merugikan dan sebagai kontrol pembuangan kotoran dengan cara merangsang dinding saluran pencernaan. Asamasam organik seperti asam laktat dan asam asetat yang diproduksi bakteri asam laktat sebagai hasil fermentasi laktosa dalam susu dapat membantu aktivitas usus dengan merangsang peristaltis, meningkatkan kecernaan dan penyerapan (Widyastuti dan Sofarianawati 1999) Jumlah bakteri asam laktat umumnya dipersyaratkan pada produk fermentasi tertentu, sehingga untuk mengetahui jumlah bakteri asam laktat pada produk tersebut diperlukan suatu pengujian laboratorium. Pengujian ini harus dilakukan dengan menggunakan metode yang valid/baku, untuk itu diperlukan validasi sebelum metode digunakan. Menurut Sukarno (2005), validasi diperlukan untuk mendapatkan hasil analisis yang valid/absah, dapat dipercaya, dapat dipertanggungjawabkan secara ilmiah, dan kesesuaian dengan tujuan. Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk memenuhi syarat sesuai tujuan penggunaan atau konfirmasi melalui pengujian dan bukti syarat obyektif agar persyaratan untuk maksud khusus dipenuhi (Sac-Singlas 2002). Menurut ISO/IEC , laboratorium harus memvalidasi metode tidak baku, metode yang didesain/dikembangkan oleh laboratorium, metode baku yang digunakan di luar lingkup yang dimaksudkan, dan penegasan serta modifikasi dari metode baku untuk mengkonfirmasi bahwa metode itu sesuai dengan penggunaan yang dimaksudkan. Validasi primer dilakukan jika laboratorium menggunakan metode analisis baru hasil pengembangan, atau metode yang dimodifikasi terhadap suatu metode standar. Validasi sekunder dilakukan untuk verifikasi jika laboratorium menggunakan atau mengadopsi metode standar yang telah divalidasi. Validasi metode bermanfaat untuk mengevaluasi unjuk kerja suatu metode analisis, menjamin prosedur analisis yang akurat, dan menekan sekecil-kecilnya resiko penyimpangan yang timbul. Suatu metode analisis dikatakan absah jika telah memenuhi syarat keberterimaan parameter validasi.

16 Menurut ISO parameter kinerja yang harus divalidasi adalah akurasi, presisi, penetapan batas terendah dari kisaran hitung (limit deteksi), limit kuantitasi, dan linieritas. Pengujian jumlah bakteri asam laktat pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode yang mengacu pada ISO (E) dan SNI tentang penghitungan jumlah bakteri kultur starter pada yogurt. Perbedaan dari kedua metode ini adalah pada kondisi inkubasi untuk ISO inkubasi dilakukan secara anaerob dan SNI secara aerob. Kedua perlakuan tersebut dibandingkan hasilnya sehingga didapatkan metode yang valid. 1.2 TUJUAN PENELITIAN Penelitian ini bertujuan : 1. Melakukan validasi metode analisis pengujian bakteri asam laktat pada susu cair, khususnya Lactobacillus bulgaricus. 2. Membandingkan metode pengujian bakteri asam laktat metode SNI dan ISO (E) dengan parameter relatif akurasi, presisi, linieritas, limit deteksi dan limit kuantifikasi. 3. Menerapkan metode uji tervalidasi untuk pengujian bakteri asam laktat pada produk susu. 1.3 MANFAAT PENELITIAN Dengan dilakukan penelitian ini, diharapkan dapat memperoleh keabsahan (validitas) metode analisis bakteri asam laktat sehingga selanjutnya dapat diterapkan dalam analisis seluruh produk susu. 2

17 II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 SUSU DAN PRODUK SUSU Susu adalah cairan yang berasal dari ambing sapi sehat dan bersih. yang diperoleh dengan cara pemerahan yang benar, kandungan alaminya tidak dikurangi atau ditambah sesuatu apapun dan belum mendapat perlakuan apapun kecuali proses pendinginan tanpa mempengaruhi kemurniannya (BSN 1998). Susu merupakan bahan pangan yang bergizi tinggi karena mengandung zat-zat makanan yang lengkap yaitu protein, lemak, karbohidrat, vitamin, dan mineral yang sangat diperlukan oleh tubuh manusia. Kandungan gizi susu secara lengkap seperti yang ditampilkan pada Tabel 1. Susu mempunyai peranan yang strategis dalam kehidupan manusia karena mengandung komponen gizi yang lengkap serta kompleks. Tabel 1. Komposisi susu sapi segar No. Komponen Konsentrasi (g/liter) 1. Lemak 37 Trigliserida Digliserida Asam lemak bebas Total pospolipid Protein 34 Casein 26 α S α S2 1.7 β 8.2 γ 1.2 κ 3.7 Whey protein 0.7 α lactalbumin 3.0 β lactoglobulin 0.3 serum albumin 0.6 Immunoglobulins Non-Protein Nitrogen Laktosa Asam sitrat Abu Kalsium Pospor 0.96 Sumber : Adams & Moss (2008) Mikroorganisme yang terdapat dalam susu segar dapat berasal dari sapi ataupun alat pemerahan susu dan penanganannya. Dengan penanganan dan kondisi penyimpanan yang semestinya mikroba dalam susu umumya adalah bakteri gram positif. Susu segar yang disimpan dalam refrigerator dapat mengandung beberapa bakteri dari genus antara lain : Enterococcus, Lactococcus,

18 Streptococcus, Lactobacillus, Microbacterium, Oerskavia, Propionibacterium, Micrococcus, Proteus, Pseudomonas, Bacillus, Listeria, dan sedikitnya satu jenis bakteri koliform (Jay 2000). Susu memiliki water activity (a w ) yang tinggi, ph netral ( ), dan nutrien yang tinggi yang membuat susu menjadi media yang sangat baik untuk pertumbuhan mikroba (Adams dan Moss 2008). Kandungan nilai gizi yang tinggi pada susu merupakan media yang sangat disukai oleh mikroba untuk pertumbuhannya, sehingga apabila tidak dilakukan penanganan yang tepat susu akan mudah rusak oleh kehadiran mikroba. Untuk itu susu biasanya telah mengalami pengolahan seperti susu pasteurisasi, susu kental manis, susu UHT, susu fermentasi, maupun susu bubuk. Tabel 2, 3, dan 4 menunjukkan jumlah cemaran mikroba yang dipersyaratkan SNI untuk beberapa produk susu cair. Tabel 2. Persyaratan mutu mikrobiologi pada susu cair (SNI ) No Jenis cemaran mikroba Susu segar Batas maksimum cemaran mikroba Susu pasteurisasi Susu steril/uht 1 Total Pate count (cfu/ml) 1 x 10 6 <3 x 10 4 < 10/0.1 2 Coliform 20/ ml < 0.1 x E. coli (patogen) (*) Enterococci 1 x x S. aureus (cfu/ml) 1 x x Clostridium sp Salmonella sp (**) Negatif Negatif Negatif 8 Camphylobacter sp Listeria sp Keterangan : (*) : dalam satuan MPN/ gram atau ml (**) : dalam satuan kualitatif Tabel 3. Persyaratan mutu mikrobiologi produk susu bubuk (SNI ) No Jenis Satuan Susu bubuk berlemak Persyaratan Susu bubuk rendah lemak Susu bubuk tanpa lemak 1 ALT Koloni/g Maks. 5 x 10 4 Maks. 5 x 10 4 Maks. 5 x Coliform APM Maks 10 Maks 10 Maks 10 3 E. coli Koloni/g < 3 < 3 < 3 4 Salmonella Koloni/100gr Negatif Negatif Negatif 5 S. aureus Koloni/g 1 x x x 10 2 Tabel 4. Persyaratan mutu mikrobiologi produk susu fermentasi (SNI ) No Kriteria uji Satuan Yogurt tanpa perlakuan panas setelah fermentasi Persayaratan 1 Bakteri koliform APM/g Maks 10 Maks 10 2 Salmonella - Negatif/25 g Negatif/25 g 3 L. monocytogenes - Negatif/25 g Negatif/25 g 4. Jumlah bakteri starter Koloni/g Min Yogurt dengan perlakuan panas setelah fermentasi 4

19 2.2 BAKTERI ASAM LAKTAT Bakteri asam laktat adalah kelompok bakteri yang mampu mengubah karbohidrat (glukosa) menjadi asam laktat (Ray dan Bhunia 2008). Pada umumnya bakteri asam laktat dihubungkan dengan habitat yang kaya akan nutrisi seperti susu, daging, sayuran, tetapi beberapa merupakan mikroflora mulut, usus, dan vagina dari mamalia (Axelsson 2004). Bakteri asam laktat dapat disolasi dari saluran pencernaan atau air susu ibu hewan dan manusia dan atau buah terfermentasi. Salah satu yang berpontesi penghasil bakteri asam laktat adalah air susu ibu yang kaya akan nutrien yang menunjang untuk pertumbuhan bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat umumnya termasuk bakteri fakultatif anaerobik yang dapat tumbuh pada kondisi dengan atau tanpa oksigen. Bakteri asam laktat merupakan kelompok bakteri gram positif yaitu suatu mikroorganisme yang dapat menahan kompleks pewarna primer ungu kristal iodium. Bakteri asam laktat umumnya tidak membentuk spora, berbentuk bulat atau batang, tidak menghasilkan katalase, dan merupakan kemoorganotrof yang hanya bisa tumbuh pada media kompleks (Axelsson 2004). Bakteri asam laktat erat kaitannya dengan fermentasi pangan secara tradisisonal dan termasuk golongan mikroorganisme yang aman untuk ditambahkan dalam pangan, karena sifatnya yang tidak toksik dan tidak menghasilkan toksin yang sering disebut dengan sebutan food grade microorganism atau disebut juga dengan mikroorganisme generally recognized as safe (GRAS) yaitu mikroorganisme yang tidak beresiko terhadap kesehatan (Holzapfel et al. 1995). Selain itu bakteri asam laktat juga termasuk bakteri probiotik yaitu mikroorganisme hidup yang bila diberikan dalam jumlah tertentu memberikan manfaat bagi inangnya seperti mencegah diare menjaga keseimbangan flora usus, mencegah kanker dan menurunkan kolesterol (Reid et al. 2003). Sejauh ini diketahui bahwa bakteri asam laktat tidak bersifat patogen dan aman untuk dikonsumsi sehingga dapat dipakai untuk meningkatkan kesehatan baik manusia maupun ternak. Asam laktat yang dihasilkan bakteri asam laktat dalam saluran pencernaan dapat mencegah pertumbuhan bakteri yang merugikan dan sebagai kontrol pembuangan kotoran dengan cara merangsang dinding saluran pencernaan. Asam-asam organik seperti asam laktat dan asam asetat yang diproduksi bakteri asam laktat sebagai hasil fermentasi laktosa dalam susu dapat membantu aktivitas usus dengan merangsang peristaltis, meningkatkan kecernaan dan penyerapan (Widyastuti dan Sofarianawati 1999). Terdapat 12 genus bakteri yang menunjukkan kemampuannya dalam menghasilkan asam laktat dari karbohidrat. Genus yang termasuk ke dalam grup bakteri asam laktat yaitu Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Aerococcus, Vagococcus, Tetragenococcus, Carnobacterium, Weisella, dan Oenococcus. Beberapa genus bakteri merupakan hasil pemisahan dari genus sebelumnya, sebagai contoh Lactococcus dan Enterococcus sebelumnya merupakan genus Streptococcus Grup N dan Grup D (Ray dan Bhunia 2008). Beberapa genus bakteri asam laktat yang umumnya dibahas diantaranya adalah Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, dan Bifidobacterium. Lactococcus berbentuk oval dengan diameter sel 0.5 sampai 1.0 μm, dapat ditemui dalam bentuk berpasangan atau rantai pendek. Lactococcus bersifat non-motil, tidak berspora, fakultatif anaerob hingga microaerofilik. Pada umumnya bakteri tumbuh dengan baik pada suhu 20 sampai 30 o C, namun tidak dapat tumbuh pada ph 9.6 atau larutan 6.5% NaCl. Bakteri ini dapat menghasilkan 1% L(+)-lactic acid dan menurunkan ph hingga 4.5. Habitat alami bakteri ini adalah sayuran hijau, silase, dan susu segar (Ray dan Bhunia 2008). 5

20 Lactobacillus merupakan bakteri yang berbentuk batang yang sangat beragam ukurannya ada yang berbentuk batang pendek maupun panjang dan merupakan bakteri fakultatif anaerob. Sebagian besar bakteri non-motil, mesofilik (tetapi ada sebagian yang psikotropik), dapat bersifat homo atau heterofermentatif. Bakteri dapat ditemukan pada tumbuhan, susu, daging, maupun feses. Ada beberapa spesies yang digunakan untuk menghasilkan produk pangan seperti Lactobacillus bulgaricus dan Lactobacillus plantarum, ada juga beberapa spesies yang merupakan probiotik seperti Lactobacillus casei, Lactobacillus reutei, dan Lactobacillus acidophilus. Sebagian ada yang menghasilkan bakteriosin yang dapat digunakan sebagai pengawet alami (Ray dan Bhunia 2008). Streptococcus thermophilus merupakan bakteri asam laktat yang biasa digunakan untuk menghasilkan susu fermentasi. Bakteri ini merupakan bakteri Gram positif yang memiliki bentuk bulat dengan diameter 0.7 hingga 0.9 μm. Pertumbuhan optimum pada suhu 37 sampai 40 o C, tetapi dapat juga tumbuh pada suhu 52 o C. Bakteri ini merupakan bakteri fakultatif anaerob dan pada larutan gula dapat menurunkan ph hingga 4.0 dan menghasilkan L(+)-lactic acid. Bakteri ini dapat memfermentasi manosa, fruktosa, dan laktosa, tetapi umumnya tidak dapat memfermentasi galaktosa dan sukrosa. Sel bakteri dapat bertahan pada suhu 60 o C selama 30 menit. Habitat asli dari bakteri ini tidak diketahui tetapi bakteri ini dapat ditemukan secara alami di susu (Ray dan Bhunia 2008). Leuconostoc merupakan bakteri Gram positif, berbentuk bulat, tidak membentuk spora, non motil, katalase negatif, dan bersifat fakultatif anaerob. Bakteri ini dapat tumbuh dengan baik pada suhu 20 sampai 30 o C, dengan kisaran 1 sampai 37 o C. Glukosa difermentasi menjadi D(-)-lactic acid, CO 2, ethanol atau asam asetat, dan menurunkan ph hingga 4.5 sampai 5.0. Jenis bakteri ini dapat tumbuh di susu tetapi tidak membuat susu mengental arginin tidak terhidrolisis. Sitrat dimanfaatkan untuk menghasilkan diasetil dan CO 2. Leuconostoc ditemukan di tanaman, sayuran, susu, beberapa produk susu. dan daging segar atau yang sudah diolah (Axelsson 2004). Pediococcus memiliki bentuk bulat dan membentuk tetrad tetapi ada yang berpasangan. Pediococcus tidak dijumpai dalam bentuk tunggal ataupun rantai. Bakteri ini termasuk bakteri Gram positif, non motil, tidak berspora, dan bersifat fakultatif anaerob. Bakteri tumbuh pada suhu 25 sampai 40 o C, namun beberapa ada yang tumbuh pada suhu 50 o C. Bakteri ini memfermentasi glukosa menjadi L(+)- atau DL-lactic acid dan beberapa dapat menurunkan ph hingga 3.6. Tergantung dari jenis bekteri, mereka dapat memfermentasi sukrosa, arabinosa, xilosa, dan ribosa. Laktosa umumnya tidak difermentasi, terutama pada susu dan tidak membuat susu menjadi mengental. Ada sebagian dari strain bakteri ini yang memiliki kemampuan hidrolisis laktosa yang lemah, terutama pada larutan yang berisi laktosa sebagai sumber karbohidratnya. Bakteri ini dapat ditemukan pada tanaman, sayuran, bir, silase, susu, sayuran fermentasi, daging, dan ikan tergantung dari jenisnya. Genus Pediococcus ini memiliki tujuh hingga delapan jenis bakteri (Ray dan Bhunia 2008). Bifidobacterium memiliki bentuk morfologi yang sama dengan beberapa jenis Lactobacilus spp. dan sebelumnya dikelompokkan dalam genus Lactobacillus. Bakteri ini merupakan bakteri Gram positif yang memiliki bentuk dan ukuran yang bervariasi, serta dapat ditemui dalam bentuk tunggal ataupun rantai. Bifidobacterium tidak berspora, tidak motil danbersifat anaerob obligat, meskipun ada sebagian yang masih mentoleransi adanya O 2 jika didalamnya masih terdapat CO 2. Bakteri jenis ini memiliki pertumbuhan pada kisaran suhu 25 sampai 45 o C, tetapi tumbuh optimal pada suhu 37 sampai 41 o C. Biasanya bakteri tidak tumbuh pada ph > 8.0 dan ph < 4.5. Bakteri ini dapat diisolasi dari feses manusia, burung, dan binatang, selain itu juga ditemukan pada usus. Sebagian dari spesies bakteri ini ditambahkan dalam produk susu dan memiliki manfaat bagi kesehatan usus manusia (Ray dan Bhunia 2008). Beberapa jenis bakteri Bifidobacterium yang bersifat obligat anaerob diantaranya adalah Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, dan Bifidobacterium bifidum (Ballongue 2004). 6

21 2.3 METODE ANALISIS Metode analisis dapat dikelompokkan menjadi lima kategori yaitu: (1) metode standar, (2) metode resmi, (3) metode pustaka, (4) metode yang dikembangkan oleh laboratorium, dan (5) metode yang dikembangkan oleh organisasi professional (Sukarno 2005). Metode standar adalah metode yang dikembangkan oleh organisasi/badan standarisasi baik nasional maupun internasional. Metode ini dikerjakan oleh banyak ahli divalidasi oleh banyak laboratorium dan memiliki keakuratan tinggi. Contoh beberapa metode standar/baku/acuan antara lain: Standar Nasional Indonesia (SNI) yang dikembangkan oleh BSN, Bacteriological Analytical Manual (BAM) yang dikembangkan oleh US Food and Drug Administration, dan ISO yang dikembangkan oleh International Organization for Standarization. Metode resmi adalah metode yang dipersyaratkan oleh undang-undang atau peraturan untuk digunakan oleh pemerintah atau organisasi/lembaga/ industri yang diatur oleh pemerintah. Metode yang dikembangkan oleh laboratorium adalah metode yang dirancang, diujicoba, dan divalidasi secara luas oleh suatu laboratorium sehingga metode tersebut dapat dipercaya dan memberikan hasil yang akurat. Laboratorium yang menggunakan metode baku acuan tidak perlu melakukan validasi primer (full validation) terhadap metode tersebut, tetapi cukup melakukan validasi sekunder (verifikasi). Validasi sekunder diperlukan dalam laboratorium yang hanya memverifikasi suatu metode agar dapat diterapkan untuk aplikasi analitik yang diinginkan (Sac-Singlas 2002). Metode analisis dibedakan menjadi dua yaitu metode kualitatif dan metode kuantitatif. Metode kualitatif yaitu metode analisis yang responnya berupa ada atau tidaknya yang dideteksi baik secara langsung atau tidak langsung terhadap sejumlah sampel. Metode kuantitatif yaitu metode analisis yang responnya berupa jumlah analit, baik yang diukur secara langsung (misalnya : enumerasi jumlah mikroba) maupun secara tidak langsung (misalnya : nilai absorbans, intensitas warna ) terhadap sejumlah sampel (Feldsine et al. 2002). Beberapa contoh metode analisis mikrobiologi secara kualitatif antara lain: (1) uji langsung terhadap mikroba indikator, (2) metode alternatif ( Dye reduction, Electrical methods, ATP determination), (3) metode cepat deteksi mikroba spesifik dan toksinnya (metode imunokimia, metode biologi molekuler). Beberapa contoh metode analisis kuantitatif antara lain : (1) Angka Lempeng Total (Total Plate Count), (2) MPN (Most Probable Number), (3) uji potensi antibiotik, (4) uji sterilitas, (5) Uji koefisien fenol (uji disinfektan dan antiseptik), dan (6) uji efektifitas pengawet. 2.4 METODE ANALISIS BAKTERI ASAM LAKTAT Untuk menganalisis adanya bakteri asam laktat, SNI telah mengeluarkan metode analisis yaitu SNI tentang pengujian kultur starter pada yogurt. Prinsip dari metode ini adalah pertumbuhan bakteri fakultatif anaerob setelah contoh diinkubasikan dalam pembenihan yang sesuai selama tiga hari pada suhu 35 C dengan media MRSA dengan kondisi aerob. Dalam metode SNI disebutkan pula jika memungkinkan inkubasi dilakukan dalam suatu jar anaerob yang diperkaya gas CO 2. Metode yang kedua yaitu ISO (E) tentang penghitungan jumlah bakteri kultur starter pada yogurt. Prinsip dari metode ini yaitu pertumbuhan Lactobacillus bulgaricus setelah diinkubasikan selama tiga hari pada suhu 37 o C dengan media MRSA pada kondisi anaerob dan pertumbuhan bakteri Streptococcus thermophilus pada kondisi aerob setelah diinkubasikan selama dua hari pada suhu 37 o C dengan media M17. 7

22 Media MRSA merupakan media selektif yang dikembangkan oleh de Man, Rogosa, dan Sharpe. Media ini sangat cocok digunakan untuk pertumbuhan bakteri asam laktat termasuk Lactobacillus, Pediococcus, dan Leuconoctoc (De Man 1960). Komposisi dari media MRSA yaitu pepton dari kasein, ekstrak daging, ekstrak yeast, D(+)-glukosa, dipotasium hidrogen fosfat, tween 80, diamonium hidrogen sitrat, sodium asetat, magnesium sulfat, mangan sulfat, dan agar. Pada ph rendah, amonium sitrat berfungsi untuk menghambat pertumbuhan sebagian besar mikroorganisme, namun memungkinkan pertumbuhan Lactobacillus. Dipotasium posfat dan sodium asetat adalah agen buffer yang mempertahankan ph rendah. Tween 80 merupakan emulsifier. Mangan dan magnesium sulfat adalah sumber ion dan sulfat. Pepton bakteriologis dan ekstrak daging sapi menyediakan nitrogen, vitamin, mineral, dan asam amino esensial untuk pertumbuhan. Ekstrak yeast merupakan sumber vitamin khususnya B kompleks. Meskipun media MRSA merupakan media selektif bagi bakteri asam laktat, tetapi ada sebagian kecil bakteri lain yang dapat tumbuh pada media tersebut seperti Escherichia coli (Tabel 5). Tabel 5. Karakteristik kultur yang dapat tumbuh pada media MRSA Organisme (ATCC) Pertumbuhan Lactobacillus acidophilus (4356) ++ Lactobacillus fermentum (9338) ++ Bifidobacterium bifidum (11863) ++ (anaerob) Escherichia coli (25922) -/+ Pseudomonas aeruginosa (27853) -/+ Dalam penelitian ini kondisi inkubasi bakteri dibuat secara anaerob dengan menggunakan jar anaxomat. Menurut penelitian Shahin et al (2002) bakteri yang bersifat anaerob memiliki pertumbuhan yang lebih optimum jika diinkubasi dalam jar anaxomat dari pada dengan jar anaerob konvensional. Bakteri dapat memiliki ukuran koloni yang lebih besar bila diinkubasi dalam suatu jar anaxomat. Jar anaxomat merupakan suatu jar yang dapat dikondisikan dengan kondisi mikroaerofilik maupun anaerob dengan komposisi gas yang dapat diatur. Untuk mengisolasi bakteri asam laktat dari sampel biasanya digunakan media MRSA yang ditambahkan CaCO 3. Isolasi bakteri asam laktat pada media MRSA yang mengandung CaCO 3 sangat mudah karena ditandai dengan adanya zona terang di sekeliling koloninya. Adanya zona terang merupakan akibat diproduksinya asam yang menetralkan CaCO 3 yang terdapat pada media selama pertumbuhan bakteri asam laktat tersebut (Widyastuti dan Sofarianawati 1999). Bakteri yang menunjukkan zona bening yang luas berarti memiliki efektifitas yang tinggi. Penelitian ini menggunakan bakteri jenis Lactobacillus sehingga digunakan media MRSA dengan mengacu pada metode ISO (E) (kondisi anaerob) dan SNI (kondisi aerob). 2.5 VALIDASI DAN VERIFIKASI METODE Menurut ISO/IEC , validasi adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus terpenuhi. Validasi metode analisis bertujuan untuk memastikan dan mengkonfirmasi bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai untuk peruntukannya. Laboratorium harus memvalidasi metode analisis jika, (1) metode tidak baku, (2) metode yang didesain/dikembangkan laboratorium, (3) metode baku yang digunakan di 8

23 luar lingkup yang dimaksudkan, dan (4) modifikasi dari metode baku, untuk mengkonfirmasi bahwa metode itu sesuai untuk penggunaan yang dimaksudkan. Validasi harus seluas yang diperlukan untuk memenuhi kebutuhan penerapan yang ditetapkan atau bidang penerapan. Laboratorium harus merekam hasil yang diperoleh, prosedur yang digunakan untuk validasi, dan pernyataan bahwa metode tersebut tepat untuk penggunaan yang dimaksud. Verifikasi adalah proses konfirmasi kembali untuk menunjukkan metode sesuai dalam memenuhi kebutuhan laboratorium. Verifikasi diperlukan karena adanya perbedaan kondisi antara saat metode tersebut dibuat dengan metode tersebut diadopsi oleh suatu laboratorium. Tujuan verifikasi adalah untuk memastikan bahwa laboratorium atau personel penguji dapat menerapkan metode tersebut dengan baik ( ketersediaan peralatan, fasilitas pereaksi, penguji, keterampilan, dan kompetensi). Verifikasi juga bertujuan untuk menjamin mutu hasil pengujian. Menurut USP (2007) dalam Ismail (2009), dalam melakukan verifikasi terdapat beberapa parameter yang harus diukur, yaitu untuk pengujian kualitatif yang harus diukur adalah spesisfitas, sedangkan untuk pengujian kuntitatif yang harus diuji adalah akurasi dan presisi, seperti pada Tabel 6. Tabel 6. Parameter verifikasi untuk uji mikrobiologi Parameter Uji kualitatif Uji kuantitatif Akurasi Tidak Ya Presisi Tidak Ya Spesifisitas Ya Tidak Limit deteksi Tidak Tidak Limit kuantifikasi Tidak Tidak Linieritas Tidak Tidak Kiasaran hitung Tidak Tidak Ketahanan Tidak Tidak Repitabilitas Tidak Tidak Kekasaran Tidak Tidak Sumber : USP (2007) dalam Ismail (2009) Dalam ISO disebutkan beberapa karakteristik kinerja yang harus diperhatikan dalam melakukan validasi metode kuantitatif yaitu akurasi, presisi, penetapan batas terendah dari kisaran hitung (limit deteksi), limit kuantifikasi, dan linieritas. Akurasi adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur suatu nilai yang aktual atau sebenarnya dari suatu analit, misalnya mikroba target. Apabila suatu analit (mikroba target) secara alami berada di dalam sampel atau di-spike ke dalam sampel sebagai bagian dari suatu tantangan atau uji profisiensi, metode tersebut harus mampu mendeteksi atau memunculkan kembali analit atau mikroorganisme tersebut dalam konsentrasi yang benar atau frekuensinya mendekati akurat. Akurasi biasanya dinyatakan sebagai persen recovery (Sac-Singlas 2002). Presisi adalah tingkat kesamaan antara hasil uji individual ketika metode tersebut diterapkan secara berulang sampai dengan penggandaan sampling dari suatu sampel yang homogen. Presisi dari suatu metode biasanya ditunjukkan dengan simpangan baku relatif (relative standard deviation) dari suatu seri pengukuran. Presisi dapat diukur dari tingkat repitabilitas atau tingkat reproduksibilitas dari metode analisis yang dilakukan pada kondisi normal. Repitabilitas adalah mengukur variasi dalam hasil uji independen yang diperoleh dengan metode yang sama terhadap sampel uji yang identik dalam laboratorium yang sama oleh analis yang sama dengan menggunakan peralatan yang sama dalam interval waktu singkat. Reproduktivitas adalah mengukur variasi dalam hasil uji independen yang 9

24 diperoleh dengan metode yang sama terhadap sampel uji yang identik dalam laboratorium yang berbeda dan peralatan yang berbeda atau dengan analis dan peralatan berbeda di dalam laboratorium yang sama. Untuk analisis dalam matriks biologis, presisi harus diukur pada minimum 5 kali pengukuran per konsentrasi (Sac-Singlas 2002). Menurut ISO batas terendah dari kisaran hitung (limit deteksi) adalah konsentrasi terendah dari mikroorganisme dalam contoh yang dapat terdeteksi, tetapi tidak terhitung sebagai nilai sebenarnya, di bawah kondisi pengujian yang disepakati. Limit kuantifikasi adalah konsentrasi terendah dari mikroorganisme yang dapat ditentukan dengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima di bawah kondisi pengujian yang disepakati. Linieritas adalah kemampuan metode analisis yang menunjukkan bahwa larutan sampel yang berada dalam rentang konsentrasi memiliki respon analit yang proporsional dengan konsentrasi secara langsung atau melalui transformasi matematika. Linieritas biasanya dinyatakan dalam istilah variansi sekitar arah garis regresi yang dihitung berdasarkan persamaan matematik data yang diperoleh dari hasil uji analit dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit. Perlakuan matematik dalam pengujian linieritas adalah melalui persamaan garis lurus dengan metode kuadrat terkecil antara hasil analisis terhadap konsentrasi analit. Dalam beberapa kasus. untuk memperoleh hubungan proporsional antara hasil pengukuran dengan konsentrasi analit, data yang diperoleh diolah melalui transformasi matematik dulu sebelum dibuat analisis regresinya (Harmita 2004). Ketangguhan metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, dan hari yang berbeda. Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji. Ketangguhan metode merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal antara laboratorium dan antar analis (Harmita 2004). Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi yang kecil dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan akurasi. 10

25 III. METODOLOGI PENELITIAN 3.1 WAKTU DAN TEMPAT Penelitian ini merupakan bagian dari kegiatan LDITP (Laboratorium Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan). Salah satu syarat sebagai laboratorium terakreditasi ialah implemetasi metode uji yang sudah divalidasi sesuai dengan ketentuan pada ISO/IEC 17025:2005 butir 5.4. Penelitian dilaksanakan dari bulan Februari hingga September Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan. IPB. 3.2 BAHAN DAN PERALATAN Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah susu sterilisasi UHT, susu bubuk, dan susu fermentasi komersil. Mikroba yang digunakan dalam validasi ini yaitu Lactobacillus bulgaricus FNCC 004P (koleksi Universitas Gadjah Mada). Media yang digunakan untuk pengujian adalah De Man Rogosa and Sharpe (MRS) agar (OXOID) dan MRSB. Larutan pengencer yang digunakan adalah Butterfields Phosphate-Buffered Dilution Water (BPB). Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan petri, pipet ukur 1 ml, 5 ml, dan 10 ml, pipet mikro, erlenmeyer, tabung reaksi, bunsen, vortex, inkubator 37±1 o C, otoklaf, oven/alat sterilisasi kering, dan jar anaxomat MARK II (MART Microbiology BV). 3.3 METODE PENELITIAN Pada penelitian ini akan dilakukan validasi metode alternatif terhadap metode baku. Metode alternatif yang digunakan yaitu metode SNI bagian pengujian bakteri kultur strarter yogurt. sedangkan metode baku yang diacu adalah metode ISO (E) tentang penghitungan jumlah kultur starter pada yogurt Metode alternatif (SNI ) Prinsip dari metode ini adalah pertumbuhan bakteri fakultatif anaerob setelah contoh diinkubasikan dalam pembenihan yang sesuai selama 3 hari pada suhu 35 C dengan media MRSA. Sebanyak 1 ml dari tiga tingkat pengenceran dimasukkan ke dalam cawan petri steril, sebanyak 12 ml sampai dengan 15 ml media MRSA yang masih cair dengan suhu (45 ± 1) C dituangkan ke dalam masing-masing cawan petri, kemudian semua cawan petri diinkunbasi dengan posisi terbalik ke dalam inkubator pada suhu 35 C selama 3 hari. Pertumbuhan koloni pada setiap cawan petri yang mengandung 25 koloni sampai dengan 250 koloni setelah 3 hari. Dalam metode ini untuk inkubasi dilakukan secara aerob.

26 3.3.2 Metode acuan (ISO 7889:2003(E)) Pada metode ini terdapat dua prinsip pengujian jumlah bakteri kultur starter yogurt yaitu untuk Lactobacillus bulgaricus inkubasi dilakukan secara anaerob dengan media MRSA dan Streptococcus thermophilus secara aerob dengan media M17. Pada penelitian ini hanya dilakukan validasi bakteri genus Lactobacillus sehingga pengujian akan dilakukan secara anaerob dengan media MRSA. Sebanyak 1 ml dari tiga tingkat pengenceran tertinggi dimasukkan ke dalam cawan petri steril. Sebanyak 12 ml sampai dengan 15 ml media MRSA yang masih cair dengan suhu (45 ± 1) C dituangkan ke dalam masing-masing cawan petri, kemudian semua cawan petri dimasukkan ke dalam suatu jar anaxomat dengan posisi terbalik. Jar anaerob yang telah diperkaya dengan gas CO 2 kemudian diinkubasi ke dalam inkubator pada suhu 37 ± 1 C selama 3 hari. Selanjutnya dilakukan pencatatan pertumbuhan koloni pada setiap cawan petri yang mengandung 15 koloni sampai dengan 300 koloni setelah 3 hari. 3.4 PROSEDUR VALIDASI METODE Persiapan kultur uji (konfirmasi kemurnian kultur uji) Kemurnian kultur stok acuan merupakan faktor penting yang harus diperhatikan dalam melakukan validasi metode analisis. Untuk memastikan kemurnian kultur stok acuan diperlukan konfirmasi. Dalam penelitian ini kultur murni yang digunakan adalah Lactobacillus bulgaricus FNCC 004P. Kultur stok yang digunakan perlu diperbaharui agar aktivitasnya tidak berkurang. Kultur stok dalam media MRSB yang yang disimpan terlalu lama dapat berkurang aktivitasnya karena habisnya substrat dan menumpuknya metabolit seperti asam. Pemeliharaan kultur stok pada penelitian ini dilakukan dengan melakukan penusukan kultur pada media MRS agar semi solid, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Setelah itu kultur yang telah diinkubasi tersebut dapat disimpan dalam lemari pendingin sebagai kultur stok dan dapat bertahan selama beberapa bulan. Kultur yang akan digunakan terlebih dahulu harus disegarkan dalam media selektif. Sebanyak 1 ose dari kultur stok disegarkan ke dalam 10 ml MRSB, kemudian diinkubasi selama 18 sampai 24 jam pada suhu 37 o C. Kultur ini selanjutnya dikonfirmasi dengan pewarnaan Gram. Dengan pewarnaan Gram ini akan dipastikan bahwa bakteri merupakan bakteri Gram positif dan berbentuk batang Penghitungan jumlah bakteri asam laktat pada kultur uji Penelitian ini diawali dengan penghitungan jumlah spike. Spike adalah inokulum sebagai kontrol positif yang telah diketahui dengan pasti jumlah koloni/ml. Spike dibuat dengan menggunakan biakan standar yang diremajakan dan ditumbuhkan dalam media MRS broth dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Pembuatan spike ini merupakan tahapan yang menentukan tingkat pengenceran yang akan digunakan dalam tahap validasi. Kultur yang telah ditumbuhkan dalam media selama MRSB selanjutnya dihitung jumlahnya. 12

27 Kultur dalam MRSB yang sudah diinkubasi selama 24 jam selama 37 o C kemudian diencerkan sampai Selanjutnya dilakukan pemupukan pada tiga tingkat pengenceran tertinggi dengan media MRSA dengan kondisi aerob dan anaerob kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 3 hari. Hasil yang diperoleh dalam tahap ini akan menentukan tingkat pengenceran yang akan digunakan dalam tahap validasi Persiapan sampel dan inokulasi kultur Tahap persiapan sampel dimulai dengan memasukkan sebanyak 50 ml contoh susu ke dalam erlenmeyer 100 ml steril dengan tutup aluminium. Selanjutnya dilakukan inokulasi kultur sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 0, 10 2, 10 4, 10 6, dan 10 8 cfu/ml dan diaduk hingga homogen. Masing-masing sampel selanjutnya diencerkan sehingga diperoleh cawan yang memenuhi ketentuan untuk dihitung. Pemupukan dilakukan pada tiga tingkat pengenceran tertinggi dan masing-masing dilakukan duplo. Berdasarkan hasil perhitungan selanjutnya dapat ditentukan presisi, linieritas, dan relatif akurasi. Persiapan ml Inokulasi inokulum (0, 10 2, 10 4, 10 6, 10 8 cfu/ml) Pemupukan pada 3 tingkat pengenceran tertinggi (duplo) Inkubasi aerob 35 ± 1 o C, 3 hari Inkubasi anaerob 37 ± 1 o C, 3 hari Hitung koloni Aturan BAM /SNI : koloni/cawan Aturan ISO : koloni/cawan Gambar 1. Diagram alir penelitian penetuan linieritas, akurasi, dan presisi 13

28 Persiapan 50 ml Inokulasi inokulum (3, 30, 60 cfu/ml) Pemupukan (duplo) Inkubasi aerob 35 ± 1 o C, 3 hari Inkubasi anaerob 37 ± 1 o C, 3 hari Hitung koloni Aturan BAM /SNI : koloni/cawan Aturan ISO : koloni/cawan Gambar 2. Diagram alir penentuan limit deteksi dan limit kuantifikasi Penerapan metode uji tervalidasi untuk analisis bakteri asam laktat Kedua metode yang telah divalidasi selanjutnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri asam laktat dalam beberapa sampel susu. Jenis susu yang digunakan dalam verifikasi ini yaitu susu bubuk, susu cair steril, susu pasteurisasi, dan susu fermentasi. Analisis untuk sampel padat dan semipadat yaitu contoh diaduk secara merata dengan menggunakan sendok steril atau alat lain sebelum pengambilan contoh uji. Sebanyak 10 gram contoh secara aseptis dan masukkan ke dalam erlenmeyer yang telah berisi 90 ml larutan pengencer sehingga diperoleh pengenceran 1 :10. Homogenkan dengan stomacher selama ± 2 menit. Ini merupakan larutan dengan pengenceran Kemudian dibuat dengan pengenceran dan seterusnya sesuai kebutuhan dengan menggunakan larutan pengencer BPB. Untuk sampel cair, contoh diaduk secara merata dengan menggunakan sendok steril atau alat lain sebelum pengambilan contoh uji. Contoh yang diuji dimulai dari pengenceran 10 0 (contoh tanpa pengenceran). Pengenceran dilakukan dengan mengambil 10 ml contoh dan diencerkan dengan 90 ml larutan pengencer BPB. Kemudian dibuat seri pengenceran 10-2, 10-3 dan seterusnya sesuai kebutuhan dengan menggunakan larutan pengencer BPB. Dari persiapan contoh, pipet 1 ml dari masing-masing pengenceran sesuai kebutuhan ke dalam cawan steril secara duplo. Tuangkan MRSA sebanyak 15 sampai 20 ml ke dalam cawan dan goyangkan cawan petri sedemikian sehingga campuran tersebar secara merata, biarkan sampai media memadat. Inkubasikan pada suhu 35 o C selama 3 hari pada posisi terbalik. 14

29 3.5 PENGOLAHAN DATA Penghitungan jumlah koloni Cawan yang masuk ke dalam perhitungan adalah cawan petri dengan jumlah koloni koloni (SNI) dan koloni (ISO) : Rumus penghitungan jumlah koloni adalah sebagai berikut : N = C/ [(1 n 1 ) + (0.1 n 2 )] d Keterangan : N = jumlah koloni per ml atau per gram C = jumlah koloni dari tiap-tiap cawan n 1 = jumlah cawan petri dari pengenceran koloni yang bisa dihitung n 2 = jumlah cawan petri dari pengenceran kedua d = pengenceran pertama yang dihitung Presisi Presisi dapat ditentukan berdasarkan penghitungan standar deviasi relatif (RSD). Menurut Sac-Singlas (2002), standar deviasi relatif dihitung dengan rumus : RSD = (( )/ )² Keterangan : a 1 = cawan 1 b 1 = cawan 2 (log a 1 - log b 1 )/x 1 = perbedaan relatif antara hasil logaritma duplo i = 1, 2, 3,... n p = jumlah penentuan duplo (jumlah sampel uji) Nilai RSD yang lebih dari 10% menandakan bahwa metode mengalami kesulitan tertentu (Sac-Singlas 2002) Relatif akurasi Akurasi diukur dengan persen perolehan kembali melalui uji komparatif. Persentasi perolehan kembali adalah banyaknya inokulum yang dapat diisolasi kembali dari sejumlah inokulum yang dimasukkan ke dalam sampel. Persen perolehan kembali dihitung dengan rumus berikut : % recovery (R) = [(A-B)/C] x 100 Keterangan : A = sampel dengan inokulum (sampel positif) B = sampel tanpa inokulum (sampel negatif) C = inokulum tanpa sampel (kontrol positif) 15

30 3.5.4 Linieritas Linieritas dari kedua metode dinyatakan dalam bentuk persamaan garis linier y = a + bx. Peubah a menyatakan intersep dan b adalah kemiringan garis. Linearitas metode dilihat dari nilai koefisien determinasi (R 2 ) yang diperoleh. Nilai R 2 yang mendekati 1 menyatakan linieritas yang tinggi Limit deteksi dan limit kuantifikasi Persamaan linier yang diperoleh pada uji linieritas selanjutnya digunakan untuk menghitung limit deteksi dan limit kuantifikasi. Limit deteksi dan limit kuantifikasi dihitung dari rerata kemiringan garis dan simpangan baku intersep kurva standar yang diperoleh dengan rumus berikut : LOD = 3.3 Sa b LOQ = 10 Sa b dengan, Sa = simpangan baku intersep b = rata-rata kemiringan garis 16

31 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 KULTUR UJI Kemurnian kultur Kemurnian kultur uji merupakan faktor penting yang harus diperhatikan dalam melakukan validasi metode analisis karena dapat mempengaruhi hasil uji. Kultur uji yang akan digunakan dalam validasi harus diperiksa kemurniaannya dengan menggunakan media selektif dan pengamatan mikroskopik dengan pewarnaan Gram (Sac-Singlas 2002). Hasil konfirmasi kemurnian kultur dengan media selektif (MRSA) ditunjukkan dengan bentuk koloni yang seragam seperti yang terlihat pada Gambar 3. Koloni bakteri asam laktat yang tumbuh di permukaan media berbentuk bulat, berwarna putih, dan memiliki permukaan yang cembung. Beberapa koloni bakteri ada yang tumbuh di bagian tengah media dengan bentuk pipih seperti wijen dan ada sebagian kecil yang berada di dasar media. Gambar 3. Koloni Lactobacillus bulgaricus pada media MRSA setelah inkubasi 3 hari pada suhu 37 o C Kultur uji yang digunakan pada penelitian ini adalah Lactobacillus bulgaricus yang merupakan bakteri Gram positif yang berbentuk batang. Dalam penelitian ini selain dilakukan konfirmasi kemurnian kultur dengan media selektif, dilakukan pula konfirmasi secara sederhana dengan pewarnaan Gram. Pada Gambar 4 terlihat bahwa hasil pewarnaan Gram menunjukkan bakteri berwarna ungu dan berbentuk batang. Bakteri Gram positif merupakan bakteri yang mampu mempertahankan warna ungu kristal sehingga ketika dilakukan pewarnaan Gram akan terlihat berwarna ungu. Gambar 4. Hasil pewarnaan Gram bakteri Lactobacillus bulgaricus dengan perbesaran 1000 kali

32 4.1.2 Jumlah bakteri asam laktat pada kultur uji Tabel 7. Jumlah awal kultur uji pada MRSB setelah inkubasi 24 jam pada suhu 37 o C, dihitung pada media MRSA yang diinkubasi secara aerob dan anaerob Ulangan Aerob Jumlah BAL (cfu/ml) Anaerob Rata-rata RSD 0.53% 0.40% Berdasarkan hasil pembuatan spike diketahui bahwa jumlah awal koloni bakteri Lactobacillus bulgaricus sebanyak untuk inkubasi secara aerob dan cfu/ml untuk inkubasi secara anaerob (Tabel 7). Jumlah koloni bakteri spike ini sukar dijaga konstan meskipun telah ditumbuhkan dengan kondisi yang sama. Akan tetapi setelah dilakukan lima kali ulangan diperoleh jumlah koloni bakteri yang berkisar pada angka 10 9 cfu/ml. Hasil yang didapat ini masih lebih tinggi dibandingkan dengan yang hasil penelitian dari Saccaro et al. (2011) yang hanya memperoleh 4.0 x 10 7 cfu/ml dengan media yang sama. Berdasarkan hasil penghitungan jumlah kultur awal diketahui bahwa untuk inkubasi aerob memiliki RSD hitung sebesar 0.53% dan untuk inkubasi anerob memiliki RSD hitung sebesar 0.40%. Jika RSD hitung lebih kecil dari 10%, maka metode tidak mengalami kesulitan-kesulitan yang artinya metode tersebut dapat diterima (Sac-Singlas 2002). Penghitungan jumlah koloni awal dapat dilihat pada Lampiran PARAMETER UJI TERVALIDASI Validasi adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus terpenuhi. Pada penelitian ini dilakukan validasi dua metode pengujian bakteri asam laktat, yaitu metode ISO (E) dan SNI Kedua metode ini merupakan metode pengujian kultur strater pada yogurt. Metode ISO 7889:2003(E) menyebutkan bahwa pengujian bakteri kultur starter yogurt dilakukan dengan media MRSA, suhu inkubasi 37 o C, dan kondisi anaerob yaitu tanpa adanya oksigen. Untuk metode SNI media yang digunakan adalah MRSA, suhu inkubasi 35 o C, dan kondisi aerob. Penelitian ini dilakukan dua perlakuan yang berbeda yaitu kondisi inkubasi secara anaerob (ISO) dan kondisi inkubasi aerob (SNI). Kondisi inkubasi secara anaerob dilakukan dengan menggunakan jar anaxomat dengan komposisi CO 2 sebesar 10%. Suhu inkubator yang digunakan untuk inkubasi dalam penelitian ini berkisar pada 35 o C sampai 37 o C dengan suhu aktual 36 o C. Kedua metode selanjutnya dikonfirmasi dengan beberapa parameter validasi. Beberapa parameter yang ditentukan dalam penelitian ini adalah akurasi, presisi, linieritas, limit deteksi, dan limit kuantifikasi. 18

33 4.2.1 Akurasi Akurasi adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur suatu nilai yang aktual atau sebenarnya dari suatu analit, misalnya mikroba target (Sac-Singlas 2002). Akurasi biasanya dinyatakan dengan perolehan kembali atau persen recovery dari analit yang ditambahkan (Harmita 2004). Persentasi perolehan kembali adalah banyaknya inokulum yang dapat diisolasi kembali dari sejumlah inokulum yang dimasukkan ke dalam sampel ² 10⁴ 10⁶ 10⁸ JInokulum (cfu/ml) SNI (aerob) ISO (anaerob) Gambar 5. Jumlah koloni bakteri asam laktat yang diperoleh pada tiap tingkatan inokulum dengan perhitungan mengacu pada metode SNI ( koloni/cawan), n = 5 Hasil perolehan jumlah koloni pada tiap tingkatan inokulum dapat dilihat pada Gambar 5. Dari empat tingkatan inokulum, tiga diantaranya menunjukkan bahwa inkubasi secara anaerob memiliki jumlah perolehan kembali yang lebih tinggi. Perolehan kembali yang tinggi ini menunjukkan bahwa bakteri lebih optimal pertumbuhannya pada kondisi anaerob. Hasil ini didukung dengan penelitian yang dilakukan oleh Mirlohi et al. (2008) yang menyatakan bahwa inkubasi secara anaerob menunjukkan hasil yang lebih tinggi dibandingkan dengan inkubasi secara aerob ² 10⁴ 10⁶ 10⁸ JuInokulum (cfu/ml) SNI (aerob) ISO (anaerob) Gambar 6. Jumlah koloni bakteri asam laktat yang diperoleh pada tiap tingkatan inokulum dengan perhitungan mengacu pada metode ISO ( koloni/cawan), n = 5 19

34 Perhitungan jumlah bakteri mengikuti aturan ISO diperoleh hasil yang tidak berbeda (Gambar 6) dengan penghitungan mengikuti aturan SNI. Pada Gambar 6 terlihat bahwa tiga dari empat tingkat inokulum yang dimasukkan dalam sampel juga menunjukkan bahwa cawan yang diinkubasi secara anaerob memiliki hasil yang lebih tinggi dibandingkan dengan yang diinkubasi secara aerob. Hasil perhitungan persen recovery dari masing-masing tingkatan inokulum dapat dilihat pada Tabel 8 dan 9. Berdasarkan hasil perhitungan diketahui rata-rata nilai recovery tiap inokulum dari kedua metode berkisar antara 97 sampai 101%. Menurut AOAC (2002) nilai perolehan kembali ini masih berada pada kisaran yang ditetapkan yaitu %, sehingga dapat dikatakan bahwa metode ini mempunyai ketepatan yang baik. Dengan demikian kedua metode, ISO maupun SNI dapat diadopsi untuk keperluan analisis. Tabel 8. Rata-rata persen perolehan kembali (n = 5) dengan perhitungan koloni mengacu pada metode SNI ( koloni/cawan), pada kondisi aerob dan anaerob Aerob Anaerob No Inokulum (log cfu/ml) Perolehan kembali (%) Inokulum (log cfu/ml) Perolehan kembali (%) Tabel 9. Rata-rata persen perolehan kembali (n = 5) dengan perhitungan koloni mengacu pada metode ISO ( koloni/cawan), pada kondisi aerob dan anaerob Aerob Anaerob No Inokulum (log cfu/ml) Perolehan kembali (%) Inokulum (log cfu/ml) Perolehan kembali (%) Nilai hasil perolehan kembali yang tinggi ditunjang oleh beberapa faktor diantaranya, kondisi pertumbuhan yang optimum dan nutrisi media yang sesuai. Menurut penelitian Cheriguene et al. (2007) media MRSA merupakan media yang baik untuk menumbuhkan bakteri Lactobacillus bulgaricus. Media MRSA memiliki komposisi pepton bakteriologis dan ekstrak daging sapi yang menyediakan nitrogen, vitamin, mineral, dan asam amino esensial untuk pertumbuhan bakteri. Dengan hasil recovery yang diperoleh menunjukkan bahwa media MRSA merupakan media selektif yang cocok untuk pertumbuhan bakteri asam laktat, khususnya Lactobacillus. 20

35 4.2.2 Presisi Karakteristik kinerja metode yang ditentukan selanjutnya adalah presisi. Presisi adalah tingkat kesamaan antara hasil uji individual ketika metode tersebut diterapkan secara berulang sampai dengan penggandaan sampling dari suatu sampel yang homogen. Presisi dari suatu metode biasanya ditunjukkan dengan relative standard deviation (RSD) dari suatu seri pengukuran (Sac-Singlas 2002) RJumlah ² 10⁴ 10⁶ 10⁸ inokulum (cfu/ml) SNI (aerob) ISO (anaerob) Gambar 7. Presisi metode, dinyatakan sebagai nilai relative standard deviation (RSD) pada tiap tingkatan inokulum dengan perhitungan mengacu pada metode SNI ( koloni/cawan), n = 5 Gambar 7 menunjukkan nilai RSD pada tiap tingkatan inokulum dengan perhitungan mengacu pada metode SNI ( koloni/cawan). Sebagaimana yang dapat dilihat pada Gambar 7 diketahui bahwa nilai RSD kedua metode, baik yang diinkubasi dengan kondisi aerob maupun anaerob kurang dari 2.50%. Dari keempat tingkatan inokulum yang dianalisis terlihat tiga di antaranya memiliki nilai RSD yang lebih kecil untuk inkubasi yang dilakukan secara anaerob. Hal ini berarti pada inkubasi secara anaerob memiliki presisi yang lebih baik daripada ketika cawan diinkubasi secara aerob SNI (aerob) ISO (anaerob) RJumlah ² 10⁴ 10⁶ 10⁸ inokulum (cfu/ml) Gambar 8. Presisi metode, dinyatakan sebagai nilai relative standard deviation (RSD) pada tiap tingkatan inokulum dengan perhitungan mengacu pada metode ISO ( koloni/cawan), n = 5 21

36 Nilai RSD tiap tingkatan inokulum dengan perhitungan berdasarkan metode ISO terlihat pada Gambar 8. Nilai RSD dari masing-masing tingkatan tidak terlihat adanya kecenderungan lebih tinggi ataupun rendah. Cawan yang diinkubasi secara anaerob dihasilkan RSD yang cenderung lebih tinggi yaitu pada inokulum 10 2 cfu/ml. Hal ini disebabkan jumlah koloni yang masuk ke dalam kisaran perhitungan lebih tinggi yaitu 15 sampai 300 koloni, sehingga data menjadi lebih bervariasi. Selain dilakukan perhitungan RSD pada masing-masing tingkatan inokulum juga dilakukan perhitungan nilai RSD total untuk tiap metode. Berdasarkan hasil penghitungan RSD total untuk metode SNI (inkubasi aerob) diperoleh nilai RSD sebesar 1.58% (SNI) dan 1.88% (ISO). Untuk metode ISO (inkubasi anaerob) diperoleh RSD sebesar 1.39% (SNI) dan 1.97% (ISO). Menurut Sac-Singlas (2002) nilai RSD yang melebihi 0.1 atau 10% menunjukkan adanya masalah atau kesulitan tertentu atau dengan arti lain metode tersebut tidak dapat diterapkan. Dari hasil perhitungan RSD kedua metode diperoleh nilai jauh lebih kecil dibandingkan ketentuan maka metode ini masih memenuhi persyaratan. Presisi yang diperoleh pada penelitian ini adalah presisi yang diukur dari tingkat repitabilitas. Selain dapat diukur dari tingkat repitabilitas, presisi juga dapat diukur dari tingkat reproduksibilitas dari metode analisis yang dilakukan pada kondisi normal (Sac-Singlas 2002). Tingkat repitabilitas dinyatakan dalam RSD r dan tingkat reproduksibilitas dinyatakan dalam RSD R. Sebagaimana penelitian validasi metode penghitungan bakteri probiotik pada beberapa media MRSA yang dimodifikasi yang dilakukan oleh Leuschener et al. (2002) diperoleh nilai RSDr sebesar 1.2% sampai 3.4% dan RSD R sebesar 2.2% hingga 5.2%. Apabila dibandingkan dengan nilai RSD yang diperoleh pada penelitian ini masih berada pada kisaran hampir yang sama dengan penelitian tersebut Linieritas Linieritas adalah kemampuan metode analisis yang menunjukkan bahwa larutan sampel yang berada dalam rentang konsentrasi memiliki respon analit yang proporsional dengan konsentrasi, secara langsung atau melalui transformasi (Harmita 2004). Penetapan linieritas minimal dilakukan dengan lima level konsentrasi inkokulum (Chan 2004). Dari kelima konsentrasi inokulum yang ditambahkan dibuat kurva regresinya. Regresi linear yang diperoleh dinyatakan dalam persamaan y = bx + a. Selain itu juga akan diketahui nilai R 2 yang menjelaskan hubungan antara inokulum yang ditambahkan dengan hasil yang diperoleh. Tabel 10. Koefisien determinasi dan persamaan regresi linier (n = 5), dengan perhitungan mengacu pada metode SNI ( koloni/cawan) Ulangan Metode SNI (aerob) Metode ISO (anaerob) Persamaan regresi linier R 2 Persamaan regresi linier R 2 1 y = x y = x y = x y = x y = x y = x y = x y = x y = x y = x Rata-rata y = x y = x

37 Tabel 11. Koefisien determinasi dan persamaan regresi linier (n = 5), dengan perhitungan mengacu pada metode ISO ( koloni/cawan) Ulangan Metode SNI (aerob) Metode ISO (anaerob) Persamaan regresi linier R 2 Persamaan regresi linier R 2 1 y = x y = x y = x y = x y = x y = x y = x y = x y = x y = x Rata-rata y = x y = x Parameter linieritas dari kedua metode ditentukan dengan cara membuat kurva hubungan antara jumlah inokulum yang ditambahkan pada sumbu x dan hasil yang diperoleh pada sumbu y. Tabel 10 menyajikan persamaan linier dan koefisien determinasi (R 2 ) dari lima ulangan yang dilakukan, dengan penghitungan koloni mengikuti metode SNI ( koloni/cawan). Berdasarkan hasil pengujian, diperoleh regresi linier rata-rata metode aerob dan anaerob secara berturut-turut, y = x dan y = x Rata-rata nilai koefisien determinasi (R 2 ) dari metode aerob dan anerob secara berturut-turut yaitu sebesar dan Apabila dilihat dari nilai kedua nilai R 2 tersebut metode anaerob memiliki nilai yang sedikit lebih tinggi dibandingkan metode aerob. Sebagaimana yang disebutkan AOAC (2002), nilai R 2 dari kedua metode ini telah memenuhi syarat yang diterapkan yaitu Nilai R 2 yang mendekati 1 menyatakan hubungan linieritas yang tinggi y = x R² = y = x R² = SNI (aerob) ISO (anaerob) JInokulum (log cfu/ml) Gambar 9. Linieritas metode SNI dan metode ISO dengan penghitungan mengacu pada metode SNI ( koloni/ml), n = 5 23

38 y = x R² = y = x R² = SNI (aerob) ISO (anaerob) JInokulum (log cfu/ml) Gambar 10. Linieritas metode SNI dan metode ISO dengan penghitungan mengacu pada metode ISO ( koloni/ml), n = Limit deteksi dan limit kuantifikasi Limit deteksi adalah konsentrasi terendah dari mikroorganisme dalam contoh yang dapat terdeteksi, tetapi tidak terhitung sebagai nilai yang sebenarnya di bawah kondisi pengujian yang disepakati. Untuk menentukan limit deteksi dari metode ini dilakukan inokulasi dengan konsentrasi inokulum yang rendah yaitu 3, 30, dan 60 cfu/ml. Penentuan limit deteksi ini dilakukan sebanyak enam kali ulangan. Seperti yang terlihat pada Lampiran 10, pada konsentrasi terendah yaitu 3 cfu/ml masih terdeteksi adanya koloni bakteri yang tumbuh. Sementara untuk sampel yang berbentuk padat atau semipadat pada konsentrasi 30 cfu/gram masih dapat terdeteksi adanya koloni. Namun, hasil limit deteksi yang diperoleh pada penelitian ini masih lebih tinggi dibandingkan dengan limit deteksi yang diperoleh oleh Bottini et al. (2011) yang memperoleh limit deteksi untuk metode analisis E.coli yaitu sebesar 1 cfu/ml. Limit deteksi selain ditentukan dengan menambahkan inokulum dalam konsentrasi rendah pada sampel juga dapat ditentukan dari persamaan linier. Persamaan linier yang diperoleh pada uji linieritas selanjutnya digunakan untuk menghitung limit deteksi. Limit deteksi yang diperoleh dari hasil penghitungan dengan kurva linier sebesar 2 cfu/ml untuk sampel cair dan 20 cfu/gram untuk sampel padat atau semipadat. Selain limit deteksi, parameter yang harus ditentukan dalam sebuah validasi metode kuantifikasi adalah limit kuantifikasi (LOQ). Limit kuantifikasi adalah konsentrasi terendah dari mikroorganisme yang dapat ditentukan dengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima di bawah kondisi pengujian yang disepakati. Berdasarkan hasil perhitungan diperoleh nilai LOQ sebesar 5 cfu/ml untuk sampel cair dan 50 cfu/gram untuk sampel padat atau semipadat. Hal ini berarti konsentrasi bakteri asam laktat yang terhitung di bawah nilai ini memiliki nilai presisi dan akurasi yang kurang baik. Perhitungan nilai limit deteksi dan limit kuantifikasi seperti yang tertera pada Lampiran 8. 24

39 4.3 VERIFIKASI METODE PADA PRODUK SUSU Susu fermentasi (yogurt) Empat jenis susu fermentasi komersial yang digunakan untuk verifikasi metode ini adalah susu merek A, B, C, dan D. Bakteri asam laktat yang mendominasi untuk sampel susu merek A adalah Lactobacillus casei, merek B adalah Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, dan Bifidobacterium, sedangkan susu merek C dan D adalah Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus. Hasil verifikasi pada susu fermentasi dapat dilihat pada Tabel 12. Berdasarkan hasil terlihat bahwa secara keseluruhan pada inkubasi secara aerob diperoleh jumlah bakteri asam laktat yang lebih sedikit jika dibandingkan dengan inkubasi secara anaerob, kecuali pada susu merek C ulangan 1. Hal yang serupa juga terjadi pada penelitian Mirlohi et al. (2008) yaitu inkubasi secara aerob menurunkan jumlah total koloni bakteri Gram positif. Dari hasil ini dapat dikatakan bahwa bakteri lebih optimum pertumbuhannya pada kondisi tanpa oksigen. Untuk sampel merek B yang mengandung bakteri jenis Bifidobacterium jumlah koloni yang lebih tinggi pada inkubasi secara anaerob ini telah sesuai. Hal ini disebabkan bakteri Bifidobacterium merupakan bakteri obligat anaerob. Bakteri obligat anaerob yaitu bakteri yang hanya hidup dengan tanpa adanya oksigen (Ray and Bunia 2008). Susu merek A yang mengandung bakteri Lactobacillus casei juga terlihat memiliki jumlah koloni yang lebih tinggi dengan inkubasi secara anaerob. Lactobacillus casei termasuk golongan bakteri probiotik yaitu bakteri yang mampu bertahan hingga di usus manusia (Salminen et al. 2004). Bakteri probiotik biasanya lebih optimum apabila diinkubasi secara anaerob (Saccaro et al. 2011). Secara keseluruhan dari ketiga produk yogurt komersial yang diuji, semuanya memiliki total BAL yang lebih tinggi dibandingkan dengan jumlah minimal yang dipersyaratkan SNI yaitu sebesar 10 7 cfu/ml. Hanya sampel merek D yang berada di bawah syarat minimal tersebut. Hal ini diduga karena total BAL dalam produk D telah mengalami penurunan viabilitas selama penyimpanan akibat kondisi penyimpanan yang tidak sesuai. Sampel susu Tabel 12. Perbandingan jumlah bakteri asam laktat dalam susu fermentasi Ulangan Metode SNI (aerob) Metode ISO (anaerob) BAL (cfu/ml) RSD (%) BAL (cfu/ml) RSD (%) A* B* C* D 2 < < < 10 3 < 10 3 Keterangan : * = hasil uji t menyatakan sampel tidak berbeda nyata pada taraf signifikansi 5% 25

40 Uji t dilakukan terhadap logaritma jumlah koloni dari kedua metode untuk melihat apakah terdapat perbedaan yang nyata dengan taraf signifikansi 5%. Hasil uji t menunjukkan dari ketiga sampel susu fermentasi yang diuji tidak ada perbedaan yang nyata pada signifikansi 5%, meskipun apabila dilihat hasilnya secara langsung terdapat perbedaan. Ketiga sampel yang diuji umumnya mengandung bakteri genus Lactobacillus yang bersifat fakultatif anaerob. Bakteri fakultatif anaerob ini dapat hidup pada kondisi dengan atau tanpanya oksigen sehingga kemungkinan ini yang membuat tidak adanya perbedaan yang signifikan karena bekteri dapat tumbuh pada kondisi dengan atau tanpanya oksigen. Dalam verifikasi ada parameter yang harus ditentukan salah satunya adalah presisi. Dari hasil verifikasi pada sampel susu fermentasi ini diperoleh nilai RSD yang berkisar antara 0.19 hingga 0.66% (Tabel 12). Nilai RSD ini masih sangat lebih rendah dari batas yang ditentukan yaitu 10%. Oleh karena itu kedua metode memiliki ketepatan yang dapat diterima. Hal ini menunjukkan bahwa walaupun validasi dilakukan pada media MRSA dengan Lactobacillus bulgaricus sebagai mikroorganisme uji, tetapi metode dapat digunakan untuk menguji total BAL pada susu fermentasi Sampel Negatif Verifikasi metode dilakukan pada sampel negatif yaitu susu cair dan susu bubuk yang menurut SNI tidak dipersyaratkan adanya bakteri asam laktat. Jenis susu cair yang digunakan dalam verifikasi ini yaitu susu cair steril UHT dan susu pasteurisasi. No Tabel 13. Hasil verifikasi metode pada susu UHT dan pasteurisasi Jenis susu Mikroorganisme pada MRSA (cfu/ml) Aerob Anaerob Cawan 1 Cawan 2 Cawan 1 Cawan 2 1. Pasteurisasi Pasteurisasi UHT UHT UHT UHT UHT UHT Beberapa sampel susu cair digunakan dalam verifikasi kedua metode ini. Susu cair yang digunakan adalah susu cair komersial yang telah disterilisasi. Seperti yang dapat dilihat dalam Tabel 13 untuk inkubasi secara aerob pada beberapa cawan ditemukan 1 hingga 2 koloni sedangkan pada inkubasi secara anaerob tidak ditemukan adanya koloni. Padahal sesuai persyaratan SNI seharusnya susu UHT tidak mengandung bakteri. Koloni yang ditemukan pada sampel susu tersebut diduga merupakan false positif (bukan bakteri asam laktat). Hasil ini dikuatkan dengan hasil penelitian Mirlohi et al (2008) yang dilakukan untuk mengisolasi bakteri asam laktat pada beberapa sampel kotoran bayi dengan beberapa media dan dua kondisi inkubasi yang berbeda yaitu aerob dan anaerob. Ketika media VMRS (MRS dengan penambahan vancomycin) digunakan untuk media isolasi ditemukan beberapa false positif pada beberapa cawan yang diinkubasi secara aerob. 26

41 Gambar 11. Hasil pewarnaan Gram koloni bakteri terduga false positif Koloni yang tumbuh pada cawan yang diinkubasi secara aerob dikonfirmasi dengan pewarnaan Gram. Hasil pewarnaan Gram terlihat seperti pada Gambar 11. Hasil pengamatan di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali memperlihatkan jenis mikroorganisme yang diduga khamir karena ukurannya yang jauh lebih besar dari ukuran bakteri. Verifikasi juga dilakukan terhadap beberapa sampel susu bubuk, baik susu skim ataupun full cream. Hasil uji menunjukkan pada sampel susu merek Q dan S tidak ditemukan adanya bakteri asam laktat pada sampel. Akan tetapi terdapat kontaminasi kapang pada sampel uji yang diinkubasi dengan kondisi aerob (Tabel 14). Kontaminasi kapang ini kemungkinan berasal dari susu bubuk yang digunakan sebagai sampel uji. U Tabel 14. Hasil verifikasi metode pada susu bubuk Jenis susu Aerob Anaerob Cawan 1 Cawan 2 C awan 1 Cawan 2 1 Merek P 2* 5* Merek P Merek Q 0* 0* Merek Q Merek R Merek R 1* 3* Merek S 0* 0* Merek S 0* 0* 0 0 Keterangan : * = berkapang Susu bubuk merupakan susu yang dibuat dengan beberapa tahapan proses yaitu pengujian mutu, proses klarifikasi, pasteurisasi, evaporasi, homogenasi, pencampuran, pengeringan, dan pengemasan. Tahapan pasteurisasi pada proses pembuatan susu bubuk bertujuan membunuh semua sel vegetatif bakteri patogen, bakteri pembusuk, kapang, dan khamir sehingga dihasilkan produk yang aman secara mikrobiologi. Meskipun dalam pengolahannya terdapat tahapan pasteurisasi, tetapi susu bubuk masih rentan terhadap kontaminasi mikroba. Sebagaimana disebutkan dalam SNI masih ada batasan cemaran yang diizinkan dalam susu bubuk diantaranya ALT < 5 x 10 4 cfu/gram. Melihat dari standar SNI tersebut sangat memungkinkan sekali ketika terdapat kontaminasi kapang pada sampel uji, seperti terlihat pada Gambar

42 Gambar 12. Cawan yang terkontaminasi kapang Adanya kontaminasi kapang hanya ditemukan pada cawan yang diinkubasi secara aerob, karena kapang membutuhkan oksigen untuk pertumbuhannya. Hal ini yang menyebabkan cawan yang diinkubasi dengan kondisi anaerob tidak terdapat kapang. Kehadiran kapang pada media ini tentunya akan mengganggu penghitungan koloni bakteri asam laktat dan kapang akan menggunakan nutrien yang seharusnya digunakan oleh BAL. Berdasarkan hasil verifikasi metode secara keseluruhan metode ISO (inkubasi anaerob) memiliki hasil yang lebih baik dibandingkan dengan inkubasi secara aerob. Hal ini didukung dengan hasil yang menunjukkan inkubasi secara anaerob memberikan jumlah koloni yang lebih tinggi dibandingkan dengan inkubsi secara aerob. Mengingat saat ini produk susu fermentasi biasanya mengandung bakteri probiotik yang lebih optimum pertumbuhannya jika ditumbuhkan pada kondisi anaerob. Selain itu, beberapa kelemahan dari inkubasi secara aerob juga ditemukan diantaranya cawan sangat rentan dengan kontaminasi kapang, terutama untuk sampel yang telah mengandung kontaminasi kapang. Oleh karena itu untuk memperoleh hasil analisis yang lebih baik disarankan untuk menggunakan metode ISO (inkubasi anaerob) seperti yang juga disarankan oleh SNI. 28