EFEKTIVITAS SIMBIOTIK BEBERAPA GALUR Bradyrhizobium japonicum TOLERAN ASAM- ALUMINIUM PADA TANAMAN KEDELAI HANUM HABIBAH

Transkripsi

1 EFEKTIVITAS SIMBIOTIK BEBERAPA GALUR Bradyrhizobium japonicum TOLERAN ASAM- ALUMINIUM PADA TANAMAN KEDELAI HANUM HABIBAH SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

2 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Efektivitas Simbiotik Beberapa Galur Bradyrhizobium japonicum Toleran Asam- Aluminium pada Tanaman Kedelai adalah benar hasil karya saya sendiri dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum pernah dipublikasikan kepada perguruan tinggi manapun. Sumber data dan informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Mei 2008 Hanum Habibah NIM G

3 ABSTRACT HANUM HABIBAH. Symbiotic Effectiveness of Acid-Aluminium Tolerance Bradyrhizobium japonicum strains on Soybean Plant. Under supervision of NISA RACHMANIA MUBARIK and ARIS TRI WAHYUDI. The main problems using acid mineral soil for agriculture are low fertility, high in exchangeable Al and low in phosphor. Soil acidity inhibits plant growth, N fixation bacteria growth and root nodule formation, furthemore inhibits N fixation. The purpose of the research was to study the symbiotic effectiveness of ten strains of acid-aluminium tolerance Bradyrhizobium japonicum on soybean plant cultivar Slamet. The research conducted in the greenhouse and used Complete Randomized Design with seven inoculation treatments, two controls and one standard strain which used the nutrient solution at ph 4,5. Each treatment had three replications, therefore thirty experiment units. Two inoculation treatments with one standard strain which used the nutrient solution at ph 4,0. Each treatment had three replications, therefore nine experiment units. The all of parameters were measured at 37 days after planting (DAP). Result of the experiments showed that mutant Bj 11 (19) had the highest symbiotic effectivity. The treatment of Bj 11 (19) could increase the dry weight of the upper crop (64,88%), the N-uptake (190,88%) and symbiotic effectivity (65,87%) and it was observed better than with and without nitrate control and the standard strain, USDA 110. Key words: acid-aluminium tolerance, soybean, Bradyrhizobium japonicum, symbiotic effectivity

4 RINGKASAN HANUM HABIBAH. Efektivitas Simbiotik Beberapa Galur Bradyrhizobium japonicum Toleran Asam-Aluminium pada Tanaman Kedelai. Dibimbing oleh NISA RACHMANIA MUBARIK and ARIS TRI WAHYUDI. Kedelai merupakan salah satu makanan penting yang dikonsumsi oleh penduduk Indonesia. Namun sampai sekarang ini produksi kedelai nasional masih rendah dan tidak mampu memenuhi kebutuhan di dalam negeri sehingga impor kedelai masih tinggi. Untuk menurunkan angka impor, bahkan lebih dari itu agar swasembada kedelai dapat tercapai, sangat mungkin diupayakan melalui usaha pemanfatan lahan masam yang masih sangat luas di Indonesia dipadukan dengan pemanfaatan mikrob tanah yang tepat dan efektif. Lahan diberdayakan dengan menanam kedelai agar produktivitasnya tinggi. Kedelai yang ditanam dan mikrob simbion harus toleran asam. Tanah masam menjadi masalah utama dalam pertanian karena kesuburan yang rendah dengan ciri tingginya konsentrasi aluminium dan rendahnya kandungan fosfor. Tanah masam menghambat pertumbuhan tanaman, pertumbuhan bakteri pemfiksasi N, dan pembentukan bintil akar yang pada akhirnya akan menurunkan penambatan nitrogen. Penelitian ini bertujuan untuk menguji efektivitas simbiotik sepuluh galur Bradyrhizobium japonicum toleran asam-aluminium (asam-al) pada tanaman kedelai varietas Slamet. Beberapa galur B. japonicum toleran asam-aluminium dari koleksi laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB telah berhasil dikonstruksi melalui mutagenesis dengan transposon. Dari hasil penelitian tersebut diperoleh galur-galur mutan yang mempunyai efektivitas simbiotik meningkat dan kemampuan membentuk bintil akar lebih banyak daripada tipe liarnya. Peremajaan B. japonicum dilakukan dengan cara menumbuhkan sejumlah koloni galur dari biakan stok ke dalam media yeast extract mannitol agar (YMA) yang ditambah merah kongo 0,0025% + rifampisin (Rif) 50 µg/ml menggunakan teknik goresan kuadran kemudian diinkubasi dalam ruang gelap pada suhu ruang selama 5-7 hari. Untuk membuat inokulum, sebanyak satu lup galur B. japonicum diremajakan dalam 20 ml medium YMB selama 7 hari di atas mesin penggoyang 140 rpm pada suhu 25 ο C. Jumlah sel dari inokulum dihitung dengan menggunakan hemasitometer Neubauer dan kepekatan yang diinginkan yaitu 10 8 sel/ml. Inokulasi dilakukan dalam kondisi aseptis pada kecambah yang telah berumur 2 hari di dalam botol Leonard. Setiap kecambah diinokulasi sebanyak 1 ml inokulum dengan kepekatan 10 8 sel/ml. Penelitian dilakukan di rumah kaca menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan tujuh perlakuan inokulasi, dua kontrol dan satu galur acuan menggunakan larutan hara ph 4,5. Setiap perlakuan diulang tiga kali sehingga terdapat tiga puluh satuan percobaan. Dua perlakuan inokulasi dengan satu galur acuan menggunakan larutan hara ph 4,0. Setiap perlakuan diulang tiga kali sehingga terdapat sembilan satuan percobaan. Semua parameter diukur pada 37 hari setelah tanam (HST). Parameter yang diukur ialah tinggi tanaman, berat kering tanaman bagian atas (BKTBA), berat kering bintil, jumlah bintil, serapan N tanaman (jumlah N total tanaman), aktivitas nitrogenase bintil akar, dan efektivitas simbiotik. Data

5 yang dihasilkan dari perlakuan yang menggunakan ph 4,5 dianalisis secara statistik menggunakan program Statistical Analysis System (SAS). Sedangkan data yang dihasilkan dari galur uji yang diberi perlakuan menggunakan ph 4,0 hanya dibandingkan dengan tipe liarnya. Parameter yang diukur dalam penentuan efektivitas simbiotik ialah BKTBA. Nilai efektivitas simbiotik (ESN) diperoleh dari BKTBA galur uji dibagi dengan BKTBA kontrol N dan nilai efektivitas simbiotik (ES USDA 110) diperoleh dari BKTBA yang diinokulasi galur uji dibagi dengan BKTBA tanaman yang diinokulasi galur acuan USDA 110. Aktivitas nitrogenase diukur dengan pengukuran reduksi asetilen menggunakan kromatografi gas. Kandungan N total tanaman dapat diketahui dengan mengukur kandungan N pada berat kering tanaman bagian atas (BKTBA). Jumlah kandungan N ditentukan dengan metode Kjeldahl menggunakan spektrofotometer Auto Analyser 3 Bran Luebbe pada panjang gelombang 636 nm. Hasil penelitian menunjukkan, Semua galur B. japonicum yang diujikan pada tanaman kedelai varietas Slamet mampu membentuk bintil akar. Bintil terbanyak dihasilkan oleh tanaman yang diinokulasi galur Bj 13 (wt) sensitif asam-al sebanyak 21 bintil. Sedangkan bintil yang paling sedikit dihasilkan oleh tanaman yang diinokulasi galur KDR15 (37) sebanyak 9 bintil. Untuk galur uji yang diinokulasikan pada tanaman kedelai dengan menggunakan ph 4,0 ternyata juga dapat membentuk bintil. Tanaman yang diinokulasi dengan ketiga galur uji menghasilkan jumlah bintil yang sama yaitu 18 bintil pertanaman. Inokulasi B. japonicum pada tanaman kedelai varietas Slamet mampu meningkatkan berat kering bintil terhadap galur acuan. Hasil tertinggi ditunjukkan oleh perlakuan dengan galur Bj 11 (5) sedangkan berat kering terendah ditunjukkan oleh perlakuan dengan galur KDR15 (37). Perlakuan inokulasi dengan galur uji pada tanaman kedelai varitas Slamet, semua menunjukkan mampu meningkatkan tinggi tanaman dibandingkan dengan kontrol N0. Tanaman yang memiliki ukuran tertinggi ditunjukkan oleh tanaman yang diinokulasi dengan Bj 11 (wt) tipe liar. Hasil terendah ditunjukkan oleh tanaman yang tidak diinokulasi. Tanaman yang diinokulasi dengan galur mutan KDR 15 (27) yang diuji menggunakan hara ph 4,0 memiliki tinggi yang lebih unggul dibandingkan tipe liarnya KDR 15 (wt) yaitu sebesar 67,5 cm. Inokulasi berbagai galur B. japonicum pada kedelai varietas Slamet memberi pengaruh yang nyata pada aktivitas nitrogenase. Galur mutan Bj 11 (5) memiliki aktivitas nitrogenase lebih tinggi yaitu 12,79 μmol 2 tan -1 dan berbeda nyata dibandingkan galur uji lain kecuali dengan Bj11 (wt), dan galur acuan USDA 110. Galur mutan KDR 15 (37) yang diinokulasikan pada tanaman kedelai menggunakan hara ph 4,0 memiliki aktivitas nitrogenase 12,29 μmol 2 tan -1 jam -1 lebih tinggi daripada tipe liarnya. Secara umum hasil berat kering tanaman bagian atas (BKTBA) menunjukkan hasil yang berbeda nyata dengan kontrol N0. Hasil tertinggi ditunjukkan oleh perlakuan inokulasi dengan mutan Bj 11 (19). Hasil terendah ditunjukkan oleh tanaman yang tidak diinokulasi dan tidak mengandung KNO 3 dalam haranya. Tanaman yang diinokulasi dengan galur mutan KDR 15 (27) yang menggunakan hara ph 4,0 menunjukkan berat kering tanaman bagian atas yang lebih tinggi daripada tipe liarnya yaitu sebesar 0,7450 g tan -1.

6 Inokulasi dengan galur-galur B. japonicum, memperlihatkan beberapa galur memiliki efektivitas simbiotik (ES) yang meningkat bila dibandingkan dengan kontrol N, maupun galur acuan USDA 110. Efektivitas simbiotik tertinggi ditunjukkan oleh galur mutan Bj 11 (19) sebesar 165,87% dibandingkan kontrol N dan 156,78% dibandingkan galur acuan USDA 110. Galur KDR 15 (37) menunjukkan ES terendah yaitu hanya mencapai 97,30%. Sedangkan galur uji yang dicoba menggunakan hara ph 4,0 ES tertinggi ditunjukkan oleh galur mutan KDR 15 (27) yaitu sebesar 151,11% dibandingkan tipe liarnya. Inokulasi dengan galur B. japonicum baik mutan maupun tipe liarnya berpengaruh nyata terhadap serapan N. Tanaman yang memiliki serapan N tertinggi ialah tanaman yang diinokulasi galur mutan Bj 11 (19) yang mencapai 20,10 mg N tan -1. Galur Bj 11 (19) dapat meningkatkan pengambilan N oleh tanaman sebesar 190,88% dibandingkan kontrol N0. Serapan N terendah dimiliki oleh perlakuan dengan galur KDR15 (37) yang memiliki serapan N 7,72 mg N tan -1. Perlakuan dengan menggunakan hara ph 4,0 menunjukkan tanaman yang diinokulasi dengan galur mutan KDR 15 (27) memiliki serapan N lebih tinggi daripada tipe liarnya yaitu sebesar 15,98 mg N tan -1. Kata kunci: toleran asam-aluminium, kedelai, Bradyrhizobium japonicum, efektivitas simbiotik

7 @Hak cipta milik IPB, tahun 2008 Hak cipta dilindungi Undang-undang, 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber. a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

8 EFEKTIVITAS SIMBIOTIK BEBERAPA GALUR Bradyrhizobium japonicum TOLERAN ASAM- ALUMINIUM PADA TANAMAN KEDELAI HANUM HABIBAH Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Departemen Biologi SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

9 Judul Tesis Nama NIM : Efektivitas Simbiotik Beberapa Galur Bradyrhizobium japonicum Toleran Asam-Aluminium pada Tanaman Kedelai : Hanum Habibah : G Disetujui Komisi Pembimbing Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si. Ketua Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si. Anggota Diketahui Ketua Program Studi Biologi Dekan Sekolah Pascasarjana IPB Dr. Ir. Dedy Duryadi S., DEA. Tanggal ujian: 13 Mei 2008 Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S. Tanggal lulus:

10 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Prof. Dr. Ir. Iswandi Anas

11 PRAKATA Alhamdulillaahirobbil aalamiin segala puji bagi Allah SWT atas segala rahmad, karunia, dan hidayahnya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul Efektivitas Simbiotik Beberapa Galur Bradyrhizobium japonicum Toleran Asam-Aluminium pada Tanaman Kedelai. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Kaca Departemen Biologi, FMIPA, IPB, dan berlangsung mulai bulan Juli 2007 hingga Januari Penelitian ini mendapatkan dana dari beasiswa BUD Pascasarjana Departemen Agama RI dan Program Insentif Ristek Terapan tahun Ucapan terima kasih yang tulus dan ikhlas penulis sampaikan kepada Dr. Nisa Racmania Mubarik M. Si. dan Dr. Aris Tri Wahyudi M. Si. atas kesediaan dan kesabarannya memberi bimbingan dalam penulisan tesis ini. Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada Prof. Dr. Ir. Iswandi Anas sebagai dosen penguji dalam ujian tesis atas saran dan masukan yang diberikan. Dalam kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih dan penghargaan pula kepada suami tercinta Mas Arief, anak-anak tersayang Fira, Fikri, dan Faisal atas segala pengorbanan, motivasi, dan kasih sayangnya, Kepala Madrasah dan rekan-rekan guru MAN Jombang, serta para teknisi dan rekanrekan sesama peneliti di Laboratorium Mikrobiologi. Penulis berharap semoga tesis ini bermanfaat. Bogor, Mei 2008 Hanum Habibah

12 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Banyuwangi, 8 Januari 1970, yang merupakan putri keduabelas dari tiga belas bersaudara pasangan ayahanda alm. H. Dardiri dan ibunda alm. Hj. Latifah. Pada tahun 1991 penulis menikah dengan Drs. Dj. Arief Effendi dan dikaruniai tiga orang anak, Fathiya Rachma Arfira (15), Nauval Fikri Fuady (14), dan Faisal Hanif Burhani (7). Pendidikan yang telah ditempuh adalah di SDN Setail 1 Banyuwangi lulus tahun 1982, kemudian SMPN 1 Genteng Banyuwangi lulus tahun 1985, dan SMAN 1 Genteng Banyuwangi lulus tahun Pendidikan tinggi ditempuh di Institut Keguruan dan Ilmu Pendidikan (IKIP) Negeri Malang Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FPMIPA) jurusan pendidikan Biologi D3 melalui jalur PMDK lulus tahun Pendidikan sarjana S1 ditempuh pada perguruan tinggi yang sama lulus tahun Sejak tahun 1994 sampai 2004 penulis bekerja sebagai Pegawai Negeri Sipil sebagai guru Biologi di Madrasah Tsanawiyah Negeri Model Pare Kediri dan sejak tahun 2005 penulis menjadi guru Biologi di Madrasah Aliyah Negeri 1 Jombang. Saat ini penulis mendapatkan beasiswa dari Departemen Agama RI untuk melanjutkan pendidikan pada Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor Departemen Biologi.

13 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR... DAFTAR LAMPIRAN... PENDAHULUAN Latar Belakang... Tujuan Penelitian... TINJAUAN PUSTAKA Kedelai Toleran Asam... Bakteri Bintil Akar... Pembentukan Bintil Akar... Toleransi Bakteri Bintil Akar terhadap Cekaman Lingkungan Asam... Penambatan Nitrogen... Efektivitas Simbiotik... xiii xiv xv BAHAN DAN METODE Peremajaan Galur Uji... Inokulasi pada Biji Kedelai... Rancangan Percobaan... Pemeliharaan Tanaman dan Pemungutan Hasil... Uji Aktivitas Nitrogenase... Uji Efektivitas Simbiotik... Uji N Total Tanaman... HASIL Peremajaan Galur Uji... Jumlah Bintil... Berat Kering Bintil... Tinggi Tanaman... Aktivitas Nitrogenase... Berat Kering Bagian Atas... Efektivitas Simbiotik... Serapan N... PEMBAHASAN... KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan... Saran

14 DAFTAR PUSTAKA... LAMPIRAN

15 DAFTAR TABEL Halaman 1 2 Pengaruh inokulasi B. japonicum pada tanaman kedelai varietas Slamet pada umur 37 HST dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm terhadap beberapa parameter yang diuji... Pengaruh inokulasi B. japonicum pada tanaman kedelai varietas Slamet pada umur 37 HST dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,0 + Al 50 μm terhadap beberapa parameter yang diuji

16 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Penampilan pertumbuhan B. japonicum hasil penggoresan pada media YMA + merah kongo 0,0025% + Rif 50 μg/ml, yang diinkubasi 10 hari pada suhu ruang Pengaruh inokulasi B. japonicum terhadap jumlah bintil akar tanaman kedelai varietas Slamet pada umur 37 HST dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Penampilan pola bintil akar kedelai hasil inokulasi dengan Bj 11 (19) pada tanaman kedelai varietas Slamet pada umur 37 HST dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Pengaruh inokulasi B. japonicum terhadap berat kering bintil akar tanaman kedelai varietas Slamet pada umur 37 HST dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Pengaruh inokulasi B. japonicum terhadap tinggi tanaman kedelai varietas Slamet pada umur 37 HST dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Penampilan tanaman kedelai berumur 35 hari dalam botol Leonard dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm (1) tanpa inokulasi, (2) yang diinokulasi Bj 11(19) Pengaruh inokulasi B. japonicum terhadap aktivitas nitrogenase tanaman kedelai varietas Slamet pada umur 37 HST dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Pengaruh inokulasi B. japonicum terhadap berat kering tanaman bagian atas tanaman kedelai varietas Slamet pada umur 37 HST dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Pengaruh inokulasi B. japonicum terhadap efektivitas simbiotik (ESN) tanaman kedelai varietas Slamet 37 HST dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Pengaruh inokulasi B. japonicum terhadap serapan N tanaman kedelai varietas Slamet pada umur 37 HST dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm... 23

17 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Komposisi media yeast extract mannitol agar (YMA) dan yeast extract mannitol broth (YMB) untuk 1000 ml media (Somasegara & Hoben 1994) Komposisi larutan hara bebas N menurut Alva et al. (1988) untuk penyediaan 1000 ml media Korelasi antara berat kering bintil dengan berat kering tanaman bagian atas (BKTBA) tanaman kedelai varietas Slamet 37 HST hasil inokulasi beberapa galur uji bakteri B. japonicum dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Korelasi antara jumlah bintil dengan aktivitas nitrogenase tanaman kedelai varietas Slamet 37 HST hasil inokulasi beberapa galur uji bakteri B. japonicum dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Korelasi antara berat kering bintil dengan aktivitas nitrogenase tanaman kedelai varietas Slamet 37 HST hasil inokulasi beberapa galur uji bakteri B. japonicum dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Korelasi antara serapan N dengan berat kering tanaman bagian atas Tanaman kedelai varietas Slamet 37 HST hasil inokulasi beberapa galur uji bakteri B. japonicum dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Korelasi antara berat kering bintil dengan serapan N tanaman kedelai varietas Slamet 37 HST hasil inokulasi beberapa galur uji bakteri B. japonicum dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Korelasi antara serapan N dengan tinggi tanaman kedelai varietas Slamet 37 HST hasil inokulasi beberapa galur uji bakteri B. japonicum dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Korelasi antara efektivitas simbiotik (ESN) dengan berat kering tanaman bagian atas tanaman kedelai varietas Slamet pada umur 37 HST hasil inokulasi beberapa galur uji bakteri B. japonicum dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5+Al50 μm... 42

18 10 Korelasi antara berat kering bintil dengan efektivitas simbiotik (ESN) tanaman kedelai varietas Slamet pada umur 37 HST hasil inokulasi beberapa galur uji bakteri B. japonicum dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Korelasi antara efektivitas simbiotik (ESN) dengan serapan N tanaman kedelai varietas Slamet pada umur 37 HST hasil inokulasi beberapa galur uji bakteri B. japonicum dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Korelasi antara efektivitas simbiotik (ESN) dengan tinggi tanaman kedelai varietas Slamet pada umur 37 HST hasil inokulasi beberapa galur uji bakteri B. japonicum dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Sidik ragam pengaruh inokulasi beberapa galur B. japonicum terhadap jumlah bintil tanaman kedelai pada umur 37 HST menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Sidik ragam pengaruh inokulasi beberapa galur B. japonicum terhadap berat kering bintil tanaman kedelai pada umur 37 HST menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Sidik ragam pengaruh inokulasi beberapa galur B. japonicum terhadap tinggi tanaman kedelai pada umur 37 HST menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Sidik ragam pengaruh inokulasi beberapa galur B. japonicum terhadap aktivitas nitrogenase tanaman kedelai pada umur 37 HST menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Sidik ragam pengaruh inokulasi beberapa galur B. japonicum terhadap berat kering tanaman bagian atas tanaman kedelai pada umur 37 HST menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Sidik ragam pengaruh inokulasi beberapa galur B. japonicum terhadap efektivitas simbiotik (ESN) tanaman kedelai pada umur 37 HST menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Sidik ragam pengaruh inokulasi beberapa galur B. japonicum terhadap efektivitas simbiotik* tanaman kedelai pada umur 37 HST menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm Sidik ragam pengaruh inokulasi beberapa galur B. japonicum terhadap serapan N tanaman kedelai pada umur 37 HST menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm... 46

19

20 PENDAHULUAN Latar Belakang Kedelai merupakan salah satu makanan penting yang dikonsumsi oleh penduduk Indonesia. Namun sampai sekarang ini produksi kedelai nasional masih rendah dan tidak mampu memenuhi kebutuhan di dalam negeri. Hal ini menyebabkan impor kedelai masih tinggi. Tercatat dari BPS (2006) produksi kedelai pada tahun 2006 sebanyak 783,554 ton, sementara konsumsi penduduk sebanyak 2 juta ton. Untuk menurunkan angka impor bahkan lebih dari itu agar swasembada kedelai dapat tercapai, sangat mungkin diupayakan melalui usaha pemanfatan lahan masam yang masih sangat luas di Indonesia dipadukan dengan pemanfaatan mikrob tanah yang tepat dan efektif. Lahan diberdayakan dengan menanam kedelai agar produktivitasnya tinggi. Kedelai yang ditanam dan mikrob simbion harus toleran asam. Salah satu varietas kedelai yang toleran asam ialah varietas Slamet (Somantri 2003). Tanah masam merupakan faktor pembatas dan banyak menimbulkan masalah produksi pertanian (Watkin et al. 1997). Hal ini karena kemasaman tanah dapat menurunkan produktivitas tanaman dan mempengaruhi mikrob tanah yang merupakan penyokong pertumbuhan tanaman (Tiwari et al. 1992). Tanah masam yang memiliki kandungan fosfor yang rendah dan aluminium yang tinggi (Keyser & Munns 1979) sangat menghambat bakteri yang bersimbiotik dengan tanaman legum dalam membentuk bintil dan memfiksasi N 2 seperti Azorhizobium, Bradyrhizobium, dan Rhizobium (Perret et al. 2000). Richardson et al. (1988) melaporkan ph rendah dan ketidakseimbangan ion seperti defisiensi kalsium (Ca) dan toksisitas aluminium (Al) menyebabkan pertumbuhan Rhizobium sp. dan infeksi akar legum menjadi terhambat. Tersedianya nitrogen yang cukup merupakan salah satu kunci keberhasilan dalam usaha meningkatkan produktivitas tanaman kedelai. Tanaman kedelai pada umumnya mengambil nitrogen dari udara melalui penambatan N 2 bersimbiosis dengan bakteri Rhizobium. Bakteri yang bersimbiosis ini ialah bakteri bintil akar tumbuh lambat. Bila simbiosis berlangsung baik, akan terbentuk bintil akar yang efektif, dan dapat menambat nitrogen dari udara. Bradyrhizobium japonicum

21 2 merupakan salah satu spesies bakteri bintil akar (BBA) tumbuh lambat yang berperan penting dalam meningkatkan produktivitas tanaman kedelai. Di dalam bintil, BBA mengubah nitrogen menjadi amonia sebagai suplai nitrogen bagi pertumbuhan tanaman (Atlas & Bartha 1998). Secara umum bakteri tumbuh lambat B. japonicum lebih toleran ph rendah dibandingkan bakteri tumbuh cepat Rhizobium. Banyak galur B. japonicum dan beberapa anggota R. leguminosarum diketahui toleran pada ph 4,0-4,5 (Tiwari et al. 1992). Inokulasi galur B. japonicum tersebut pada tanaman kedelai dapat meningkatkan kemampuan bertahan dan dapat menodulasi tanaman pada kondisi asam dan aluminium (asam-al). Simbiosis antara tanaman kedelai dengan bakteri simbion dalam kemampuannya menambat N 2 disebut efektivitas simbiotik. Monasari (2007) telah mengkonstruksi beberapa galur B. japonicum toleran asam-al dengan efektivitas simbiotik yang meningkat melalui mutagenesis dengan transposon. Dari hasil penelitian tersebut diperoleh galur-galur mutan yang mempunyai kemampuan membentuk bintil akar lebih banyak daripada tipe liarnya. Mutan tersebut yaitu Bj 11 (5), Bj 11 (19), dan Bj 11 (20) serta KDR 15 (37), semua toleran pada ph 4,5 serta galur yang mempunyai efektivitas simbiotik yang lebih tinggi daripada tipe liarnya pada tanaman kedelai Tanggamus toleran asam-al yaitu Bj 11 (20) ph 4,5, KDR 15 (37) ph 4,0, dan KDR 15 (27) ph 4,0. Penambatan nitrogen merupakan hal yang sangat penting di alam dan di bidang pertanian. Harga pupuk nitrogen yang mahal telah menggiatkan penelitian tentang hal ini pada akhir 1980-an dan awal 1990-an (Salisbury & Ross 1995). Penelitian tentang efektivitas galur-galur BBA toleran asam-al masih terbuka luas untuk dikembangkan sebagai usaha untuk mendapatkan galur harapan yang memiliki efektivitas penambatan N 2 yang tinggi sebagai alternatif untuk mencukupi kebutuhan pupuk N. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan menguji efektivitas simbiotik sepuluh galur B. japonicum toleran asam-al pada tanaman kedelai varietas Slamet serta mendapatkan galur harapan untuk kedelai varietas Slamet yang juga bersifat toleran asam.

22 3 TINJAUAN PUSTAKA Kedelai Toleran Asam Tanaman kedelai (Glycine max Linn. Merrill) tergolong subfamili Papilionoideae, famili Leguminosae. Tanaman dalam subfamili ini umumnya mempunyai kemampuan bersimbiosis dengan bakteri bintil akar untuk menambat nitrogen dari udara dengan membentuk organ simbiosis berupa bintil akar. Hal ini merupakan ciri khas tanaman pepolongan dalam upaya menaikkan produksinya (Yutono 1985). Dalam usaha meningkatkan produksi kedelai pemerintah telah melepas beberapa jenis unggul antara lain varietas Slamet yang dilepas tahun Kedelai varietas Slamet merupakan hasil persilangan antara varietas Wilis dan Dempo. Varietas ini memiliki kadar lemak 15% dan kandungan protein 34%. Karakteristik varietas ini memiliki tinggi tanaman 65 cm, hipokotil dan epikotil berwarna ungu, daun berwarna hijau, warna biji kuning, kulit polong masak berwarna coklat, bulu juga berwarna coklat. Tipe tumbuh determinat, mulai berbunga pada umur 37 hari setelah tanam dan polong masak pada umur 87 hari setelah tanam. Keunggulan varietas ini yaitu sesuai untuk tanah masam, tahan rebah, cukup tahan terhadap penyakit karat, dan produksi di tanah tidak masam dapat mencapai 2,26 ton/ha (Somantri 2003). Bakteri Bintil Akar Legum merupakan suatu kelompok tanaman yang memiliki nilai ekonomi penting, seperti kedelai, buncis, dan kapri. Infeksi akar tanaman legum oleh spesies yang cocok dengan salah satu genus Rhizobium mengarah pada pembentukan bintil akar sebagai bentuk simbiosis dan dapat menambat nitrogen. Kira-kira 90% dari seluruh spesies tanaman legum dapat mengalami nodulasi. Namun, terdapat kespesifikan antara legum dan galur Rhizobium. Suatu galur Rhizobium umumnya dapat menginfeksi spesies legum tertentu dan tidak pada spesies lainnya. Meskipun galur Rhizobium mampu menginfeksi legum tertentu, tetapi tidak selalu dapat menghasilkan bintil efektif yang memfiksasi nitrogen (Madigan et al. 2000)

23 4 Bakteri bintil akar merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang dengan ukuran panjang 1,2-3,0 dan lebar 0,5-0,9 µm. Tidak membentuk endospora dan umumnya bergerak dengan flagela polar dan subpolar. Dalam lingkungan pertumbuhan yang kurang baik akan membentuk pleomorfik. Sel tersebut kadang-kadang mengandung butiran poli β-hidroksibutirat yang berfungsi sebagai cadangan makanan (Holt et al. 1994). Koloni B. japonicum berbentuk bundar, berelevasi cembung, biasanya jarang sekali tembus cahaya, berwarna putih, teksturnya bergranula dan berdiameter tidak lebih dari 1 mm serta memiliki waktu generasi 6-8 jam pada media YMA (Holt et al. 1994). Pertumbuhan optimum berlangsung pada kisaran suhu ο C. ph optimum terletak pada kisaran 6-7, tetapi ph optimum ini dapat lebih rendah lagi pada galur-galur bakteri dari tanah masam (Holt et al. 1994). Rhizobium memiliki ciri-ciri tumbuh cepat pada medium garam yang mengandung manitol dengan waktu inkubasi 3-5 hari, sehingga sering disebut bakteri tumbuh cepat. Sebaliknya, Bradyrhizobium tumbuh lambat pada medium yang sama dengan waktu inkubasi 5-7 hari (Holt et al. 1994). Bakteri bintil akar hidup secara aerob dan bersifat kemoorganotrof dengan memanfaatkan beberapa macam karbohidrat. Pertumbuhan pada media yang mengandung karbohidrat biasanya diikuti dengan pembentukan lendir polisakarida ekstraseluler. Sebagai sumber nitrogen dapat digunakan garam-garam amonium, nitrat dan sebagian besar asam amino (Holt et al. 1994). Menurut Holt et al. (1994) dalam sistematika bakteri, bakteri bintil akar diklasifikasikan ke dalam genus Rhizobium dan Bradyrhizobium. Secara umum genus Rhizobium mempunyai ciri-ciri utama tumbuh cepat pada media YMA, bereaksi asam pada medium garam mineral, DNA mengandung 59-64% G+C dan membentuk bintil terutama pada akar pepolongan di daerah beriklim sedang. Bradyrhizobium mempunyai ciri-ciri utama tumbuh lambat, bereaksi basa, DNA mengandung 61-65% G+C dan membentuk bintil pada akar pepolongan di daerah beriklim tropis dan beberapa tanaman subtropis. Tanaman kedelai yang dibudidayakan biasanya bersimbiosis dengan B. japonicum (Jordan 1984). Bakteri bintil akar umumnya kurang dapat menyerap warna pada medium yang mengandung pewarna merah kongo 0,0025% jika diinkubasi di tempat

24 5 gelap, tetapi ada beberapa yang dapat menyerapnya jika diinkubasi pada tempat yang terang atau terkena sinar matahari langsung lebih dari 1 jam. Pertumbuhan koloni yang sudah tua pada media ini menunjukkan bagian tengah koloni yang berwarna lebih gelap daripada koloni yang masih muda ( Somasegaran & Hoben 1994). Pembentukan Bintil Akar Pembentukan bintil akar pada akar tanaman legum secara umum melalui tahap-tahap sebagai berikut : (i) pengenalan terhadap pasangan yang sesuai pada bagian tanaman serta pelekatan bakteri ke rambut-rambut akar, (ii) penyerbuan rambut-rambut akar oleh bakteri melalui pembentukan benang-benang infeksi, (iii) perjalanan bakteri ke akar utama melalui benang infeksi, (iv) pembentukan bakteri di dalam sel tanaman yang dinamakan bakteroid, dan (v) pembelahan sel tanaman dan bakteri yang terus-menerus dan akan menghasilkan bintil akar yang dewasa (Madigan et al. 2000). Pembentukan bintil oleh BBA diawali dengan infeksi akar tanaman inang melalui proses bertahap. Akar tanaman pepolongan mengeluarkan bahan organik untuk menarik mikroorganisme di sekitar perakaran termasuk BBA. Pelekatan BBA dengan akar pepolongan tergantung dari makromolekul pada permukaan rambut akar yang berinteraksi dengan polisakarida BBA. Makromolekul tersebut ialah lektin. Rambut akar selanjutnya melengkung, kemudian bakteri masuk membentuk benang infeksi. Sel-sel akar yang berdekatan menjadi terinfeksi BBA. Sel yang terinfeksi terangsang membelah. Bakteri dalam sel tanaman membelah, berganda, menggembung membentuk sel yang tidak beraturan dan bercabang yang disebut bakteroid. Bakteroid dikelilingi membran sel tanaman yaitu membran simbiosom dan fiksasi nitrogen mulai terjadi (Madigan et al. 2000). Toleransi Bakteri Bintil Akar terhadap Cekaman Lingkungan Asam Simbiosis Rhizobium-Legum dipengaruhi oleh penurunan ph tanah. Penurunan ph tanah dapat menimbulkan peningkatan konsentrasi proton, kelarutan logam seperti aluminium yang bersifat toksik terhadap bakteri bintil akar. Respon bakteri bintil akar terhadap tanah masam tergantung pada interaksi

25 6 sejumlah faktor seperti konsentrasi H +, aktivitas Al 3+, dan kemampuan kompetisi dan persistensi dari galur Rhizobium (Tiwari et al. 1992). Secara umum bakteri tumbuh lambat B. japonicum lebih toleran ph rendah dibandingkan bakteri tumbuh cepat Rhizobium. Banyak galur B. japonicum dan beberapa galur R. leguminosarum diketahui toleran pada ph 4,0-4,5 (Tiwari et al. 1992). Beberapa galur B. japonicum toleran terhadap konsentrasi aluminium yang cukup tinggi sekitar 50 µm yang dibuktikan dengan kemampuanya tumbuh pada media Ayanaba (Endarini et al. 1995), tetapi tidak semua rhizobia toleran asam juga toleran Al tinggi (Keyser & Munns 1979). Galur-galur dengan koloni yang lebih berlendir pada umumnya lebih bersifat toleran pada kondisi cekaman asam-al dibandingkan galur yang lebih kering (Ayanaba et al. 1983). Lendir yang dihasilkan merupakan karbohidrat permukaan sel yang sebagian besar berupa polisakarida ekstraseluler (EPS) yang diproduksi sebagai fungsi toleransi asam (Lounch & Miller 2000). Watkin et al. (1997) juga melaporkan beberapa galur R. leguminisarum dapat memproduksi EPS dalam jumlah besar bila ph media turun menjadi 5,0. Cunningham dan Munns (1984) menambahkan bahwa produksi eksopolisakarida dari Rhizobium merupakan suatu strategi untuk menetralkan kondisi lingkungan yang asam dan efek keracunan Al. Penambatan Nitrogen Tanaman legum seperti kedelai telah lama dikenal dapat menambat N 2 untuk mencukupi kebutuhan nitrogen. Penambatan dilakukan melalui simbiosis dengan bakteri bintil akar dan membentuk bintil akar (Yutono 1985). Kurang lebih 80% udara terdiri atas gas nitrogen dalam bentuk N 2 yang tidak dapat digunakan langsung oleh tanaman. Proses penambatan N 2 oleh tanaman legum tergolong proses biokimia kompleks. Keberhasilannya dipengaruhi oleh banyak faktor diantaranya keserasian BBA dengan tanaman inang, tingkat kesuburan tanah, ph tanah, dan ketersediaan unsur-unsur tertentu dalam tanah. Tanah yang tingkat kesuburannya sangat rendah dan miskin hara P, serta memiliki ph tanah yang sangat rendah akan mempengaruhi perkembangan BBA. ph tanah yang rendah umumnya bersamaan dengan kekurangan unsur Ca, P, dan Mo serta

26 7 kecenderungan terjadinya keracunan oleh Al dan Mn. Sedangkan ketersedian unsur Ca, Mg, P, dan Mo mutlak diperlukan untuk penambatan nitrogen (Yutono 1985). Penambatan N 2 secara simbiotik berkaitan dengan aktivitas enzim nitrogenase, hidrogenase dan protein leghemoglobin (Madigan et al. 2000). Nitrogenase merupakan suatu sistem enzim yang terdapat di dalam bakteroid, berfungsi mengkatalisis penambatan N 2 dan merupakan kompleks yang tersusun atas dua komponen logam-protein yakni MoFe-protein dan Fe-protein. Salah satu komponen protein ini disebut molibdoferedoksin atau dinitrogenase atau komponen I untuk menyatakan MoFe-protein, dan azoferedoksin atau dinitrogenase-reduktase atau komponen II untuk menyatakan Fe-protein (Madigan et al. 2000). Kedua komponen protein dibutuhkan bersama-sama untuk aktivitas katalisis nitrogenase dan masing-masing tidak aktif bila berdiri sendiri. Nitrogenase membutuhkan ATP dan reduktor potensial rendah untuk aktivitasnya. Reduktor berasal dari feredoksin atau flavodoksin (Madigan et al. 2000). Sumber energi penambatan nitrogen pada bakteroid tergantung sepenuhnya pada fotosintat tanaman inang yang ditranspor melalui membran simbiosom dalam bentuk produk senyawa antara dari siklus asam trikarboksilat (siklus Krebs) yaitu asam suksinat, fumarat, dan malat yang merupakan donor elektron untuk menghasilkan ATP dan mereduksi N 2. Asam piruvat merupakan reduktan yang terlibat langsung sebagai donor elektron dalam sistem nitrogenase (Madigan et al. 2000). Reaksi penambatan N 2 yang terjadi di dalam bakteroid menurut Werner (1992) sebagai berikut: nitrogenase N 2 + 8e + 8H MgATP > 2NH 3 + H MgADP + 16 Pi Dalam proses penambatan nitrogen enzim nitrogenase menggunakan 16 ATP. Untuk mereduksi satu molekul N 2 menjadi dua molekul NH 3 dibutuhkan 12 ATP dan 4 ATP selebihnya digunakan untuk mereduksi H + menjadi H 2. Ion Mg + yang berikatan dengan ATP dibutuhkan agar nitrogenase dapat berfungsi. Selain dapat mereduksi ikatan rangkap tiga dari molekul N 2 menjadi amonia, enzim nitrogenase dapat pula mereduksi molekul lain yang juga memiliki ikatan rangkap

27 8 tiga seperti asetilen, sianida, nitrat oksida, dan metil isosianida (Somasegaran & Hoben 1994). Aktivitas nitrogenase akan terhambat apabila terdapat oksigen, namun oksigen juga diperlukan dalam respirasi aerob B. japonicum untuk menghasilkan ATP yang mendukung aktivitas nitrogenase. Adanya leghemoglobin yang terdapat dalam sitoplasma sel nodul dapat mengendalikan keadaan ini. Leghemoglobin mampu mengikat O 2 dengan cepat sekaligus mengendalikan O 2 pada taraf yang tidak mengganggu aktivitas nitrogenase (Madigan et al. 2000). Efektivitas Simbiotik Efektivitas simbiotik (ES) adalah kemampuan relatif simbiosis antara tanaman dengan bakteri untuk mengasimilasi N 2. Nilai ES dapat diperoleh dengan membandingkan bobot kering tanaman yang diinokulasi galur uji dengan bobot kering tanaman kontrol nitrat atau tanaman yang diinokulasi galur standar (Gibson 1980). Efektivitas simbiotik dapat dievaluasi dengan beberapa cara, antara lain dengan penetapan bobot kering tanaman, kandungan N total dan aktivitas nitrogenase (Somasegaran & Hoben 1994). Somasegaran dan Hoben (1994) menambahkan, bahwa bobot kering tanaman biasanya sangat berkorelasi dengan bobot kering bintil akar. Untuk menentukan ES suatu galur sehingga diperoleh hasil yang mantap diperlukan beberapa kali pengujian statistik karena kondisi yang tidak selalu sama. Gibson (1980) menyatakan secara umum diperlukan lima kali pengujian dan hasil yang didapat lebih baik lagi jika diuji lebih dari lima kali.

28 9 BAHAN DAN METODE Galur B. japonicum yang digunakan ialah galur tipe liar Bj 11 (wt), KDR 15 (wt) toleran asam-al koleksi Tedja Imas, galur mutan Bj 11 (5), Bj 11 (19), Bj 11 (20), KDR 15 (37), KDR 15 (27) toleran asam-al koleksi Dewi Monasari, dan galur tipe liar Bj 13 (wt) sensitif asam-al koleksi Rita Fitri yang disimpan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, FMIPA, IPB. Galur acuan menggunakan galur USDA 110. Galur Bj 11 (wt), KDR 15 (wt), Bj 13 (wt), Bj 11 (5), Bj 11 (19), Bj 11(20), KDR 15 (37), dan USDA 110 diinokulasikan pada tanaman kedelai varietas Slamet menggunakan larutan hara ph 4,5. Galur KDR 15 (wt) dan KDR 15 (37) juga diinokulasikan pada kedelai varietas Slamet menggunakan larutan hara ph 4,0. Galur KDR 15 (27) diinokulasikan pada kedelai varietas Slamet menggunakan larutan hara ph 4,0. Biji kedelai yang digunakan adalah biji kedelai varietas Slamet toleran asam yang dibeli dari Balitbiogen Bogor. Peremajaan Galur Uji Peremajaan B. japonicum dilakukan dengan menumbuhkan sejumlah koloni galur dari biakan stok ke dalam media yeast extract mannitol agar (YMA) (Lampiran 1), yang ditambah merah kongo 0,0025% + rifampisin (Rif) 50 µg/ml menggunakan teknik goresan kuadran kemudian diinkubasi dalam ruang gelap (tanpa cahaya) pada suhu ruang selama 5-7 hari. Bradyrhizobium japonicum telah diketahui resisten terhadap rifampisin (Wahyudi 1996). Koloni terpisah yang diperoleh dipindahkan masing-masing ke media agar-agar miring YMA sebagai biakan kerja. Untuk membuat inokulum, sebanyak satu lup galur B. japonicum diremajakan dalam 20 ml media YMB (Lampiran 1) selama 7 hari di atas mesin penggoyang 140 rpm pada suhu 25 ο C. Jumlah sel dari inokulum dihitung dengan menggunakan hemasitometer Neubauer dan kepekatan yang diinginkan yaitu 10 8 sel/ml.

29 10 Inokulasi pada Biji Kedelai Biji kedelai yang mempunyai ukuran seragam, tidak luka, tidak keriput dan tidak terapung dalam air dipilih untuk dikecambahkan. Disinfeksi permukaan biji dengan cara merendam di dalam larutan alkohol 95% selama 10 detik, kemudian dalam H 2 O 2 5% selama 5 menit, selanjutnya dibilas dengan akuades steril sebanyak tujuh kali. Biji-biji tersebut dikecambahkan dalam cawan petri steril yang beralaskan kapas dan kertas merang basah selama dua hari pada suhu ruang dalam ruang tanpa cahaya. Kecambah yang berumur dua hari selanjutnya ditanam dalam botol Leonard. Botol Leonard modifikasi terdiri atas dua botol kecap volume 700 ml. Salah satu botol dipotong pada bagian dasarnya dan digunakan untuk media penumbuhan yang berisi pasir dan arang. Botol lainnya dipotong pada bagian leher dan digunakan sebagai tandon untuk larutan hara. Masing-masing botol diisi 300 ml larutan hara bebas N ph 4,5 dan ph 4,0 menurut Alva et al. (1988) (Lampiran 2) dan 100 ml disiramkan ke atas campuran pasir dan arang. Pasir yang digunakan sebelumnya diayak dan dicuci dengan air bersih sebanyak 10 kali kemudian dikeringkan. Arang yang digunakan ialah tumbukan arang batok kelapa. Perbandingan pasir dan arang ialah 3:1 dan setiap botol diisi 480 gram. Botol bagian atas ditutup dengan aluminium foil. Selanjutnya seluruh botol ditutup dengan kertas semen dan dilakukan sterilisasi pada suhu 121 ο C selama 2 jam. Biji kedelai yang dikecambahkan ditanam pada media pasir arang dengan tandon yang berisi larutan hara dalam botol Leonard. Untuk tiap botol ditanam tiga kecambah dan diulang sebanyak tiga kali. Kecambah yang telah berumur 2 hari dalam botol Leonard diinokulasi dengan suspensi B. japonicum mutan atau tipe liarnya sebanyak 1 ml dengan kepekatan 10 8 sel/ml. Permukaan botol selanjutnya ditutup kembali dengan aluminium foil dan diletakkan dalam ruangan pada suhu kamar selama 2-3 hari sampai bagian atas kecambah menyentuh aluminium foil dan selanjutnya botol tersebut diletakkan di rumah kaca. Setelah muncul daun pertama tanaman dijarangkan menjadi dua tanaman per botol. Larutan hara bebas N dan hara yang mengandung KNO 3 untuk kontrol N ditambahkan setiap dua hari sekali dan tanaman dipelihara hingga 37 hari setelah tanam (HST).

30 11 Rancangan Percobaan Percobaan rumah kaca dilakukan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) (Mattjik & Sumertajaya 2006) dengan tiga ulangan dengan persamaan liniernya ialah: Yij = µ + Тi + εij Dimana i = 1, 2, 3,..., 10 ( 7 perlakuan inokulasi dengan galur uji, 1 perlakuan inokulasi dengan galur acuan dan 2 perlakuan kontrol dan j = ulangan 1, 2, 3 Yij = pengamatan pada perlakuan ke-i, dan ulangan ke-j µ = rataan umum Тi = pengaruh perlakuan ke-i εij = Pengaruh acak pada perlakuan ke-i, ulangan ke-j i = 1, 2, 3,..., 10 ( 7 perlakuan inokulasi dengan galur uji, 1 perlakuan inokulasi dengan galur acuan dan 2 perlakuan kontrol j = ulangan 1, 2, 3 Perlakuan terdiri atas kegiatan inokulasi 7 galur uji dan 1 galur acuan pada tanaman kedelai varietas Slamet. Kontrol perlakuan adalah kontrol N0 yaitu tanpa inokulasi dan tanpa pemberian KNO 3 dalam larutan hara dan kontrol N yaitu tanpa inokulasi tetapi ditambahkan KNO 3 0,05 % dalam larutan hara. Kontrol N0 bertujuan untuk mengetahui kemampuan galur uji menginfeksi tanaman inang, kontrol N bertujuan untuk mengetahui ES galur uji dalam mensubstitusi N, dan penggunaan galur acuan bertujuan untuk mengetahui sejauh mana ES galur uji terhadap galur acuan. Larutan hara menggunakan ph 4,5. Untuk 2 galur uji yang dicoba dengan hara ph 4,0 tidak ada kontrol N0 dan kontrol N, tetapi hanya menggunakan galur acuan yaitu tipe liarnya. Parameter yang diukur ialah tinggi tanaman, berat kering tanaman bagian atas (BKTBA), berat kering bintil, jumlah bintil, serapan N tanaman (jumlah N total tanaman), aktivitas nitrogenase bintil akar, dan efektivitas simbiotik. Data yang dihasilkan dari perlakuan yang menggunakan ph 4,5 dianalisis secara statistik menggunakan program Statistical Analysis System (SAS). Sedangkan

31 12 data yang dihasilkan dari galur uji yang diberi perlakuan menggunakan ph 4,0 hanya dibandingkan dengan tipe liarnya. Pemeliharaan Tanaman dan Pemungutan Hasil Selama pertumbuhan tanaman kedelai di rumah kaca, secara teratur ditambahkan larutan hara steril ke dalam botol bagian bawah bila terlihat berkurang. Penambahan dilakukan dua hari sekali berkisar antara ml pada 7-15 HST. Pada HST penambahan larutan hara berkisar antara ml karena tanaman tumbuh semakin besar. Suhu menunjukkan kisaran ο C. Sejak 10 HST tanaman disemprot dengan fungisida Dithane sebanyak 1 g/l karena menunjukkan gejala terserang cendawan. Penyemprotan diulang satu minggu sekali. Tanaman yang telah berumur 37 HST diukur tingginya dan dipungut hasilnya. Pengukuran tinggi tanaman dihitung dari batas bekas kotiledon sampai titik tumbuh paling atas. Pemungutan hasil dilakukan dengan memotong tanaman pada batas bekas kotiledon untuk memisahkan tanaman bagian atas dan bagian akar. Bagian atas tanaman dimasukkan ke dalam kantung-kantung kertas untuk dikeringkan dalam oven. Bagian akar dikeluarkan dari botol dan dibersihkan secara hati-hati dari pasir dan arang yang melekat kemudian dicuci bersih. Selanjutnya dihitung jumlah bintil akarnya, dilap dengan kain bersih, kemudian dimasukkan ke dalam botol inkubasi untuk diukur aktivitas nitrogenasenya. Uji Aktivitas Nitrogenase Aktivitas nitrogenase diukur dengan pengukuran reduksi asetilen menggunakan kromatografi gas. Reduksi asetilen (C 2 H 2 ) menjadi etilen (C 2 H 4 ) menunjukkan aktivitas nitrogenase. Prinsip uji ini ialah mengukur konsentrasi gas C 2 H 4 yang terbentuk yang menunjukkan aktivitas reduksi asetilen (aktivitas nitrogenase). Pengukuran aktivitas nitrogenase dengan metode reduksi asetilen dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Tanah, Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Faperta, IPB. Bagian akar yang sudah dihitung jumlah bintilnya dimasukkan ke dalam botol inkubasi masing-masing dua akar tanaman dan

32 13 bintilnya dalam satu botol kemudian ditutup rapat dengan penutup karet. Tahap selanjutnya ialah pengambilan gas dari dalam botol sebanyak 2 ml dan menggantinya dengan menginjeksikan gas asetilen (C 2 H 2 ) sebanyak 2 ml. Botol diinkubasi selama 30 menit kemudian gas diambil 0,1 ml untuk diinjeksikan ke dalam kromatografi gas GC 17A Shimadzu masing masing tiga ulangan untuk semua perlakuan. Gas etilen (C H 2 4 ) contoh yang terbentuk dihitung konsentrasinya berdasarkan luas puncak (peak area) dan angka-angka yang tercetak pada kertas kromatogram yang nilainya dimasukkan ke dalam persamaan garis dari kurva standar gas etilen yang telah dikalibrasi (Anas & Muluk 2003). Aktivitas nitrogenase yang diukur ialah aktivitas nitrogenase total yaitu jumlah etilen yang terbentuk per jumlah tanaman per jam dalam satuan μmol. Setelah selesai pengukuran aktivitas nitrogenase, bintil akar dipisahkan dari akar kemudian dimasukkan ke dalam kantung-kantung kertas, dikeringkan dengan oven pada suhu 70 ο C selama 48 jam (Somasegaran & Hoben 1994) untuk diukur berat keringnya. Uji Efektivitas Simbiotik Parameter yang diukur dalam penentuan efektivitas simbiotik ialah berat kering tanaman bagian atas. Untuk mengukur berat kering tanaman bagian atas, tanaman dikeringkan dengan oven pada suhu 70 ο C selama 48 jam (Somasegaran & Hoben 1994). Penetapan berat kering dilakukan dengan menggunakan neraca analitik Denver-Instrument M-120. Masing masing perlakuan diulang sebanyak tiga kali. Nilai efektivitas simbiotik (ES) diperoleh dengan rumus (Gibson 1980) sebagai berikut: Berat kering tanaman yang diinokulasi galur uji ES = X 100% Berat kering tanaman yang diberi KNO 3 Berat kering tanaman yang diinokulasi galur uji ES = X 100% Berat kering tanaman yang diinokulasi galur acuan

33 14 Nilai ESN yaitu efektivitas simbiotik yang berasal dari BKTBA galur uji dibagi dengan BKTBA kontrol N diperoleh dari rata-rata BKTBA yang diinokulasi galur uji ulangan 1 dibagi dengan BKTBA kontrol N ulangan 1, BKTBA yang diinokulasi galur uji ulangan 2 dibagi dengan BKTBA kontrol N ulangan 2, dan BKTBA yang diinokulasi galur uji ulangan 3 dibagi BKTBA kontrol N ulangan 3. Nilai ES USDA 110 yaitu efektivitas simbiotik yang berasal dari BKTBA galur uji dibagi dengan BKTBA yang diinokulasi galur acuan USDA 110 diperoleh dari rata-rata BKTBA yang diinokulasi galur uji ulangan 1 dibagi dengan BKTBA yang diinokulasi USDA 110 ulangan 1, BKTBA yang diinokulasi galur uji ulangan 2 dibagi dengan BKTBA yang diinokulasi USDA 110 ulangan 2, dan BKTBA yang diinokulasi galur uji ulangan 3 dibagi BKTBA yang diinokulasi USDA 110 ulangan 3. Uji N Total Tanaman Jumlah N Total Tanaman biasa disebut sebagai jumlah N total tajuk. Endarini (1994) dan Gandanegara et al. (1997) memperoleh nilai N total tajuk dari persentase kandungan N tajuk dikalikan dengan berat kering tanaman bagian atas dengan satuan mg N tanaman -1. Anas & Mufriah (2004) menyebutnya sebagai serapan N yang memiliki satuan yang sama. Kandungan N total tanaman dapat diketahui dengan mengukur kandungan N pada berat kering tanaman bagian atas (BKTBA). Sebelum dianalisis, tanaman bagian atas dikeringkan menggunakan oven pada suhu 70 ο C selama 48 jam kemudian digiling. Hasil gilingan kemudian didestruksi hingga suhu 350 ο C selama 3-4 jam. Hasil destruksi berupa ekstrak jernih. Ekstrak didinginkan kemudian diencerkan dengan akuades, dikocok sampai homogen dibiarkan semalam agar partikel mengendap. Ekstrak digunakan untuk pengukuran N, setiap contoh diulang sebanyak tiga kali. Jumlah kandungan N ditentukan dengan metode Kjeldahl menggunakan spektrofotometer Auto Analyser 3 Bran Luebbe pada panjang gelombang 636 nm (Sulaeman et al. 2005). Pengukuran dilakukan di Balai Penelitian Tanah Bogor.

34 15 HASIL Peremajaan Galur Uji Seluruh galur uji tipe liar dan mutannya bercirikan khas bakteri bintil akar tumbuh lambat yaitu berbentuk bundar, elevasi cembung, berlendir, tembus cahaya, dan memiliki koloni dengan diameter > 1 mm (Gambar 1). 6 mm 6 mm 6 mm Bj 11 (wt) Bj 11 (19) Bj 11 (5) 6 mm 6 mm 6 mm KDR 15 (wt) KDR 15 (37) USDA 110 Gambar 1 Penampilan pertumbuhan B. japonicum hasil penggoresan pada media YMA + merah kongo 0,0025% + Rif 50 μg/ml, yang diinkubasi 10 hari pada suhu ruang. Jumlah Bintil Pengaruh inokulasi terhadap jumlah bintil per tanaman menunjukkan hasil yang beragam (Gambar 2, Tabel 1). Rata-rata jumlah bintil berkisar antara Bintil terbanyak dihasilkan oleh tanaman yang diinokulasi galur Bj 13 (wt) sensitif asam-al sebanyak 21 bintil. Sedangkan bintil yang paling sedikit dihasilkan oleh tanaman yang diinokulasi galur KDR15 (37) sebanyak 9 bintil. Rata-rata jumlah bintil dalam percobaan ini ialah 15 bintil. Ada lima galur dari tujuh galur yang dapat membentuk bintil di atas rata-rata yaitu Bj 11 (20), Bj 11

35 16 (19), Bj 11 (wt), Bj13 (wt), dan KDR15 (wt). Dua mutan Bj 11 yaitu Bj 11 (19) dan Bj 11 (20) dan tipe liarnya mampu membentuk bintil lebih banyak dari ratarata. Sedangkan mutan Bj 11 (5) dan galur acuan USDA 110 mampu membentuk bintil di bawah rata-rata. Di bandingkan dengan galur acuan ada lima galur yang memiliki jumlah bintil lebih banyak yaitu galur Bj 11 (20), Bj11 (19), Bj 11 (wt), Bj 13 (wt), dan KDR15 (wt). Letak bintil rata-rata terdapat pada akar sekunder. (Gambar 3). Bintil akar tidak dijumpai pada tanaman yang tidak diinokulasi. Untuk galur uji yang diinokulasikan pada tanaman kedelai dengan menggunakan ph 4,0 ternyata juga dapat membentuk bintil. Tanaman yang diinokulasi dengan ketiga galur uji menghasilkan jumlah bintil yang sama yaitu 18 bintil pertanaman (Tabel 2) Jumlah bintil (bintil tan -1 ) Bj 11 (20) Bj 11 (19) Bj 11 (5) Bj 11 (wt) Bj 13 (wt) Galur KDR15 (37) KDR15 (wt) USDA 110 N N0 Gambar 2 Pengaruh inokulasi B. japonicum terhadap jumlah bintil akar tanaman kedelai varietas Slamet pada umur 37 HST dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm. Keterangan N: tanpa inokulasi, hara ditambah KNO 3 0,05%, N0: tanpa inokulasi, hara tanpa KNO. 3

36 17 Bj 11 (19) 7,5 mm Gambar 3 Penampilan pola bintil akar kedelai hasil inokulasi dengan Bj 11 (19) pada tanaman kedelai varietas Slamet pada umur 37 HST dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm. Berat Kering Bintil Inokulasi B. japonicum pada tanaman kedelai varietas Slamet mampu meningkatkan berat kering bintil terhadap galur acuan (Gambar 4, Tabel 1). Kisaran bobot kering bintil ialah 0,0089 0,0440 g tan -1. Hasil tertinggi ditunjukkan oleh perlakuan dengan galur Bj 11 (5) sedangkan berat kering terendah ditunjukkan oleh perlakuan dengan galur KDR15 (37). Rata-rata berat kering bintil ialah 0,0314 g tan -1. Dari tujuh galur ada lima yang menunjukkan hasil di atas rata-rata yaitu perlakuan inokulum Bj 11 (5), Bj 11 (19) dan Bj 11 (20) yang semuanya mutan Bj 11 serta satu galur tipe liar Bj 11(wt), dan satu galur tipe liar KDR 15 (wt). Untuk galur acuan USDA 110 menunjukkan hasil di bawah rata-rata. Galur mutan KDR 15 (27) yang diuji menggunakan ph 4,0 ternyata memiliki berat kering bintil yang lebih tinggi dari tipe liarnya (Tabel 2). Tinggi Tanaman Perlakuan inokulasi dengan galur uji pada tanaman kedelai varitas Slamet, semua menunjukkan mampu meningkatkan tinggi tanaman dibandingkan dengan

37 Bj 11 (20) Bj 11 (19) Bj 11 (5) Bj 11(wt) Bj 13(wt) KDR15(37) KDR15(wt) USDA 110 Berat Kering Bintil (g tan -1 ) N N0 Galur Gambar 4 Pengaruh inokulasi B. japonicum terhadap berat kering bintil akar tanaman kedelai varietas Slamet pada umur 37 HST dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm. Tinggi tanaman (cm) Bj 11 (20) Bj 11 (19) Bj 11 (5) Bj 11 (wt) Bj 13 (wt) KDR15 (37) KDR15 (wt) USDA 110 N N0 Galur Gambar 5 Pengaruh inokulasi B. japonicum terhadap tinggi tanaman kedelai varietas Slamet pada umur 37 HST dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm.

38 19 kontrol N0. Bahkan jika dibandingkan dengan kontrol N ada 6 galur yang berbeda nyata (Gambar 5, Tabel 1). Tinggi tanaman berkisar antara 37,3 71,4 cm. Hasil terendah ditunjukkan oleh tanaman yang tidak diinokulasi (Gambar 6). Tanaman yang diinokulasi dengan KDR 15 (37) menunjukkan hasil terendah di antara galur uji. Tanaman yang memiliki ukuran tertinggi ditunjukkan oleh tanaman yang diinokulasi dengan Bj 11 (wt) tipe liar. Rata-rata tinggi tanaman ialah 58,3 cm. Semua perlakuan dengan mutan Bj 11 menunjukkan tinggi tanaman yang lebih besar dari rata-rata kecuali Bj 11 (20). Jika dibandingkan dengan galur acuan USDA 110 maka ada empat perlakuan yang memiliki rata-rata tinggi tanaman lebih besar yaitu perlakuan dengan galur Bj 11 (wt), Bj 11 (19), Bj 11 (5) dan KDR15 (wt). Tanaman yang diinokulasi dengan galur mutan KDR 15 (27) yang diuji menggunakan hara ph 4,0 memiliki tinggi yang lebih unggul dibandingkan tipe liarnya KDR 15 (wt) yaitu sebesar 67,5 cm (Tabel 2). 10 cm 1 2 Gambar 6 Penampilan tanaman kedelai berumur 35 hari dalam botol Leonard dengan menggunakan larutan hara bebas N ph 4,5 + Al 50 μm (1) tanpa inokulasi, (2) yang diinokulasi Bj 11(19).