PEMANFAATAN PULPA KAKAO UNTUK MEMPRODUKSI ASAM ASETAT DENGAN MENGGUNAKAN RAGI ROTI DAN AERASI MARGARETHA HAUMASSE

Transkripsi

1 PEMANFAATAN PULPA KAKAO UNTUK MEMPROUKSI ASAM ASETAT ENGAN MENGGUNAKAN RAGI ROTI AN AERASI MARGARETHA HAUMASSE SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

2 PERNYATAAN MENGENAI TESIS AN SUMBER INFORMASI engan ini saya menyatakan bahwa tesis Pemanfaatan Pulpa Kakao Untuk Memproduksi Asam Asetat engan Menggunakan Ragi Roti an Aerasi adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam aftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Januari 2009 Margaretha Haumasse NIM F

3 ABSTRACT MARGARETHA HAUMASSE. Cacao Pulp Exploitation to Produce Acetic Acid Using Yeast and Aeration. Under the direction of I WAYAN BUIASTRA and SUROSO Cacao is one of important export commodity for Indonesia. Most of exported cacao is in the form of cacao nut. Cacao processing from the fruit to cacao nut produced pulp. The cacao pulp might be processed to acetic acid since the pulp contains some sugar. The general objective of this research is to increase the cacao pulp process to produce acetic acid. The specific objective of research is to study the influence of sugar and yeast concentration to the production of alcohol and influence of aeration to the production of acetic acid from cacao pulp. The results showed that the sugar concentration of 15% and bread yeast of 20% could produce alcohol level of 10%, the minimum level for producing acetic acid. The optimum time of fermentation to produce alcohol level is 12 days. The highest acetic acid is obtained (4.31 %) with aeration treatment of 14 days. Key words: Cacao pulp, alcohol content, acetic acid contents, aeration treatment, yeast

4 RINGKASAN MARGARETHA HAUMASSE. Pemanfaatan Pulpa Kakao Untuk Memproduksi Asam Asetat engan Menggunakan Ragi Roti an Aerasi. ibimbing oleh I WAYAN BUIASTRA dan SUROSO (Alm). Kakao merupakan salah satu komoditas ekspor non migas yang cukup bekontribusi bagi perekonomian Indonesia. Potensi pengembangan kakao di Indonesia cukup besar, baik dari sumberdaya yang dimiliki, teknologi yang dikuasai, maupun peluang pasar yang terus berkembang pada masa yang akan datang. Total ekspor kakao Indonesia tahun 2006 sebesar ,53 ton dan nilainya mencapai ,12 ribu US$ (Statistik dan Informasi 2007). Pengolahan kakao mempunyai hasil sampingan, yang belum diperhatikan oleh masyarakat dan cenderung dianggap sebagai sampah atau limbah. Salah satu hasil sampingan yang diperoleh dari proses pengolahan awal kakao adalah pulpa. Pulpa kakao mengandung glukosa dan sukrosa antara 12-15%, asam-asam organik dan beberapa asam amino (Effendi 2002 dan Opeke 1984). Komposisi demikian cukup baik digunakan dalam proses fermentasi untuk menghasilkan asam asetat. Secara umum penelitian ini bertujuan untuk mempelajari pemanfaatan pulpa kakao sebagai bahan untuk memproduksi asam asetat. Sedangkan secara khusus penelitian ini bertujuan untuk 1) menentukan pengaruh konsentrasi gula dan starter ragi roti terhadap kadar alkohol. 2) menentukan waktu atau lama fermentasi yang optimum untuk menghasilkan kadar alkohol. 3) mempelajari pengaruh aerasi terhadap kadar asam asetat yang dihasilkan. Rancangan acak lengkap (RAL) digunakan dalam penelitian ini apabila terdapat perbedaan antar perlakuan dilanjutkan dengan uji uncan Multiple Range Test (MRT). Pada fermentasi alkohol pulpa kakao diencerkan 1 : 4 ditambahkan gula 5%, 10%, 15% dan starter ragi roti sebanyak 10% dan 20% (v/v). Pengamatan yang dilakukan pada tahap ini adalah pengukuran kadar alkohol, Total Padatan Terlarut (TPT) dan nilai ph, yang dilakukan pada hari ke- 0, 4, 8 dan 12. Selanjutnya alkohol yang terbentuk difermentasi lebih lanjut dengan menambahkan starter Acetobacter aceti (10% v/v) dengan perlakuan aerasi (dengan dan tanpa aerasi). Pengamatan yang dilakukan pada tahap ini adalah pengukuran kadar asam asetat, kadar alkohol, Total Padatan Terlarut (TPT) dan nilai ph, yang dilakukan pada hari ke- 0, 7, 14 dan 21. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi gula 15% dan starter ragi roti 20% diperoleh kadar alkohol sebanyak 10% pada hari ke-12. Selama fermentasi (hari ke-12) terjadi penurunan TPT (15.9% brix 6.4% brix) dan nilai ph ( ). Hasil asam asetat yang tertinggi adalah 4.31% dengan perlakuan aerasi selama 14 hari fermentasi dan akan menurun pada hari ke-21 yaitu 2.14% dan kadar alkohol mencapai 4 %. Perlakuan tanpa aerasi pada hari ke 14 menghasilkan asam asetat yaitu sekitar 2.63 % dan pada hari ke-21 menurun menjadi 1.71%. Penurunan kadar asam asetat ini disebabkan, karena asam asetat yang telah terbentuk dioksidasi lebih lanjut oleh A. aceti menjadi H 2 O dan CO 2. Total padatan terlarut selama fermentasi menurun dari 4.8% brix menjadi 2.0% brix (dengan aerasi) dan 6.4% brix menjadi 0.9% brix (tanpa aerasi). Nilai ph akan menurun pada hari ke-14 fermentasi. Penurunan ph disebabkan oleh akumulasi asam asetat yang dihasilkan selama proses fermentasi alkohol, dimana

5 semakin tinggi asam asetat yang dihasilkan, maka semakin rendah ph yang didapatkan dan produk yang dihasilkan juga semakin asam. Simpulan dari penelitian ini adalah 1) konsentrasi gula 15% dan starter ragi roti 20% dapat menghasilkan kadar alkohol sebanyak 10% dan merupakan kadar kondisi terbaik untuk dilanjutkan dalam fermentasi asam asetat. 2) dari kadar alkohol yang dihasilkan, maka waktu atau lama fermentasi yang optimum untuk menghasilkan kadar alkohol adalah pada hari ke-12. 3) dengan perlakuan aerasi, pada hari ke-14 diperoleh hasil asam asetat dengan kadar 4.31% sedangkan tanpa aerasi kadar asam asetat yang dihasilkan adalah 2.63%. Kata kunci : pulpa kakao, konsentrasi gula, alkohol, asam asetat, perlakuan aerasi

6 Hak cipta milik IPB, tahun 2009 Hak cipta dilindungi Undang-undang ilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB ilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

7 PEMANFAATAN PULPA KAKAO UNTUK MEMPROUKSI ASAM ASETAT ENGAN MENGGUNAKAN RAGI ROTI AN AERASI MARGARETHA HAUMASSE Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Teknologi Pascapanen SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

8 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : ra. Suliantari, MS.

9 Judul Tesis : Pemanfaatan Pulpa Kakao Untuk Memproduksi Asam Asetat engan Menggunakan Ragi Roti an Aerasi Nama : Margaretha Haumasse NIM : F isetujui Komisi Pembimbing r. Ir. I Wayan Budiastra, M.Agr. Ketua r. Ir. Suroso, M.Agr (Alm). Anggota iketahui Ketua Program Studi Teknologi Pascapanen ekan Sekolah Pascasarjana r. Ir. I Wayan Budiastra, M.Agr. Prof. r. Ir. Khairil A. Notodiputro, MS. Tanggal ujian : 21 Januari 2009 Tanggal lulus :

10 PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Kristus yang selalu memberikan Berkat dan AnugerahNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini dengan judul Pemanfaatan Pulpa Kakao Untuk Memproduksi Asam Asetat engan Menggunakan Ragi Roti an Aerasi. Terima kasih penulis ucapkan kepada r. Ir. I Wayan Budiastra, M.Agr dan r. Ir. Suroso, M.Agr (Alm) selaku komisi pembimbing yang telah bersedia meluangkan waktu untuk membimbing dan mengarahkan selama penulisan tesis. Terima kasih kepada ra. Suliantari, M.S atas kesediaannya untuk membantu dan mengarahkan penulis selama penelitian dan penulisan tesis serta kesediaannya selaku penguji luar komisi. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Prof. r. Ir. Hadi. K. Purwadaria, M.Sc yang telah memberikan bantuan sehingga penelitian ini dapat berjalan dengan baik. Ucapan terima kasih tak lupa penulis sampaikan kepada Beasiswa Yayasan Satyabhakti Widya dan Yayasan AMANIRI yang telah memberikan bantuan selama penelitian dan penulisan tesis. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada pegawai dan laboran pada Laboratorium TPG FATETA-IPB, teman-teman angkatan 2006 Almarhumah armayanti, ibu Ros, ibu Nona, Kakak eva dan Venty atas bantuan, oa dan semangat yang diberikan kepada penulis. Angkatan 2007 terutama buat mba Vera terima kasih atas bantuannya semoga kita semua tetap bersahabat dan menjadi saudara dalam suka dan duka. Ucapan terima kasih yang tak terhingga kepada Papa dan Mama, Kakak En serta Isteri, adik Ache, adik Aji dan tunanganku Andre juga keluarga besar Haumasse/Latumahina dan keluarga bpk. E. Pariury atas dukungan oa, semangat dan kasih sayangnya. Bagi semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu terima kasih atas bantuannya selama ini semoga sukses dan diberkati oleh Tuhan Yesus Kristus. AMIN. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi yang membutuhkannya. Bogor, Januari 2009 Margaretha Haumasse

11 RIWAYAT HIUP Penulis dilahirkan di Ambon pada tanggal 31 esember 1981 dari ayah rs. Jantje Haumasse, Msi dan ibu Oktovina Haumasse/Latumahina. Penulis merupakan anak kedua dari tiga bersaudara. Tahun 2000 penulis lulus dari SMU Negeri 2 Ambon. Pendidikan sarjana ditempuh di Program Studi Agronomi, Fakultas Pertanian, Universitas Pattimura, lulus pada tahun Pada tahun 2006 penulis diterima di Program Studi Teknologi Pascapanen Pascasarjana IPB.

12 AFTAR ISI AFTAR TABEL... AFTAR GAMBAR... AFTAR LAMPIRAN... Halaman PENAHULUAN Latar Belakang... 1 Tujuan Penelitian... 3 TINJAUAN PUSTAKA Pulpa Kakao... 4 Asam Asetat... 5 Fermentasi Alkohol... 6 Fermentasi Asam Asetat... 7 Mikroorganisme Yang Berperan alam Fermentasi... 8 Khamir... 8 Bakteri (Acetobacter aceti) Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Proses Fermentasi Karbohidrat (gula) Suhu ph Unsur Hara Kadar Alkohol Pengaruh Aerasi (oksigen) METOE PENELITIAN Waktu dan Tempat Bahan dan Alat Tahapan Penelitian Penyegaran Kultur Pembuatan Starter Starter Khamir Starter Acetobacter aceti Produksi Asam Asetat Fermentasi Alkohol Fermentasi Asam Asetat Peubah yang iukur Kadar Asam Asetat Kadar Alkohol Total Padatan Terlarut (TPT) Nilai ph Rancangan Percobaan Rancangan Percobaan untuk Fermentasi Alkohol Rancangan Percobaan untuk Fermentasi Asam Asetat HASIL AN PEMBAHASAN Fermentasi Alkohol xii xiii xiv

13 Kadar Alkohol Total Padatan Terlarut (TPT) Nilai ph Fermentasi Asam Asetat Kadar Asam Asetat Kadar Alkohol Total Padatan Terlarut (TPT) Nilai ph SIMPULAN AN SARAN AFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 45

14 AFTAR TABEL Halaman 1. Perkembangan asam asetat Indonesia Tahun Perubahan kadar alkohol pulpa kakao selama fermentasi Perubahan total padatan terlarut pulpa kakao selama fermentasi Perubahan nilai ph pulpa kakao selama fermentasi Perubahan kadar asam asetat pulpa kakao selama fermentasi Perubahan kadar alkohol pulpa kakao selama fermentasi Perubahan total padatan terlarut (TPT) selama fermentasi Perubahan nilai ph pulpa kakao selama fermentasi Klasifikasi keasaman berdasarkan nilai ph dan bahan pangan... 39

15 AFTAR GAMBAR Halaman 1 Penampang melintang buah kakao Penyegaran kultur A. aceti pada media cair iagram alir pembuatan starter Khamir (ragi roti) Pembuatan starter A. aceti iagram alir fermentasi alkohol Proses fermentasi asam asetat Grafik perubahan kadar alkohol pulpa kakao selama fermentasi Grafik perubahan total padatan terlarut pulpa kakao selama fermentasi Grafik perubahan nilai ph pulpa kakao selama fermentasi Grafik perubahan kadar asam asetat pulpa kakao selama fermentasi Grafik perubahan kadar alkohol pulpa kakao selama fermentasi Grafik perubahan total padatan terlarut pulpa kakao selama fermentasi fermentasi Grafik perubahan nilai ph pulpa kakao selama fermentasi... 38

16 AFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Analisis ragam pengaruh lama fermentasi dan konsentrasi gula serta starter terhadap kadar alkohol selama fermentasi alkohol Hasil uji lanjut uncan s untuk perubahan kadar alkohol selama fermentasi alkohol Analisis ragam pengaruh lama fermentasi dan konsentrasi gula serta starter terhadap total padatan terlarut (TPT) selama fermentasi alkohol Hasil uji lanjut uncan s untuk perubahan total padatan terlarut (TPT) selama fermentasi alkohol Analisis ragam pengaruh lama fermentasi dan konsentrasi gula serta starter terhadap nilai ph selama fermentasi alkohol Hasil uji lanjut uncan s untuk perubahan nilai ph selama fermentasi alkohol Analisis ragam pengaruh lama fermentasi dan perlakuan terhadap kadar asam asetat selama fermentasi asam asetat Hasil uji lanjut uncan s untuk perubahan kadar asam asetat selama fermentasi asam asetat Analisis ragam pengaruh lama fermentasi dan perlakuan terhadap kadar alkohol selama fermentasi asam asetat Hasil uji lanjut uncan s untuk perubahan kadar alkohol selama fermentasi asam asetat Analisis ragam pengaruh lama fermentasi dan perlakuan terhadap total padatan terlarut (TPT) selama fermentasi asam asetat Hasil uji lanjut uncan s untuk perubahan total padatan terlarut (TPT) selama fermentasi asam asetat Analisis ragam pengaruh lama fermentasi dan perlakuan terhadap nilai ph selama fermentasi asam asetat Hasil uji lanjut uncan s untuk perubahan nilai ph selama fermentasi asam asetat Perubahan kadar alkohol selama fermentasi alkohol Rata-rata perubahan kadar alkohol selama fermentasi alkohol Perubahan total padatan terlarut (TPT) selama fermentasi alkohol Rata-rata perubahan total padatan terlarut (TPT) selama fermentasi alkohol Perubahan nilai ph selama fermentasi alkohol... 71

17 20. Rata-rata perubahan nilai ph selama fermentasi alkohol Perubahan titrasi selama fermentasi asam asetat Perubahan berat sampel selama fermentasi asam asetat Perubahan titrasi dan berat sampel selama fermentasi asam asetat Rata-rata perubahan kadar asam asetat selama fermentasi asam asetat Perubahan kadar alkohol selama fermentasi asam asetat Rata-rata perubahan kadar alkohol selama fermentasi asam asetat Perubahan total padatan terlarut (TPT) selama fermentasi asam asetat Rata-rata perubahan total padatan terlarut (TPT) selama fermentasi asam asetat Perubahan nilai ph selama fermentasi asam asetat Rata-rata perubahan nilai ph selama fermentasi asam asetat... 82

18 I. PENAHULUAN A. Latar Belakang Kakao merupakan salah satu komoditas ekspor non migas yang cukup berkontribusi bagi perekonomian Indonesia. Potensi pengembangan kakao di Indonesia cukup besar, baik dari sumberdaya yang dimiliki, teknologi yang dikuasai, maupun peluang pasar yang terus berkembang pada masa yang akan datang. Total ekspor kakao Indonesia tahun 2006 sebesar ton dan nilainya mencapai ribu US$ (Statistik dan Informasi 2007). Tujuan pengembangan kakao di Indonesia adalah untuk memanfaatkan sumberdaya alam, memenuhi konsumsi dan meningkatkan pendapatan produsen serta meningkatkan devisa negara. Kakao telah lama dikenal dan dimanfaatkan oleh masyarakat dengan mengolahnya menjadi bahan minuman, penambah rasa, aroma dan bahan makanan. Selain itu lemaknya kakao digunakan untuk bahan kosmetik dan obat-obatan. Pengolahan kakao mempunyai hasil sampingan, yang belum diperhatikan oleh masyarakat dan cenderung dianggap sebagai sampah atau limbah. Salah satu hasil sampingan yang diperoleh dari proses pengolahan awal kakao adalah pulpa. Pulpa merupakan lapisan berwarna putih yang melapisi permukaan biji kakao. Pulpa dapat dimanfaatkan untuk menghasilkan asam asetat, dengan cara pulpa tersebut harus diinokulasikan dengan khamir. Pulpa kakao mengandung glukosa dan sukrosa antara 12-15%, asam-asam organik dan beberapa asam amino (Effendi 2002 dan Opeke 1984). Komposisi demikian cukup baik digunakan dalam proses fermentasi untuk menghasilkan asam asetat. Khamir (ragi roti) merupakan bagian dari mikroorganisme yang mempunyai peranan penting dalam proses fermentasi, dimana selama fermentasi berlangsung khamir (ragi roti) akan mengubah gula pada pulpa menjadi alkohol dan CO 2, kemudian dengan penambahan bakteri (Acetobacter aceti) maka akan diubah menjadi asam asetat.

19 Effendi (2002), menghasilkan asam asetat sebesar 4.24% dengan kecepatan pengadukan terbaik adalah 400 rpm pada inokulum 10% v/v. Hasil tersebut lebih baik dibandingkan proses pembuatan asam asetat yang di survei oleh Kozaki et al. (1998) secara tradisional di Indonesia dan Philipina yang menghasilkan sekitar 2% asam asetat. Industri asam asetat merupakan salah satu industri kimia yang berprospek di Indonesia, hal ini ditunjukkan dengan perkembangan produksi dan ekspor asam asetat (Tabel 1). Tabel 1. Perkembangan Asam Asetat Indonesia Tahun ( dalam ton ) Tahun Produksi Ekspor Sumber : Anonim (2008) Asam asetat merupakan senyawa yang cukup penting dalam pengolahan bahan pangan baik sebagai bumbu maupun sebagai pengawet, penggunaan asam asetat sebagai bumbu antara lain dalam mayonais, saus, acar disebabkan adanya senyawa-senyawa volatil yang menghasilkan flavor dan aroma, sedangkan sebagai pengawet pada kadar asam asetat 0.1% dapat menghambat pertumbuhan bakteri pembusuk dan bakteri pembentuk spora dan kadar asam asetat 0.3% dapat menghambat pertumbuhan jamur penghasil mikotoksin (Luwihana, 1998). Kegunaan lain dari asam asetat adalah dapat mengatur keasaman pada industri makanan, sebagai pelunak air dalam rumah tangga, sebagai minuman (cuka apel) dan sebagai bahan baku untuk pembuatan bahan kimia seperti vinil asetat, selulosa asetat, asetat anhidrit, ester asetat dan garam asetat. Proses pemanfaatan pulpa kakao belum banyak diketahui oleh masyarakat secara umum, sehingga sering terjadi permasalahan limbah pada saat proses pengolahan awal kakao. Melalui kasus ini, maka dilakukan

20 penelitian dengan harapan dapat mengurangi limbah pulpa kakao, dengan menghasilkan produk asam asetat yang tentunya sangat bermanfaat bagi kelangsungan hidup manusia. B. Tujuan Secara umum penelitian ini bertujuan untuk mempelajari pemanfaatan pulpa kakao sebagai bahan untuk memproduksi asam asetat. Sedangkan secara khusus penelitian ini bertujuan untuk : 1. Menentukan pengaruh konsentrasi gula dan starter ragi roti terhadap kadar alkohol. 2. Menentukan waktu atau lama fermentasi yang optimum untuk menghasilkan kadar alkohol. 3. Mempelajari pengaruh aerasi terhadap kadar asam asetat yang dihasilkan.

21 II. TINJAUAN PUSTAKA A. Pulpa Kakao Secara umum buah kakao terdiri dari empat bagian yaitu kulit, plasenta, pulpa dan biji (Gambar 1). Buah yang matang berkulit tebal dan berisi biji yang masing-masing terbungkus oleh pulpa berwarna putih, manis dan berlendir yang sangat bermanfaat dalam proses fermentasi. Bagian dalam biji yang disebut kotiledon, merupakan bagian yang digunakan untuk pembuatan produk kakao setelah melalui proses pengolahan pasca panen. a. kulit (544.8 gram) b. pulpa (48.0 gram) c. plasenta (-) d. biji (676.5 gram) Gambar 1. Penampang melintang buah kakao Yang dimaksud dengan pulpa adalah lapisan yang berwarna putih yang melapisi permukaan biji kakao. Pulpa yang melingkupi biji kakao terdiri dari 80 90% air dan 12 15% gula, dalam bentuk glukosa dan sukrosa. Gula ini merupakan komponen yang sangat penting untuk pertumbuhan mikroba selama proses fermentasi. Pulpa merupakan lapisan tebal endosperm, yang terdiri dari sel-sel turbular dengan ruangan antar sel yang besar. Pada buah mentah lapisan ini membengkak, akan tetapi pada buah masak lapisan ini lunak dan berlendir. Selama proses fermentasi sel-sel ini mati dan terlepas,

22 membentuk selaput seperti butir-butir pasta, mudah dilepaskan dari kulit biji (Nasution et al., 1985). Sebelum terjadi proses fermentasi, ph pulpa adalah sekitar 3.5 dan protein serta asam sitrat 1 3% (Minifie, 1999). Senyawasenyawa lain yang juga terdapat dalam pulpa kakao adalah kalium, kalsium, magnesium, albuminoids dan lain-lain (Siregar et al., 1989). Komposisi kimia pulpa kakao terdiri dari kandungan air %, kandungan albuminoid %, glukosa 8 13 %, pati sedikit, asam yang tidak menguap %, besi oksida (Fe 2 O 3 ) 0.03 %, sukrosa %, garam garam % (Nasution et al., 1985). B. Asam Asetat Asam asetat (CH 3 COOH) memiliki beberapa nama antara lain asam etanoat, vinegar (mengandung minimal 4 gram asam asetat per 100 larutan), atau asam cuka. Asam asetat merupakan senyawa organik yang mengandung gugus asam karboksilat. Asam asetat yang dikenal dengan nama vinegar merupakan suatu senyawa hasil fermentasi menggunakan bakteri asam asetat, juga merupakan senyawa yang cukup penting dalam pengolahan bahan pangan baik sebagai bumbu maupun sebagai pengawet, penggunaan asam asetat sebagai bumbu antara lain dalam mayonais, saus, acar disebabkan adanya senyawa-senyawa volatil yang menghasilkan flavor dan aroma, sedangkan sebagai pengawet pada kadar 0.1% dapat menghambat pertumbuhan bakteri pembusuk dan bakteri pembentuk spora dan kadar 0.3% dapat menghambat pertumbuhan jamur penghasil mikotoksin (Luwihana, 1998). Menurut Irnia dan Hidayat (2001), pembuatan asam asetat dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu secara sintesis/khemis dan secara mikrobiologis atau fermentasi, namun demikian cara fermentasi lebih disukai, karena lebih murah, lebih praktis dan resiko kegagalan relatif lebih kecil. Asam asetat merupakan hasil dari dua tahap proses fermentasi, tahap pertama adalah fermentasi gula menjadi alkohol oleh khamir, yang dikenal dengan fermentasi alkohol, sedangkan tahap kedua adalah oksidasi alkohol menjadi asam asetat oleh bakteri, yang dikenal dengan fermentasi asam asetat.

23 1. Fermentasi Alkohol Fermentasi didefinisikan oleh Amerine et al., (1980) sebagai suatu proses metabolisme yang membawa perubahan kimia terhadap substrat organik melalui kerja enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme. Khamir (ragi roti) dan bakteri (A. aceti) merupakan salah satu mikroorganisme yang berperan aktif dalam proses fermentasi terutama selama proses pemecahan gula menjadi alkohol dan perubahan alkohol menjadi asam asetat. Fermentasi yang dilakukan pada pulpa kakao, akan menghasilkan alkohol dan asam asetat. Kandungan yang terdapat di dalam pulpa kakao, sangat berpengaruh terhadap pembentukan asam selama fermentasi. Selain karbohidrat, komponen lain yang mempunyai peranan penting dalam proses fermentasi antara lain protein, vitamin, lemak dan asam nukleat. Tujuan dari fermentasi pulpa adalah untuk menghasilkan alkohol yang selanjutnya akan digunakan untuk menghasilkan asam asetat. Alkohol merupakan sumber karbon yang diperlukan untuk pertumbuhan sel, tetapi pada kadar tertentu justru menghambat pertumbuhan atau bahkan membunuh sel bakteri asam asetat. Sedangkan asam asetat merupakan produk metabolit yang terbentuknya bergantung pada besarnya populasi bakteri asam asetat dan ketersediaan etanol (Kapti dan Harmayani, 1998). Alkohol diproduksi dengan cara fermentasi dari bahan (medium) yang mengandung sukrosa oleh khamir (Purawisastra, 1994). Alkohol yang dihasilkan selama fermentasi berasal dari pemecahan gula dalam media pulpa kakao. Menurut Reed and Peppler (1973), proses yang terjadi pada fermentasi alkohol adalah perubahan 1 mol gula menjadi 2 mol etanol dan 2 mol CO 2. Proses ini menghasilkan senyawa alkohol dan karbondioksida dalam jumlah besar. Glukosa (C 6 H 12 O 6 ) 2C 2 H 5 OH + 2CO ATP + 5 Kkal ari reaksi di atas, 70% energi bebas yang dihasilkan, dilepaskan ke lingkungan sebagai panas dan secara teoritis 51.1% karbohidrat diubah menjadi alkohol dan 48.9% menjadi CO 2. Proses fermentasi glukosa

24 menjadi alkohol, karbondioksida dan hasil sampingannya dibagi menjadi 3 bagian yaitu : 1. Urutan reaksi dari glukosa hingga gliseraldehida-3-fosfat yang merupakan senyawa inti atau utama dalam reaksi. Reaksi ini menggunakan 2 mol ATP dan bukan merupakan reaksi oksidasi reduksi. 2. Reaksi fosfogerilasi tingkat substrat (oksidasi) yang menghasilkan 4 mol ATP dan piruvat. 3. Reaksi reduksi piruvat menjadi hasil utama fermentasi yaitu 2 mol alkohol dan 2 mol CO 2. Pada permulaan proses fermentasi, khamir memerlukan oksigen untuk pertumbuhannya sehingga fermentasi terjadi secara aerob. Setelah terbentuk CO 2, reaksi akan berubah menjadi anaerob. Apabila terdapat udara pada proses fermentasi, maka alkohol yang dihasilkan lebih sedikit karena terjadi respirasi yang mengakibatkan terjadinya konversi gula menjadi karbondioksida (CO 2 ) dan air (H 2 O). 2. Fermentasi Asam Asetat Hampir semua bahan yang mengandung alkohol, gula, pati, serta adanya sejumlah kecil unsur nitrogen, dapat dibuat menjadi asam asetat atau vinegar. Vinegar adalah cairan yang diperoleh melalui fermentasi alkohol dan dilanjutkan dengan fermentasi asam asetat. Fermentasi asam asetat bertujuan untuk menghasilkan produk asam asetat. Terbentuknya asam asetat diawali dengan fermentasi alkohol oleh khamir yang berlangsung dalam keadaan mikroaerofilik yang selanjutnya fermentasi asam asetat oleh A. aceti dalam keadaan aerob. Persamaan reaksi dari proses fermentasi tersebut adalah sebagai berikut : (1) Fermentasi Alkohol : C 6 H 12 O 6 + Ragi roti 2 C 2 H 5 OH + 2CO 2 glukosa alkohol (2) Fermentasi Asam Asetat : C 2 H5OH + O 2 alkohol CH 3 COOH + H 2 O asam asetat

25 Produksi asam asetat merupakan proses oksidasi tidak sempurna, dimana daya reduksi dipindahkan ke molekul oksigen. Pada tahap pertama terjadi oksidasi dari alkohol menjadi asetaldehida dengan bantuan enzim alkohol dehidrogenase. Kemudian terjadi hidrasi menjadi asetaldehida hidrat dan oksidasi kedua oleh asetaldehida dehidrogenase menjadi asam asetat (Effendi, 2002). Menurut Effendi (2002), dengan atau tanpa penambahan urea pada fermentasi substrat limbah cair pulpa kakao (kadar gula 12.63%) oleh Saccharomyces cerevisiae R 60 (10% v/v), waktu fermentasi selama 48 jam diperoleh kadar etanol rata-rata 5.3%. Pada fermentasi lebih lanjut dengan Acetobacter aceti B 127 dengan kecepatan pengadukan 400 rpm diperoleh asam asetat dengan kadar 4.24 %. Menurut Anonim (2008), Kegunaan asam asetat atau vinegar adalah sebagai berikut : 1. Produksi polimer seperti polietilena tereftalat, selulosa asetat, dan polivinil asetat, maupun berbagai macam serat dan kain. 2. Pengatur keasaman pada industri makanan 3. Pelunak air dalam rumah tangga 4. Minuman fungsional misal: cuka apel 5. Sebagai bahan baku untuk pembuatan vinil asetat, selulosa asetat, asetat anhidrit, ester asetat, garam asetat. C. Mikroorganisme Yang Berperan alam Fermentasi 1. Khamir Khamir atau yang sering disebut juga ragi atau yeast adalah mikroorganisme bersel tunggal, berbentuk bulat atau bulat telur atau bulat panjang membentuk pseudomisellium (Frazier, 1977). Selain itu khamir atau ragi dapat diartikan sebagai jasad renik sejenis jamur yang berkembang biak dengan sangat cepat dan yang mampu mengubah pati dan gula menjadi karbondioksida dan alkohol. Ragi roti merupakan kelompok khamir paling utama, yang secara komersial banyak dimanfaatkan oleh manusia. Ragi roti dianggap

26 bermanfaat dan mempunyai nilai ekonomis apabila dapat mengubah atau mengkonversi gula dalam proses fermentasi alkohol dan karbondioksida (Lopez and Penna, 2001). Ragi roti selain murah juga mudah diperoleh dan tahan lama sehingga cukup ekonomis bila digunakan dalam fermentasi alkohol. Jenis ragi kering ada yang berbentuk butiran kasar, ada juga yang berbentuk pelet-pelet halus. Ragi yang berbentuk kasar biasanya tidak mudah larut dan tidak cepat tumbuh sehingga perlu dilarutkan dulu dalam air pada waktu penggunaannya. emikian juga ragi segar yang dipres, perlu dilarutkan dalam air sebelum dicampurkan supaya mudah menyebar. Ragi kering berbentuk pelet halus biasanya mudah larut dan tersebar dalam bahan serta cepat tumbuh berkembang pada saat dicampurkan dengan bahan. Beberapa faktor lain yang juga mempengaruhi pertumbuhan khamir, diantaranya adalah alkohol, gula, karbondioksida dan tekanan udara, oksigen, asam asetat, asam organik dan ph, komponen bernitrogen, faktor pertumbuhan, tanin, partikel tak terlarut, logam serta suhu (Kunkee dan Mardon, 1970). Kadar alkohol yang dapat dihasilkan selama fermentasi berkisar antara 0-19%. Pada kadar yang tinggi alkohol dapat menghambat fermentasi karena memepercepat kerusakan sel khamir, sehingga mempengaruhi pula jumlah maksimum alkohol yang terbentuk (Amarine et al., 1987). Umumnya fermentasi alkohol sudah terhambat pada kadar alkohol 18%. Fiechter (1982) mengatakan, komponen karbon diperoleh dari glukosa, fruktosa dan sukrosa. Pada umumnya hampir semua galur Saccharomyces dapat memfermentasi glukosa, maltosa, fruktosa, sukrosa dan galaktosa sedangkan rafinosa hanya sebagian saja yang dapat difermentasi. Laktosa, melibiosa, pentosa, dekstrin dan pati sama sekali tidak dapat digunakan sebagai substrat fermentasi alkohol. Glukosa, fruktosa dan sukrosa bukan satu-satunya sumber karbon untuk khamir. alam keadaan aerob, asam asetat, asam laktat dan bahan senyawa

27 organik lainnya termasuk alkohol dapat digunakan sebagai sumber karbon oleh khamir (Kunkee dan Mardon, 1970). Pengaruh oksigen terutama pada pertumbuhan aerob. Pada fase pertumbuhan awal atau fase eksponensial, oksigen memberi stimulasi pada pertumbuhan khamir. Perbanyakan sel berlangsung sampai pertengahan fermentasi dan pada kondisi anaerob sebagian besar gula dikonversi menjadi alkohol. Adanya kekurangan oksigen maka khamir akan menggunakan senyawa-senyawa antara sebagai penerima hidrogen dan menstimulasi pembentukan alkohol. 2. Bakteri (Acetobacter aceti) Nama bakteri berasal dari bahasa Yunani bacterion yang berarti batang atau tongkat. Sekarang nama itu dipakai untuk menyebut sekelompok mikroorganisme bersel satu, tubuhnya bersifat prokariotik, yaitu tubuhnya atas sel yang tidak mempunyai pembungkus inti. Bakteri berkembangbiak dengan membelah diri, dan karena begitu kecil maka hanya dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop. Bakteri walaupun bersel satu tetapi mempunyai beberapa organel yang dapat melaksanakan beberapa fungsi hidup. Fermentasi asam asetat dilakukan oleh bakteri asam asetat terhadap larutan yang mengandung alkohol oleh bakteri dari genus Acetobacter, biasanya spesies yang digunakan adalah Acetobacter aceti (Fardiaz, 1989). A. aceti bersifat motil atau nonmotil dan mengoksidasi etanol menjadi asam asetat yang dioksidasi lebih lanjut menjadi karbondioksida (CO 2 ) (Fardiaz, 1992). Frazier (1978) menyatakan bahwa A. aceti berbentuk bulat panjang seperti batang, lurus atau agak melengkung dengan susunan sel tunggal, berpasangan atau dalam rantai. A. aceti bersifat kemoorganotrof, sehingga dapat tumbuh pada medium sederhana maupun kompleks. Bakteri ini merupakan bakteri aerob dengan suhu optimal 20 O C - 30 O C. A. aceti dapat mengubah alkohol menjadi asam asetat pada konsentrasi alkohol optimal 10% - 13%. Konsentrasi alkohol yang terlalu rendah (0,0 0,5%), akan menyebabkan overoksidasi asam asetat menjadi

28 CO 2 dan H 2 O, sedangkan konsentrasi alkohol lebih dari 14% akan mengakibatkan terhambatnya proses fermentasi asam asetat (Waluyo, 1984). A. aceti membutuhkan oksigen untuk pertumbuhannya minimal 0,36 gram untuk setiap gram gula (Adams, 1980). Menurut Waluyo (1984), bahwa penambahan starter A. aceti ke dalam substrat beralkohol dilakukan pada saat fermentasi alkohol berjalan sempurna, dimana kandungan alkohol berkisar antara 10% - 13%. Apabila di dalam media belum mengandung alkohol dan dilakukan penambahan starter A. aceti, maka dapat menyebabkan berkurangnya aktivitas khamir atau bahkan mematikan khamir, sehingga tidak dapat menghasilkan alkohol dan proses fermentasi asam asetat akan terhambat.. Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Proses Fermentasi 1. Karbohidrat (gula) Hampir semua strain khamir dapat memfermentasi karbohidrat. Khamir akan memfermentasi karbohidrat pada kadar yang optimum sehingga apabila kadarnya di atas optimum maka kecepatan fermentasi akan menurun dan jumlah alkohol yang dihasilkan tidak maksimal atau tidak sesuai dengan yang diharapkan (Kunkee dan Mardon, 1970). Menurut Amarine et al., (1987), jika konsentrasi gula dalam substrat terlalu tinggi maka alkohol yang terbentuk akan menghambat aktivitas khamir, sehingga waktu fermentasi menjadi lebih lama dan tidak semua gula dapat dikonversi menjadi alkohol, sehingga efisiensi menjadi lebih rendah. Hinggins et al., (1984) menyatakan, bahwa konsentrasi gula yang paling baik untuk proses fermentasi adalah 16 25% dan akan dihasilkan alkohol sebesar 6 12%. Konsentrasi gula di atas 25% akan memperlambat fermentasi, sedangkan konsentrasi gula yang tinggi yaitu di atas 70% akan menyebabkan fermentasi terhenti. Hal ini disebabkan adanya tekanan osmotik (Amarine et al., 1987).

29 2. Suhu Suhu optimum dalam proses pertumbuhan mikroba merupakan faktor yang sangat penting dalam fermentasi. Menurut Frazier dan Westhoff (1978), suhu opimum bagi pertumbuhan khamir pada proses fermentasi antara O C dan maksimum pada suhu O C. Sedangkan menurut Presscot dan unn (1981), suhu optimum untuk fermentasi alkohol adalah O C. Kenaikan suhu akan menurunkan ketahanan khamir terhadap alkohol yang dihasilkan dan akan meningkatkan pembentukan asam asetat yang bersifat racun. Amarine et al., (1987) menyatakan, bahwa kegunaan fermentasi pada suhu rendah adalah untuk menghambat aktivitas mikrothermofilik, bakteri dan khamir liar. Suhu optimum bagi pertumbuhan bakteri adalah antara O C. Pada suhu tersebut pertumbuhan bakteri akan berlangsung dengan cepat. iluar kisaran suhu optimum, pertumbuhan mikroba baik khamir maupun bakteri akan menjadi lambat, bahkan fermentasi sama sekali tidak dapat berlangsung dengan baik. 3. ph laju pertumbuhan mikroba tergantung pada nilai ph, karena ph mempengaruhi fungsi membran enzim dan komponen lainnya. ph sangat berguna untuk mengatur aktivitas fermentasi di dalamnya. Selain itu juga berfungsi untuk menghentikan kegiatan fermentasi bila dianggap telah cukup. Jasad renik pada umumnya dapat tumbuh pada kisaran ph 3 6. Kebanyakan bakteri mempunyai ph optimum sekitar ph Pada ph di bawah 5.0 dan di atas 8.5, bakteri tidak dapat tumbuh dengan baik, kecuali bakteri asam asetat dan bakteri yang mengoksidasi sulfur. Sebaliknya, khamir menyukai ph 4 5 dan dapat tumbuh pada kisaran ph Oleh karena itu, khamir tumbuh pada ph rendah dimana pertumbuhan bakteri terhambat (Waluyo, 2007).

30 4. Unsur Hara Umumnya khamir membutuhkan unsur C, H,O,N,P,K,Mg dan Ca dalam jumlah yang cukup besar sedangkan Fe dan Cu dibutuhkan dalam jumlah yang kecil. Kebutuhan akan unsur Nitrogen akan dapat diperoleh dari garam-garam amonium, asam amino, pepton, dan peptida. Bentuk amonium merupakan bentuk yang paling mudah dipergunakan oleh khamir (Harrison Graham, 1970). 5. Kadar Alkohol Fiecther (1982) mengatakan bahwa alkohol dengan konsentrasi tinggi merupakan racun bagi khamir. Alkohol pada konsentrasi tinggi dapat mendenaturasi protein dan melarutkan lemak, sehingga dinding sel khamir rusak dan plasma membeku, selanjutnya khamir akan mati. Menurut Ebner (1983), proses fermentasi asam asetat bila kadar alkohol dalam substrat tersebut menurun maka bakteri A. aceti akan mengoksidasi asam asetat dalam substrat menjadi CO 2 dan H 2 O. 6. Pengaruh Aerasi (oksigen) Aerasi ialah proses pengaliran dan pemindahan udara ke dalam cairan. Aerasi berfungsi untuk memasok kebutuhan oksigen dan menjaga mikroba dalam suspensi agar dapat melakukan metabolisme (Wang et al., 1979). Khamir tumbuh dengan baik pada kondisi aerob, tetapi ada beberapa jenis dapat tumbuh pada kondisi anaerob, dimana proses respirasi digantikan dengan proses fermentasi. Jika kadar oksigen cukup tinggi dalam sel khamir akan terjadi metabolisme aerob atau respirasi. Pada proses respirasi, asam piruvat akan dioksidasi menjadi CO 2 dan H 2 O. Jika terdapat bakteri dari jenis Acetobacter, maka alkohol akan diubah menjadi asam asetat. Menurut Irnia dan Hidayat (2001), bahwa aerasi bertujuan untuk memenuhi kebutuhan mikroba akan O 2 pada konsentrasi tertentu sesuai dengan karakteristik mikroba yang digunakan yaitu A. aceti.

31 Ketersediaan oksigen sangat penting dalam proses pemecahan alkohol menjadi asam asetat. Biasanya pemberian oksigen dilakukan dengan memberikan aerasi pada media atau substrat.. engan menjaga aerasi yang baik maka proses oksidasi dan dismutasi pada pembentukan asam asetat juga akan berlangsung dengan baik (Waluyo, 1984). Proses aerasi mempunyai kegunaan: (1) Reduksi mekanisme atau menghilangkan gas-gas atau pengotor air yang volatile seperti karbon dioksida, hidrogen sulfida, bau-bau yang menyimpang dan sebagainya ; (2) oksidasi unsur-unsur yang terdapat dalam air seperti besi, mangan menjadi bentuk yang tak larut sehingga dipisahkan dari air.

32 III. METOOLOGI PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan pada Bulan April sampai September 2008 di Laboratorium Pengolahan Pangan, Laboratorium Mikrobiologi Pangan dan Biokimia epartemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. B. Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan antara lain : pulpa kakao yang diperoleh dari Perkebunan Kakao Liang Awaia Seram Bagian Barat Ambon, ragi roti (Fermipan) dan gula pasir yang diperoleh dari pasar tradisional di daerah Bogor, bakteri A. aceti BTCC-618, media untuk pertumbuhan khamir dan A. aceti yaitu PB (Potato extrose Broth), pepton, yeast ekstrak, glukosa, MgSO 4.7H 2 O (Magnesium Sulphate Heptahydrate) dan agar, spiritus, kapas, kertas label, allumunium foil, tisu, aquades, NaOH, asam oksalat (C 2 H 2 O 4. 2H 2 O), indikator PP (Phenolphtalein), alkohol 70%, alkohol 96 %. Sedangkan Alat-alat yang digunakan erlenmeyer, gelas ukur, spatula, bunsen, timbangan, blender, kain saring, sumbat karet yang dilengkapi dengan selang, autoklaf, aerator, refraktometer, alkohol meter, ph meter, labu destilasi, cawan petri, hot plate, labu takar, gelas piala, buret dan pipet tetes. C. Tahapan Penelitian 1. Penyegaran Kultur Penelitian ini menggunakan kultur A. aceti BTCC-618, yang diperoleh dari Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) di Cibinong. Sebelum dipergunakan, kultur A. aceti disegarkan terlebih dahulu dengan cara menumbuhkan pada media cair yang terdiri dari pepton, yeast ekstrak, glukosa dan MgSO 4.7H 2 O. Proses penyegaran kultur A. aceti dapat dilihat pada Gambar 2.

33 Biakan murni mikroba iinokulasikan 1 mata ose ke dalam media cair (pepton, yeast ekstrak, glukosa, MgSO 4.7H 2 O) iinkubasi pada suhu ruang selama 2 3 hari Gambar 2. Penyegaran Kultur A. aceti pada Media Cair 2. Pembuatan Starter Starter adalah media yang digunakan untuk memperbanyak sel-sel khamir penghasil alkohol dan bakteri penghasil asam asetat yang selanjutnya akan diinokulasikan ke dalam media fermentasi. alam proses pembuatan asam asetat, starter yang perlu disiapkan adalah starter khamir dan starter A. aceti. alam penelitian ini, khamir yang digunakan adalah ragi roti komersial Starter Khamir Sebelum dipergunakan, ragi roti komersial tersebut terlebih dahulu ditumbuhkan atau diperbanyak dalam media cair PB (Potato extrose Broth). Media PB tersebut dilarutkan dengan aquades, kemudian disterilkan dan didinginkan. Setelah media tersebut didinginkan, maka ragi roti ditambahkan ke dalam media PB, kemudian diinkubasikan selama 24 jam pada suhu ruang, untuk selanjutnya diinokulasikan dalam media pulpa kakao. Sebelum proses inokulasi berlangsung, terlebih dahulu disiapkan kultur kerja dengan menggunakan media pulpa kakao

34 (pengenceran 1 : 4), kemudian ditambahkan gula 10% dan disterilkan pada suhu 121 O C selama 15 menit. Setelah melewati proses sterilisasi, media tersebut didinginkan dan diinokulasikan secara aseptis dengan suspensi ragi roti (umur 24 jam). Kemudian, media diinkubasi pada suhu ruang dan siap digunakan untuk proses fermentasi (Gambar 3). Pulpa kakao Tambahkan aquades (Pengenceran 1 : 4) Tambahkan gula 10 % dan dicampur - larut Sterilisasi T 121 o C - 15 menit Ragi Roti PB steril Inkubasi 24 jam (suhu ruang) Media pulpa kakao Inokulasi Inkubasi (suhu ruang) Gambar 3. iagram alir pembuatan starter khamir (ragi roti) 2.2. Starter Acetobacter aceti Starter A. aceti dibuat dalam media cair yang terdiri dari campuran pepton, yeast ekstrak, glukosa dan MgSO 4.7H 2 O. Setelah itu, tambahkan aquades dan dilarutkan. Setelah larut, media tersebut disterilkan pada suhu 121 O C selama 15 menit. Kemudian didinginkan dan diinokulasikan dengan A. aceti. Setelah itu, diinkubasikan pada suhu ruang selama 2 3 hari (Gambar 4).

35 Pepton, yeast ekstrak, glukosa dan MgSO 4.7H 2 O dilarutkan dengan aquades Inkubasi 2 3 hari (suhu ruang) idinginkan Inokulasi A. aceti Sterilisasi 121 C : 15 Gambar 4. Pembuatan starter A. aceti 3. Produksi Asam Asetat Ada dua tahap fermentasi yang harus dilakukan untuk menghasilkan asam asetat. Tahap pertama adalah fermentasi alkohol, dimana khamir mengubah kandungan glukosa pada pulpa kakao menjadi alkohol. Tahap kedua adalah fermentasi asam asetat, dimana dengan penambahan bakteri A. aceti pada media yang beralkohol tinggi, maka dapat menghasilkan asam asetat Fermentasi Alkohol Media fermentasi yang digunakan adalah pulpa kakao yang sudah diblender dan diencerkan dengan perbandingan 1 : 4, kemudian disaring

36 menggunakan kain saring dan ditambahkan gula dengan konsentrasi 5 %, 10% dan 15%. Media tersebut kemudian disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit, dan kemudian didinginkan. Setelah dingin, ke dalam masing-masing media pulpa tersebut diinokulasikan dengan suspensi ragi roti sebanyak 10% dan 20% dan diinkubasikan pada suhu ruang selama 12 hari (Gambar 5). Untuk menampung gas yang terbentuk selama fermentasi, maka labu erlenmeyer tersebut dilengkapi dengan pipa dan selang plastik yang bagian ujungnya direndam dalam air. Pengamatan yang dilakukan pada tahap ini adalah pengukuran Total Padatan Terlarut (TPT), nilai ph dan alkohol, yang dilakukan pada hari ke- 0, 4, 8 dan Fermentasi Asam Asetat Fermentasi asam asetat pada penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh lama fermentasi terhadap perubahan kadar alkohol, total padatan terlarut, ph, dan kadar asam asetat. Starter yang digunakan adalah biakan A. aceti pada agar miring yang diinokulasikan dalam larutan nutrient broth. Banyaknya starter yang ditambahkan adalah 10% (v/v). Setelah diinkubasi selama 12 hari dengan kadar alkohol tertentu, kemudian fermentasi dilanjutkan dengan menambahkan suspensi A. aceti ke dalam media pulpa tersebut sebanyak 10% dan pemeraman dilakukan selama 7 hari dalam wadah erlenmeyer dengan perlakuan aerasi dan tanpa aerasi (Gambar 6). Analisis asam asetat dilakukan dengan metode titrasi menggunakan NaOH 0.1 N yang telah distandarisasi. Pengukuran kadar alkohol, total padatan terlarut, ph dan kadar asam asetat dilakukan pada hari ke- 0, 7, 14 dan 21. Produk utama dari fermentasi asam asetat adalah asam asetat. Selama fermentasi diharapkan terjadi pembentukan asam asetat yang ditandai dengan penurunan kadar alkohol, total padatan terlarut dan ph substrat.

37 Pulpa kakao (pengenceran 1 : 4) Blender dan saring Penambahan gula (5%, 10%, 15%) ukur TPT Wadah Sterilisasi T 121 o C - 15 menit Pendinginan Inokulasi (10%, 20%) Suspensi ragi roti Inkubasi suhu ruang (Pengamatan hari ke- 0, 4, 8, dan 12) Analisa kadar alkohol (Metode estilasi) Gambar 5. iagram alir fermentasi alkohol

38 Inokulasi A. aceti 10% (alkohol tertinggi) Perlakuan aerasi Perlakuan tanpa aerasi Inkubasi Analisis asam asetat (metode titrasi) ASAM ASETAT Gambar 6. Proses fermentasi asam asetat 4. Peubah yang iukur Pada fermentasi pulpa, dilakukan pengambilan sampel pada setiap empat hari selama 12 hari fermentasi kemudian dianalisis. Pengambilan sampel fermentasi alkohol dilakukan setiap tujuh hari selama tiga minggu.

39 Analisis yang akan dilakukan dalam penelitian ini adalah kadar asam asetat, kadar alkohol, total padatan terlarut dan nilai ph. Prosedur analisa dari masing-masing parameter adalah sebagai berikut : 4.1. Kadar Asam Asetat 10 ml sampel ditimbang, dimasukkan ke dalam labu takar, tambahkan aquades hingga volume menjadi 100 ml. Kemudian pipet 10 ml, masukkan ke dalam erlenmeyer 100 ml, kemudian dititrasi dengan NaOH 0,1 N menggunakan indikator phenolphtalein 2-3 tetes sampai berubah warna menjadi merah jambu. Sampel dititrasi dengan menggunakan buret. Kadar Asam Asetat = (ml) titran x N.NaOH x Pengenceran x BM x 100% Berat Sampel x Kadar Alkohol Pengukuran kadar alkohol dilakukan dengan menggunakan peralatan mikrodestilasi, selanjutnya destilat diukur dengan alkohol meter untuk menentukan kadar alkohol. Seratus ml sampel didestilasi hingga didapatkan destilat 80 ml, kemudian ditambahkan aquades ke dalam destilat sampai volume menjadi seratus ml. Larutan tersebut dikocok agar homogen lalu alkohol meter dimasukkan. Kadar alkohol ditunjukkan oleh angka pada alkohol meter yang berhimpit dengan destilat Total Padatan Terlarut (TPT) Total padatan terlarut diukur dengan refraktometer. Satu tetes sampel diteteskan, kemudian angka yang keluar dari alat refraktometer adalah nilai TPT dari sampel tersebut, yang dinyatakan dalam persen (%) brix Nilai ph Pengukuran dilakukan dengan ph meter. Elektroda ph meter dicelupkan ke dalam sampel yang akan dianalisa. Nilai ph langsung

40 terbaca. Apabila nilai ph telah terbaca, kemudian elektroda dikeluarkan dari sampel dan dibersihkan dengan menggunakan aquades, kemudian dikeringkan dengan tisu bersih.. Rancangan Percobaan 1. Rancangan percobaan untuk fermentasi alkohol Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan tiga faktor dan dua kali ulangan. Faktor pertama adalah penambahan gula (5%, 10% dan 15%). Faktor kedua adalah konsentrasi starter ragi roti (10% dan 20%) dan faktor ketiga adalah waktu fermentasi (hari ke-0, 4, 8 dan 12). Model matematis yang digunakan menurut Mattjik dan Sumertajaya (2006) adalah sebagai berikut : Y ijk = + A i + B j + C k + ijk Keterangan : Yijk = Pengaruh konsentrasi gula ke-i, starter ragi roti taraf ke-j dan lama fermentasi taraf ke-k µ = Rata-rata pengamatan sebenarnya Ai = Pengaruh penambahan gula taraf ke-i Bj = Pengaruh konsentrasi ragi roti taraf ke-j C k = Pengaruh lama fermentasi (hari) taraf ke-k (0, 4, 8, 12) ijk = Pengaruh acak 2. Rancangan percobaan untuk fermentasi asam asetat Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan dua faktor dan dua kali ulangan. Faktor pertama adalah perlakuan aerasi dan tanpa aerasi. Faktor kedua adalah waktu fermentasi (hari ke-0, 7, 14 dan 21). Model matematis yang digunakan menurut Mattjik dan Sumertajaya (2006) adalah sebagai berikut : Y ijk = + A i + B j + ijk

41 Keterangan : Yijk = Pengamatan pada ulangan ke-k dalam perlakuan aerasi atau tanpa aerasi taraf ke-i dan lama fermentasi taraf ke-j µ = Rata-rata pengamatan sebenarnya Ai = Pengaruh perlakuan taraf ke-i (aerasi dan tanpa aerasi) Bj = Pengaruh faktor lama fermentasi (hari) ke-j (0, 7, 14, 21) ijk = Pengaruh acak

42 IV. HASIL AN PEMBAHASAN A. Fermentasi Alkohol Fermentasi merupakan kegiatan mikroba pada bahan pangan sehingga dihasilkan produk yang dikehendaki. Mikroba yang umumnya terlibat dalam fermentasi adalah bakteri, khamir dan kapang. Contoh bakteri yang digunakan dalam fermentasi adalah Acetobacter xylinum pada pembuatan nata de coco, Acetobacter aceti pada pembuatan asam asetat. Contoh khamir dalam fermentasi adalah Saccharomyces cerevisiae dalam pembuatan alkohol sedang contoh kapang adalah Rhizopus sp pada pembuatan tempe, Monascus purpureus pada pembuatan angkak dan sebagainya. Fermentasi dapat dilakukan dengan menggunakan kultur tunggal dan kultur campuran. Kultur tunggal adalah mikroorganisme yang telah diketahui dengan pasti sifat dan karakteristiknya sehingga produk yang dihasilkan memiliki stabilitas dan kualitas yang jelas. Sedangkan kultur campuran adalah kultur yang terdiri dari beberapa mikroorganisme yang belum diketahui sifat dan karakteristiknya, sehingga hasil yang diperoleh sering tidak stabil. Penelitian ini menggunakan ragi roti yang merupakan khamir bersel tunggal Saccharomyces cerevisiae, dimana terdapat sejumlah enzim di dalam cairan sel ragi salah satunya adalah enzim invertase dan enzim zimase. Enzim invertase yang berfungsi sebagai pemecah sukrosa menjadi monosakarida (glukosa dan fruktosa) serta enzim zimase yang mengubah monosakarida tersebut menjadi alkohol pada proses fermentasi (Romli, 1998). Fermentasi alkohol merupakan salah satu tahap dalam menghasilkan asam asetat. Fermentasi alkohol dalam penelitian ini dilakukan dengan menginkubasi substrat larutan pulpa kakao yang ditambahkan ragi roti (10% dan 20%) selama 12 hari pada suhu ruang. Menurut Young (1999), gula yang terkandung dalam substrat akan dipecah oleh sel-sel ragi roti menjadi alkohol. Pemecahan ini berkaitan,

43 antara lain dengan perubahan ph dan total padatan terlarut (TPT), juga menghasilkan asam asetat sebagai produk sekunder. 1. Kadar Alkohol Kadar alkohol memegang peranan penting dalam proses fermentasi, karena berhubungan dengan kemampuan pertumbuhan mikroba terutama khamir (ragi roti) dalam media fermentasi yang selanjutnya akan digunakan untuk produksi asam asetat. Alkohol merupakan produk utama pada fermentasi anaerob, tetapi alkohol ini merupakan racun bagi khamir itu sendiri pada konsentrasi yang tinggi untuk itu konsentrasi substrat awal harus diperhatikan agar dapat di metabolisme oleh khamir dengan baik. Fungsi utama khamir adalah mengubah gula dalam substrat menjadi alkohol dan karbondioksida. Pada Tabel 2 dan Gambar 7 menunjukkan, bahwa kadar alkohol awal dari masing-masing substrat yaitu mencapai 1 % dan akan mengalami peningkatan seiring dengan semakin lamanya waktu fermentasi (12 hari) dan semakin tinggi konsentrasi gula (15%) serta starter ragi (20%) yang digunakan. Hal ini disebabkan, karena semakin tinggi konsentrasi gula dan starter ragi, maka semakin banyak alkohol yang dihasilkan dari pemecahan gula oleh khamir. Tabel 2. Perubahan kadar alkohol pulpa kakao selama fermentasi Kadar alkohol (%) Perlakuan Lama fermentasi (hari) Gula 5%, Ragi 10% Gula 5%, Ragi 20% Gula 10%, Ragi 10% Gula 10%, Ragi 20% Gula 15%, Ragi 10% Gula 15%, Ragi 20% ari hasil penelitian ini diperoleh kadar alkohol tertinggi dalam fermentasi alkohol adalah 10% pada perlakuan penambahan gula 15%, starter ragi roti 20% selama 12 hari fermentasi. Kadar alkohol inilah yang akan digunakan sebagai substrat untuk fermentasi alkohol dalam memproduksi asam asetat. Pelezar (1986) menyatakan, bahwa kadar alkohol antara 10%-13% adalah konsentrasi optimal bagi bakteri asam