III. MEKANISME PEMILAHAN DAN DISTRIBUSI

Transkripsi

1 III. MEKANISME PEMILAHAN DAN DISTRIBUSI Protein yang disintesis, dipilah dan dikinm ke berbagai lokasi yang tepat di dalam dan di luar sel dikenal sebsgai jalur pen-target-an protein. Elemen penting yang terkait dengan proses sistem tersebut adalah rangkaian asam amino pada ujung amino protein yang dinamakan rangkaian sinyal, kecuali protein yang digunakan untuk keperluan sitoplasma. 1. PROTEIN SINYAL PENGARAH Sinyal (signal) adalah segmen polisakarida yang terdiri atas rangkaian asam amino yang dapat mencapai panjang 70 buah terdapat di satu atau beberapa bagian molekul. Hampir semua protein yang ditargetkan untuk dikirim ke RE, mitokondria atau kloroplas termasuk sinyal N-terminal yang akan masuk dahulu ke dalam membran, kecuali N-terminal yang dilepas sesudah protein menerobos membran. Segmen sinyal berikutnya dapat menunjukkan apakah protein akan menyusup ke membran dan menentukan orientasi di dalam membran. Jika protein menyusup melewati membran, sinyal tambahan dapat mengarahkan rangkaian asam amino ke membran yang berdekatan yang mempunyai reseptor khusus untuk menentukan sortasi (pemilahan) dan pengarahan protein ke tujuan terakhir. Sinyal-sinyal yang mengarahkan ke berbagai organel dijelaskan sebagai berikut: a) Sinyal protein untuk RE, mitokondria dan kioroplas Sinyal N-terminal yang mengarahkan protein ke RE, mitokondria atau kloroplas terdiri atas asam amino polar dan nonpolar. Komposisi tersebut tampaknya lebih penting dalam proses penerobosan membran dibanding dengan keberadaan yang spesifik dan rangkaian asam amino. Kombinasi antara lipatan dan lengkungan yang membentuk struktur sekunder polipeptida, pola muatan dan polaritas rangkaian tersebut akan bertindak juga sebagai sinyal. Banyak asam amino yang dapat disusupkan pada posisi tertentu tanpa mengganggu sinyal. Protein yang dikirim ke membran-dalam dan ruang kompertemen mitokondria (matriks) dan kloroplas (stroma) mempunyai beberapa buah sinyal. Sinyal tersebut lebih bervariasi dalam bentuk dibanding dengan sinyal awal pengarah-membtran. b) Sinyal protein inti sel dan benda-benda mikro Protein yang ditargetkan ke dalarn inti sel mempunyai sinyal yang terletak pada bagian dalam rantai protein, sedangkan sinyal untuk benda-

2 benda mikro (microbodies) berada dekat ujung C-terminal (karboksilat terminal). Sinyal untuk protein inti sel lebih tergantung pula pada sifat kimia asam amino dibanding dengan pengaruh rangkaian asam aminonya. Sinyal untuk benda-benda mikro menggunakan rangkaian tiga residu asam amino yang merupakan substituen kecil yang selalu ditemukan dalam protein yang ditargetkan ke organel tersebut. c) Sinyal protein untuk lisosom Penelitian yang intensif tentang keberadaan sinyal pengarah protein ditemukan pada retikulum endoplasmik. Protein yang diarahkan ke lisosom mempunyai 2 buah sinyal yang masing-masing untuk menentukan bagian protein yang tetap menempel pada membran RE dan yang lain untuk mengarahkan protein enzimatik ke tujuan akhir di dalam lisosom. Saat ini telah ditemukan lebih dari 100 macam sinyal protein N-terminal sekreton pada berbagai macam sel eukariot. Rangkaian konsensus yang jelas seperti TATA box yang memandu proses inisiasi transkripsi, tidak ditemukan dalam sinyal pengarah protein. Rangkaian sinyal pengarah pada protein memberikan gambaran sebagai berikut: a) Panjang sinyal pengarah berkisar antara residu asam amino, b) Bagian amino-terminal dan sinyal berisi paling sedikit satu residu yang bermuatan positif, c) Rangkaian residu yang bersifat hidrofobik kuat dengan panjang sekitar residu membentuk pusat rangkaian sinyal. Asam amino Ala, Leu, Tie dan Phe selalu ditemukan di daerah tersebut. Substitusi satu residu asam amino yang bermuatan akan menghancurkan aktivitas pemandu rangkaian sinyal, d) Tapak pemotongan pada ujung COOH-terminal lebih polar dan pada pusat hidrofobik. Residu satu asam amino sebelum tapak pemotongan (-1 dari sisi amino terminal) dan tiga amino (-3) dari tapak pemotongan mempunyai rantai samping sedikit netral dan biasanya adalah alanin (Ala). Asam amino Cys, Thr, Ser dan Gly juga ditemukan pada posisi -1 dan -3. Rangkaian sinyal amino-terminal dan protein sekretori dan membran plasma disajikan pada Tabel 8.2 dengan menggunakan simbol asam amino satu-huruf seperti dipaparkan pada Tabel 8.3.

3 Tabel 8.2. Rangkaian asam amino dalam protein pengarah Catatan : Huruf tebal - asam amino hidrofobik Huruf italik - asam amino yang selalu didepan daerah hidrofobik Tabel Singkatan asam amino tiga-huruf dan satu-huruf

4 Tidak semua vesikel sektretori dan membran plasma berisi rangkaian sinyal amino-terminal yang terpotong sesuai proses translokasi lewat membran RER. Beberapa protein berisi rangkaian sinyal internal dengan peran yang serupa. 2. HIPOTESIS SINYAL Pada tahun 1972, C. Milstein dkk. menunjukkan adanya berbagai sinyal yang terlihat dalam proses pemilahan dan pen-target-an protein pada sel eukariot. Analisis tersebut berdasar pada penelitian yang menggunakan antibodi dalam membran RE yang disekresi ke luar sel. Sebagian dari rangkaian asam amino dalam bentuk antibodi hilang, kemungkinan rangkaian asam amino yang merupakan bagian sinyal pengarah tertinggal dalam membran yang lepas sebagai molekul ke sistem sekretori. Beberapa tahun kemudian, G. Blobel, B. Dobberstein, P. Walter dick. menemukan ribosom dalam satu sistem yang sudah tidak mengandung RE yang mensintesis protein dengan rangkaian asam amino yang lebih panjang dari pada sintesis yang serupa dalam sistem normal. Selisih panjang fragmen protein sekitar asam amino dan rangkaian tersebut berada dekat dengan gugus aminoterminal. Polipeptida tersebut lebih banyak mengandung asam amino hidrofobik dibandingjenis asam amino yang lain. Penelitian lanjutan yang dilakukan Walter, Blobbel dick. pada tahun 1981 menemukan berbagai kompleks protein yang berperan dalam penempelan ribosom ke retikulum endoplasmik. Peptida sinyal yang memandu protein ke RE terdiri atas 2 komponen ialah signal recognation particle (SRP) dan SRP receptor (docking protein) sebagai berikut: a) Signal recognation protein (SPY) Signal recognation particle (SRP) merupakan ribonukleoprotein dengan berat 325 kd yang terdiri atas RNA (7SL RNA) yang tersusun atas sekitar 300 nukleotida dan 6 macam molekul polipeptida. Gambaran secara skematis SRP disajikan pada Gambar 8.7. Partikel tersebut berbentuk batang dengan dengan panjang 240 A dan lebar 50 A. Tulang punggung dan molekul SRP adalah komponen RNA yang mengikat 6 macam protein dengan berat molekul masibng-masing 9, 14, 19, 54, 68 dan 72 kd yang membentuk 2 bagian SRP.

5 Domain SRP Domain yang mengikat tapak A ribosom Gambar 8.7. Gambaran skematis signal recognation Particle (SRP). Molekul RNA (7SL) tergambar dalam garis tebal mengikat 6 molekul protein (warna gelap). Domain SRP berikat dengan SRP domain yang lain mengikat ribosom. Gambar 8.7 menunjukkan peran beberapa subunit protein SRP di antaranya adalah subunit 9, 54 dan 72 kd. Subunit 9 kd akan mencegah perakitan polipeptida, karena SRP menempel pada sinyal polipeptida yang muncul dan ribosom. Unit 54 kd mengadakan hubungan dengan rangkaian sinyal dan molekul protein yang akan disintesis, sedangkan subunit 72 kd akan mengikat SRP reseptor dan mulai lagi perakitan polipeptida sesudah SRP terikat pada reseptor. b) Signal recognition particle receptor Protein lain yang berperan dalam penempelan ribosom ke membran RE adalah SRP reseptor yang sering disebut docking protein yang merupakan bagian dari membran RE. Molekul SRP reseptor terdiri atas suatu dimer, masing-masing adalah dimer α (69 kd) dan dimer β (30 kd). Protein tersebut dapat mengikat SRP yang terkait rangkaian sinyal. Kedua macam partikel (SRP dan SRP resptor) diyakini terlibat dalam proses pengikatan ribosom pada membran RE dan GTP berperan dalam proses pelepasan SRP setelah ribosom seolah-olah tertanam di dalam membran RE. Bagian sitosolik dan subunit α-srp reseptor berisi bengkokan-bengkokan yang bermuatan positif yang memungkinkan mengadakan interaksi dengan molekul RNA dan RSP yang bermuatan negatif. Proses penempelan dan pelepasan SRP dilukiskan pada Gambar 8.8.

6 Gambar 8.8. Partikel pengenal signal (SRP) dan beberapa fungsi Polipeptida Proses penempelan dan pelepasan SRP dapat dilihat pada Gambar 8.9. Pada saat rangkaian sinyal keluar dari ribosom, SRP menempel pada sinyal, sedangkan ribosom mengikat GTP. Sintesis protein berhenti pada saat penempelan SRP berlangsung. Kompleks ribosom-srp akan dikenali dan diikat oleh SRP reseptor membran RE, sehingga ribosom benar-benar terikat kuat pada membran RE. Rangkaian sinyal hidrofobik akan tertanam dalam membran dengan perantaraan protein integral dalam RE yang disebut riboforin I dan riboforin II. Setelah ribosom terikat pada kedua macam protein tersebut, GTP akan terhidrolisis dan energinya digunakan untuk melepas SRP. Mekanisme penempelan SRP pada SRP reseptor disajikan pada Gambar 8.9. Setelah proses tersebut berlangsung, sintesis protein dilanjutkan dan polipeptida akan masuk ke dalam sisterna RE lewat membran.

7 Gambar 8.9. Kerja SRP dan SRP reseptor dalam mekanisme sinyal pengarah RE. A). Sintesis Protein berlangsung sampai sinyal polipeptida menjulur keluar ribosom. b). Setelah sinyal lengkap berada di luar ribosom, SRP mengenal sinyal dan menempel bersama GTP. Sintesis poilisakarida berhenti saat SRP menempel sinyal dan terjadi perubahan konformasi dari SRP. Konformasi SRP yang berubah akan dikenal SRP reseptor dan RE. c). Pada saat ribosom terikat pada RE, GTP terhidrolisis dan SRP dilepas. Polipeptida yang disintesis akan menerobos membran RE. Gambaran sintesis polipeptida dalam lumen RE yang terkait dengan daur ribosom dan daur SRP disajikan path Gambar Molekul RNA yang mencetak bagian dan partikel pengenal sinyal dinamakan SRP 78 scrna. Penelitian Walter dkk. menunjukkan, bahwa apabila RNA tersebut diambil atau dihidrolisis, maka molekul SRP tidak akan dirakit. Diperkirakan bahwa scrna bertindak sehagai kerangka yang membentuk SRP. Fungsi SRP tidak hanya tergantung pada peran scrna sebagai pemersatu partikel, tetapi ikatan antara SRP dengan ribosom sinyal dan docking protein tergantung pada komponen protein partikel.

8 Gambar Partikel pengenal sinyal (SRP) berperan dalam pengiriman ribosom ke RE. Rangkaian sinyal yang bebas polipeptida dikenali SRP. Kompleks yang terdiri atas SRP, peptida sinyal dan ribosom akan menempel pada SRP reseptor dan membran RE. Ribosom kemudian ditransfer ke riboforin dan proses translokasi benlangsung, sehingga rantai polipeptida berada di dalam lumen RE. Reseptor akan melepas SRP dan partikel tersebut akan mengulang fungsinya dengan menempelkan din pada rangkaian sinyal berikutnya. 3. PENYUSUPAN KOTRANSLASIONAL DAN PASCA TRANSLASIONAL PROTEIN Hipotyesis sinyal pada awalnya diperkirakan, bahwa rantai polipeptida baru yang dibentuk didorong keluar dan ribosom dengan kekuatan yang cukup untuk menembus membran retikulum endoplasmik. Persyaratan penting yang diperlukan agar mekanisme tersebut dapat berlangsung adalah sintesis protein dan penyusunan protein lewat membran terjadi secara simultan. Dengan kata lain, transfer molekul polipeptida lewat membran hams berlangsung secara kotranslasional. Gagasan tersebut berubah setelah ditemukan banyak protein yang dapat masuk ke membran RE secara post-translational (pasca translasional) sesudah sebagian besar atau seluruh proses sintesis berakhir. Proses

9 penyusupan protein secara pasca translasional banyak berlangsung dalam sd bakteri dengan menggunakan sinyal yang menempelkan ribosom ke permukaan sitoplasmik membran plasma. Beberapa macam sel eukariot yang biasa menyusup melalui membran RE secara kotranslasional, mampu melintas secara pasca translasional. Contohnya adalah protein yang masuk ke dalam mitokondria adalah protein pasca translasional pada sel normal maupun pada sel dalam kondisi eksperimental. Protein yang masuk secara pasca translasional umumnya dalam keadaan sedikit melipat. Gambaran secara skematis proses tersebut disajikan pada Gambar Energi yang diperlukan untuk mendorong masuknya protein pasca translasional adalah energi hasil hidrolisis ATP yang bekerja sama dengan dua atau lebih protein terlarut dalam sitoplasma. Protein-protein tersebut bertindak sebagai chaperones (pengantar) yang berperan untuk stabilisasi molekul yang lewat membran dalam keadaan tidak melipat atau bekerja sebagai unfoldases dengan menggunakan energi hasil hidrolisis ATP atau GTP agar protein membran membuka. Fungsi SRP kemungkinan untuk memelihara sinyal agar selalu dalam keadaan tidak melipat, sehingga dapat menerobos membran RE. Molekul protein yang mengalami ehaperonisasi akan masuk atau lewat membran dan melipat menjadi bentuk yang lebih kompak (padat). Energi bebas yang dilepaskan selama proses pemadatan dimanfaatkan untuk mendorong protein melewati membran. Menurut R.J. Ellis, istilah chaperons dalam bidang biokimia adalah mencegah interaksi yang salah antar permukaan yang komplementer dan

10 memisah hubungan yang tidak tepat., Proses melipatnya molekul protein didorong oleh protein yang bekerja sebagai faktor pembatas terhadap terjadinya beberapa tingkat konformasi. Faktor tersebut dinamakan chaperones yang kemungkinan bekerja mencegah konformasi yang salah atau memperkuat konformasi yang sudah tepat. Diperkirakan chaperons berikatan dengan protein eksentrik yang menonjol akibat terjadinya pembengkokan atau perlipatan yang membatasi terjadinya pelengkungan yang berlebihan dan konfrmasi yang sudah tepat. 4. SINYAL PENGARUH RETIKULUM ENDOPLASMIK Sinyal pengarah-re sering disebut peptida transit, rangkaian pemandu atau presekuen yang terdiri atas kombinasi dan asam-asam amino yang membentuk 3 subdaerah seperti terlihat pada Gambar Sinyal ujung N- terminal dan asam amino pertama sampai ke 7 adalah daerah polar yang biasanya residu ke 1 sampai ke 3 adalah lisin. Segmen yang bermuatan positif tersebut kemungkinan akan mendorong terjadinya penempelan awal dari sinyal ke permukaan membran RE yang bermuatan negatif. Banyak molekul fosfolipid dalam membran RE yang bermuatan negatif pada ujung polarnya. Di belakang daerah yang bermuatan positif tersebut terdapat teras hidrofobik yang terdiri atas sekitar 6 sampai 12 asam amino atau Iebih. Molekul asam amino di daerah tersebut mampu membentuk bangunan α-heliks atau untai beta yang panjang untuk merentang bagian dalam membran yang bersifat hidrofobik. Teras berperan dalam mendorong penyusupan sinyal ke bagian dalam membran. Setelah terjadi penyusupan, porus (lubang) hidrofobik dapat membuka untuk pelintasan rangkaian asam amino. Daerah berikutnya (ke tiga) termasuk tempat terpotongnya sinyal sesudah protein menyusup ke membran. Pada kebanyakan sinyal, daerah tersebut berisi asam amino yang kecil, rantai samping tidak bermuatan pada posisi ke 1 dan ke 3 ke arah N-terminal dan titik tempat pemotongan.

11 Ditemukan juga asam amino yang besar serta polar atau rantai sampingnya bermuatan pada posisi ke 2 ke hulu dan titik potong. Pengaturan posisi rantai asam amino yang akan dipotong dilukiskan pada Gambar Gambaran struktural molekul tersebut diperkirakan mampu dikenal oleh enzim pelepas sinyal. 5. SINYAL PEPTIDASE Aktivitas sinyal peptidase dalam melepas sinyal merupakan persyaratan untuk keberhasilan transfer dan kebanyakan protein terarahkan-re. Apabila aktivitas enzim sinyal peptidase dihambat, maka transfer protein biasanya tidak sempurna. Protein yang secara normal lewat membran RE seperti protein sekresi akan macet di dalam membran, jika aktivitas enzim sinyal peptidase terganggu. Keberadaan sinyal peptidase dapat diketahui dari isolat pemotongan membran RE, meskipun posisi yang tepat belum ditemukan. Posisi tersebut kemungkinan terdapat pada bagian membran sisterna RE yang menghadap ke dalam atau karena molekul enzim tersebut sangat hidrofobik, diperkirakan terdapat dalam membran interior. Sinyal peptidase pada sel prokariot ekuivalen dengan sel eukariot, sinyal peptidase I dengan aktivitas yang sifatnya universal, dapat mengenal dan memotong sinyal N-terminal dan berbagai sumber baik dan sel prokariot maupun sel eukariot. Pada bakteri Escherichia coli, protein sinyal dipotong oleh 2 peptidase ialah sinyal peptidase I dan sinyal peptidase II. Sinyal peptidase I mempunyai berat molekul dalton yang terdapat di dalam dan di luar

12 membran. Enzim tersebut memotong sinyal N-terminal dan semua protein terarah-membran, kecuali lipoprotein yang tidak biasa ditemukan pada bagian luar membran bakteri Gram-negatif. Sinyal peptidase II terdapat dalam membran plasma dengan peran melepas sinyal N-terminal dan lipoprotein. 6. SINYAL TRANSFER-STOP Protein yang diarahkan ke RE oleh sinyal N-terminal kemungkinan akan tetap berada dalam membran atau menerobos membran dan masuk ke sisterna RE. Gambar 8.14 menunjukkan topologi translokasi protein melintas membran RE. Penahanan protein dalam membran tergantung pada sinyal transfer-stop yang akan menghentikan satu segmen atau lebih dari rantai asam amino baru yang melewati membran. Contohya adalah protein viral yang tertanam dalam membran plasma yang terdiri dan untai asam amino hidrofobik atau asam amino netral dengan panjang untai antara residu yang terdapat dalam ujung C-terminal dari suatu protein. Segmen protein yang tertanam adalah sinyal transfer-stop yang menahan majunya protein lewat membran RE selama sintesis awal. Protein yang disusupkan ke membran oleh sinyal N-terminal dilanjutkan lewat membran sampai ditemukannya sinyal transfer-stop Pada titik tersebut, rantai hidrofobik akan terkunci dalam membran RE dan segmen berikutnya dapat melewati membran diikuti dengan rangkaian transfer-stop tambahan. Rangkaian transfer-stop diperkirakan akan melepas segmen rantai asam amino dan kanal hidrofobik dan tertanam dalam membran. Pengaturan tersebut akan menghasilkan segmen-segmen yang melengkung balik dan seterusnya melewati membran. Secara umum, jumlah sinyal transfer-

13 stop menunjukkan jumlah segmen padat-membran dan satu molekul protein dan berapa kali rantai asam amino silang menyilang. Apabila dalam molekul polipeptida terdapat satu sinyal peptida dan satu sinyal transfer-stop, maka transfer polipeptida akan berhenti pada saat sinyal transfer-stop masuk ke kanal dalam membran RE. Pada saat tersebut sintesis protein masih berlangsung di dalam ruang sitosolik, meskipun telah terjadi pemotongan sinyal peptida, sehingga pada akhir sintesis ditemukan satu untai polipeptida di dalam lumen (ruang sisterna) dan yang lain dalam ruang sitosol. Pembentukan segmen protein yang berada di dalam lumen RE (ruang sitema) dan di dalam ruang sitosol dapat dilihat pada Gambar Penyusupan polipeptida lewat mebran RE yang berisi 2 segmen hidrofobik (satu sinyal peptida dan yang lain sinyal transfer-stop) berlangsung dengan mekanisme seperti terdapat dalam Gambar Sinyal transfer-stop umumnya lebih berisfat hidrofobik dibanding sinyal peptida, tetapi molekul tersebut dapat bertindak sebagai sinyal peptida, jika lokasinya & protein berubah.

14 dapat diamati dan amino-terminal ke segmen pertama (antara sinyal peptida dan sinyal transfer-stop), dilanjutkan dengan sintesis polipeptida berikutnya. Proses penyusupan dilanjutkan yang dimulai lagi dengan penggunaaan sinyal peptida yang berada di belakang sinyal transfer-stop sebelumnya. Proses tersebut berlangsung terus, sehingga diperoleh gambaran seperti terlihat pada Gambar 8.16 di atas. Lumen RE terutama terisi protein transit dalam proses melipat, sedangkan di dalam sitoplasma terdapat protein yang sudah dalam bentuk lipatan. Pada saat protein melipat terjadi teras hidrofobik internal, tetapi sebelum proses tersebut berlangsung, residu hidrofobik dikelilingi oleh air. Rantai polipeptida yang tidak melipat meskipun dalam konsentrasi sangat rendah, mempunyai kecenderungan untuk berkumpul dengan molekul lainnya untuk menyembunyikan gugus hidrofobiknya, sehingga terbentuk presipitat. Dalam campuran kompleks protein yang tidak melipat seperti dalam lumen RE, kemungkinan akan terjadi presipitat amorf atau heterogenous. Di dalam lumen

15 RE terdapat protein yang disebut binding protein (BIP) dalam konsentrasi yang sangat tinggi yang mampu mengenal kesalahan lipatan suatu protein. Molekul BIP tampaknya mampu mengenal permukaan hidrofobik sehingga molekul tersebut dapat memperbaiki bentuk lipatan. Molekul IP berisi peptida sinyal dan empat asam amino pada C-terminal yang bertanggung jawab agar. protein tetap berada dalam lumen RE. Apabila BIP mengikat protein yang tidak melipat,. molekul tersebut membantu agar protein dalam RE tetap tidak rapi. Topologi protein membran dengan sinyal yang berselang-seling disajikan pada Gambar SINYAL PEPTIDA PASCA PENYUSUPAN Sesudah polipeptida berada dalam membran RE atau di dalam sisterna RE tanpa sinyal transfer-stop, maka kemungkinan protein baru yang disintesis akan menjadi komponen permanen tetap di lokasi tersebut atau dikirim lewat jalur RE kompleks Golgi membran plasma.

16

17 Arahan ke lokasi tersebut tergantung pada ada atau tidaknya postinsertion singnal (sinyal pasca penyusupan) yang memandu protein ke tujuan akhir di RE, kompleks Golgi, lisosom, vesikel penyimpanan, membran plasma atau vakuola netral pada sel tanaman. Pembentukan rangkaian atau struktur sinyal pasca penyusupan untuk protein terarah-re sangat sulit dibuktikan. Kebanyakan sinyal tersebut hanya merupakan sesuatu yang belum diketahui, baik lokasi maupun rangaian asam amino penyusunnya. Kemungkinan sinyal tersebut terdiri atas 3 macam model mekanisme operasional: a. Sinyal retensi retikulum endoplasmik Rangkaian asam amino yang menahan protein dalam retikulum endoplasmik. b. Sinyal pengarah protein enzimatik ke lisosom Adanya unit karbohidrat yang mengalami modifikasi yang mengarahkan glikoprotein yang baru yang disintesis ke lisosom. c. Sinyal terarah-re ke lokasi bukan lisosom a. Sinyal Retensi Retikulum Endoplasmik Di antara berbagai protein yang berath secara permanen di dalam kompartemen RE adalah BiP (binding protein) suatu protein terlarut yang mengembangkan pembentukan lipatan dan perakitan antibodi serta polipeptida lain menjadi protein multisubunit. Protein lain yang merupakan komponen tetap dalam RE adalah PDI (Protein Disuif ide Isomerase), suatu enzim yang mengkatalisis pengaturan kembali ikatan disulfida yang terdapat di dalam protein yang baru disintesis. Dua orang peneliti, S. Monro dan H.R.B. Pelham menemukan rangkaian 4 asam amino yang ujung C-terminalnya sdari kedua protein di atas dan protein lain yang ditinggal dalam RE ialah Lys-Asp-Glu-Leu dengan singkatan asam amino satu huruf KDEL. Beberapa substitusi yang terjadi secara alami untuk sinyal retensi RE dalam beberapa protein adalah Arg untuk asam amino pertama, sehingga ke-4 asam amino tersebut menjadi RDEL. Bentuk standar sinyal retensi RE dada yeast menggunakan histidin sebagai asam amino pertama dan diperoleh rangkaian HDEL. Munro dan Pelham mengadakan penelitian dengan mengambil rangkaian ke empat asam amino dan sinyal retensi RE yang menyebabkan protein

18 tersebut ikut dalam sekret yang dikeluarkan dari RE. Sebaliknya penambahan KDEL sinyal ke ujung C-terminal pada protein nonretensi menyebabkan terjadinya penahanan protein tersebut di dalam RE. Identifikasi reseptor untuk sinyal KDEL dilakukan oleh D. Vaux dkk. yang menggunakan antibodi anti-ideotype dan kemungkinan mekanisme bagaimana cara reseptor bekerja, antibodi yang pertama kali dikembangkan untuk melawan sinyal KDEL. Apabila membran reseptor mengenal dan mengikat sinyal KDEL sebagai bagian dari mekanisme retensi, diperkirakan kemungkinan satu antibodi anti-kdel atau lebih, mempunyai tapak akhir serupa dengan reseptor KDEL. Berikutnya adalah penggunaan antibodi anti-kdel sebagai antigen untuk mengebangkan second generation antibodies yang dapat mengenal tapak pengikat- KDEL. Antibodi tersebut kemudian digunakan sebagai probe untuk reseptor KDEL dalam RE atau membran sekitarnya. Antibodi dicoba untuk mengikat protein membran integral yang terdapat terutama dalam vesikel yang dekat dengan RE atau dalam sis-sistema Golgi. Penemuan tersebut memperkuat hipotesis penyelamatan dari retensi dan protein penghuni RE yang telah diteliti oleh Moro dan Pelham. Menurut pemikiran para peneliti tersebut, protein yang terdapat dalam RE dapat lepas dengan jalan masuk ke dalam tonjolan membran RE yang kemudian menjadi vesikel transisi. Vesikel tersebut akan mengadakan fusi dengan membran kompleks Golgi sepanjang protein tersebut dialamatkan ke tapak dan jalur terarah-re. Protein RE yang masuk ke dalam vesikel transisi akan diikat oleh reseptor KDEL dan membran vesikel. Vesikel tersebut akan mengadakan fusi dengan sis-sisterna kompleks Golgi dan reseptor KDEL dengan protein RE yang terikat, mengalami pemilahan dan ditempatkan dalam vesikel yang menonjol dari Golgi untuk dikirim kembali ke RE. Setelah vesikel mengadakan fusi dengan membran RE, kemudian reseptor KDEL melepas protein RE. Daur pembebasan dan penyelamatan protein RE akan dimulai lagi dengan cara yang sama. Mekanisme penyelamatan protein penghuni RE disajikan pada Gambar 8.18

19 Enzim yang mempercepat perbaikan ikatan disulfida dalam RE adalah protein disulfida isoinerase (PDI). Di dalam sitosol terdapat campuran agen pereduksi berisi thiol yang mencegah terjadinya ikatan -S-S (ikatan disulfida) dengan mempertahankan bentuk asam amino sistein dalam keadaan tereduksi (-SH). Lumen RE tidak berisi agen tersebut, sehingga memungkinkan terbentuknya ikatan disulfida antar sistein dalam satu molekul protein. Gambar 8.19 menunjukkan perbaikan ikatan disulfida dalam satu molekul protein. Gugus thiol dan PDI yang menempel pada bagian dalam RE akan mengikat salah satu gugus thiol dan sistein dan dapat memperbaiki ikatan-ikatan -S-S yang salah.

20 b. Sinyal Pengarah Protein Enzimatik ke Lisosom Lisosom adalah kantong terbungkus membran yang berisi campuran enzim hidrolitik yang mampu memecah kebanyakan substansi biologik. Banyak enzim yang masuk ke lisosom diberi tanda dengan sinyal pemilah pasca penyusupan (post-insertion sorting signal) yang terdiri atas manosa dan gugus fosfat pada atom karbon-6. Sinyal manosa-6-p ditemukan oleh S. Kornfeld dan kawan-kawan. Protein yang bertindak sebagai reseptor untuk sinyal lisosom diteliti oleh W.J. Brown dan Farquhar. Vesikel lisosom dengan membran bagian dalam yang aktif mengikat sinyal manosa-6-p (ph 7) bergerak mendekati sissisterna komleks Golgi yang berisi reseptor yang terdapat dalam membran bagian dalam. Mekanisme pemilahan protein lisosomal disajikan pada Gambar Trans-sisterna kompleks Golgi mempunyai ph yang sedikit asam yang menyebabkan enzim hidrolitik dengan sinyal manosa-6-p terikat

21 sangat kuat dengan bagian dalam membran yang berisi reseptor. Segmensegmen membran tersebut akan lepas menjadi vesikel yang bergerak ke lisosom. Di bagian dalam vesikel, ph internal menurun karena aktivitas pompa W-ATP dalam membran vesikel. Akibat penurunan ph tersebut, reseptor akan kehilangan afinitasnya terhadap enzim lisosomal dan membebaskannya ke vesikel. Brown dan Farquhar melakukan penelitian dengan menggunakan amonium sulfat ion yang ditambahkan pada sel, maka senyawa tersebut akan mengganggu proses pemilahan lisosom. Masuknya ion amonium ke dalam lisosom akan menaikkan ph dengan akibat timbulnya ketidakmampuan reseptor manosa-6-p melepas enzim hidrolitik dan membiarkan tetap terikat pada lisosom. Keterikatan tersebut mengakibatkan tidak ada daur ulang vesikel ke kompleks Golgi. Pada ph normal, enzim-enzim lisosomal yang disekresi terikat kuat pada reseptor manosa-6-p dan dikembalikan ke sel lewat vesikel endositik. Kebanyakan vesikel mengadakan fusi degan lisosom atau dengan kompleks Golgi yang secara otomatis akan mengembalikan enzim lisosomal dan pengembaraannya ke jalur distribusi normal. Sekitar 5-10% dan enzim di dalam lisosom diperkirakan mengalami proses dengan

22 mekanisme seperti di atas. Proses ulang-alik reseptor manosa-6-p berlangsung akibat berubahnya ph ruang dalam endolisosom. Enzim lisosomal mengalami disosiasi dan protein reseptor manosa-6-p di dalam endolisosom dan mencerna material yang berada di dalamnya. Setelah enzim dilepas, reseptor akan kembali ke membran trans-golgi network (TGN) dengan menggunakan vesikel berselubung. Proses daur ulang dan endolisosom ke kompleks Golgi serupa dengan mekanisme daur antara endosom dengan membran plasma. Transpor enzim hidrolase termediasi-reseptor dan kompleks Golgi ke endolisosom analog dengan endositosi melekul ekstra selular dan membran plasma ke endosom. Kedua proses tersebut masuk ke dalam kluster dan clathrin-coated yang dikenal sebagai coated-pit. Daerah tersebut akan menonjol dan akan menjadi vesikel terlapis pis-klatrin yang mengangkut ligan ke kompartemen kedua yang bersifat asam, kemuadian reseptor akan kembali ke membran plasma. Transpor enzim hidrolase lisosom ke lisosom disajikan pada Gambar Proenzim hidrolase lisosom akan mengikat manosa-6-p dalam sis-golgi dan terpisah dan berbagai jenis protein lain dalam TGN. Pemisahan terjadi karena vesikel terlapis-klatrin membentuk tonjolan (budding) pada TGN yang banyak mengandung reseptor manosa-6-p yang mengikat hidrolase. Vesikel terbungkus akan kehilangan lapisannya dan mengadakan fusi dengan endolisosom. Endolisosom dengan ph rendah akan menyebabkan hidrolase lepas dari reseptor yang kemudian masuk daur ulang ke kompleks Golgi untuk menjalankan proses serupa berikutnya. Hilangnya gugus fosfat dan manosa akan mengurangi kesempatan kembalinya hidrolase ke kompleks Golgi bersama reseptomya. Meskipun reseptor

23 glikoprotein manosa-6-p berbeda ukurannya, tetapi rangkaian asam amino tertentu tampaknya mempunyai fungsi yang serupa. Perjalanan reseptor manosa-6-p dalam proses daur ulang diamati dengan menggunakan antibodi spesifik ke tempat protein dalam sel. Reseptor secara normal ditemukan dalam kompleks Golgi dan endolisosom, tetapi tidak ditemukan dalam lisosom dewasa. Dalam kultur sel yang ditambah asam lemah seperti amonia atau chloroquine, reseptor manosa-6-p yang biasanya tertimbun dalam organela yang asam, ph-nya akan menjadi netral. Reseptor akan hilang dan kompleks Golgi dan terkumpul dalam endolisosom. Kembalinya reseptor ke Golgi dapat dipicu dengan cara menghilangkan basa lemah tersebut atau mempertinggi konsentrasi manosa-6-p di dalam media. Hasil penelitian tersebut memberikan gambaran bahwa pengembalian reseptor ke kompleks Golgi dipermudah dengan perubahan konformasi molekul reseptor yang terjadi pada saat lepas dan enzim hidrolase. Klatrin pembungkus yang terbentuk pada saat terjadinya vesikel tampakya bertindak sebagai saringan molekul yang memisahkan reseptor dan ligan ke vesikel, tetapi tidak bertanggungjawab pada spesifitas tujuan vesikel, karena pembungkus akan segera hilang setelah vesikel terbentuk.

24 Gambaran skematis tentang mekanisme pengarahan transpor vesikel terlapis-klatrin dari dan ke membran spesifik dapat dilihat pada Gambar Apabila sel diberi tunicamycine, suatu antibiotik a yang rnenghambat pembentukan gugus karbohidrat pada glikoprotein, kecuali untuk enzimenzim lisosom, masih dapat mencapai tujuan di dalam sel. Dapat dikatakan, bahwa untuk glikoprotein non-lisosomal yang mayoritas merupakan glikoprotein yang dipilah dan didistribusi di dalam sel, gugus karbohidrat tidak merupakan bagian yang menentukan dalam proses pemilahan. Kemungkinan molekul glikoprotein tersebut tidak berisi sinyal yang esensial untuk mengikuti jalur tertentu. Pada tanaman dan fungi, vauola sentral mempunyai fungsi yang serupa dengan lisosom pada hewan. Vakuola juga berisi enzim-enzim yang mampu menghidrolisis banyak molekul biologik terutama polisakarida. Enzim dan lain-lain protein termasuk protein yang disimpan dalam vakuola umbi dan akar, masuk ke dalam vakuola setelah disintesis dalam RE. Dua orang peneliti B.W. Tague dan M.J. Chrispeel menunjukkan, bahwa fitohemaglutinin, suatu protein yang masuk ke dalam vakuola tanaman akan mengikuti jalur ke vakuola pada yeast apabila dimasukkan ke dalam organisme tersebut. Dalam sel ragi dan sel tanaman terlihat adanya mekanisme pemilahan dan reseptor yang mengarahkan protein ke vakuola sentral. Percobaan dengan melepas segmen polisakarida tidak mempunyai pengaruh terhadap jalur pengiriman ke vakuola sentral, sehingga diperkirakan molekul tersebut tidak ditandai oleh sinyal manosa-6-p. Penelitian lain menunjukkan bahwa pengarah-vakuola terdapat di dalam molekul polipeptida yang biasanya merupakan rangkaian asam amino (50 buah) pertama sesudah sinyal pengarah-re. c. Sinyal Terarah-RE ke Lokasi Bukan Lisosom Beberapa protein yang masuk ke dalam RE menjadi elemen integral dan kompleks Golgi, membran plasma atau membran pembungkus nukleus. Jalur terpanjang dan paling intensif yang diikuti peneliti adalah arahan protein ke membran plasma. Protein yang ditujukan ke lokasi tersebut masuk ke RE dan kemudian bergerak melewati membran vesikel transisi, ke kompleks Golgi dan ke vesikel sekretori sampai pada tujuan

25 akhir. Di antara molekul-molekul yang mengambil jalur terseut akan lewat membran dengan cara transpor pasif dan aktif dan juga menggunakan reseptor permukaan sel. Dalam beberapa membran seperti pemukaan epitel yang membungkus rongga badan, mekanisme pemilahan dan distribusi menempatkan proteinprotein yang berbeda pada tempat-tempat yang tepat dalam membran plasma. Protein yang membawa gula dan asam amino dapat ditemukan pada sel epitel intestinum, misalnya molekul yang akan didistribusi ke daerah membran plasma yang menghadap ke ruang intestinum. Protein dengan tujuan akhir kompleks Golgi akan mengikuti jalur yang sama yang dikirim ke membran plasma, tetapi berhenti setelah mencapai sisterna Golgi. Protein-protein tersebut termasuk berbagai macam enzim transferase, proteinase, fosforilase dan sulfatase. Kemungkinan proteinprotein tersebut mengadakan interaksi dengan reseptor apabila proses pembentukan molekul enzim tersebut sudah selesai. Beberapa protein RE kemungkinan akan mengikuti perjalanan yang sama seperti membran Golgi, tetapi arahnya akan berbalik setelah mengalami modifikasi di dalam Golgi dan kembali ke lokasi tetapnya di dalam RE. Protein yang membentuk bagian membran nukleus, mungkin disintesis di dalam ribosom yang menempel pada bagian luar membran nukleus. Apabila protein disintesis di bagian luar membran nukleus, mungkin molekul protein akan tetap tinggal di dalam membran tersebut atau bergerak melewati kanal yang terbentuk dalam RE, yang kemungkinan mengalami modifikasi dalam RE atau komleks Golgi sebelum menjadi penghuni tetap di dalam membran pembungkus membran nukleus. Jika protein disintesis dalam RE, mungkin protein tersebut akan masuk ke dalam bungkus nukleus lewat kanal. Tampaknya sinyal pasca penyusupan dan reseptor bertanggung jawab untuk retensi atau arahan protein ke membran pembungkus nukleus. Protein yang masuk ke dalam sistem distribusi lewat RE mempunyai berbagai kemungkinan tujuan akhir yang berkisar antara RE sampai membran pembungkus nukleus, kompleks Golgi, lisosom, membran plasma dan juga dikirim ke luar sel.