PERNYATAAN. Bogor, November Ni Nyoman Puspawati NRP F

Transkripsi

1 PENGGUNAAN BERBAGAI JENIS BAHAN PELINDUNG UNTUK MEMPERTAHANKAN VIABILITAS BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI AIR SUSU IBU (ASI) PADA PROSES PENGERINGAN BEKU DAN PENYIMPANAN NI NYOMAN PUSPAWATI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

2 PERNYATAAN Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis dengan judul: PENGGUNAAN BERBAGAI JENIS BAHAN PELINDUNG UNTUK MEMPERTAHANKAN VIABILITAS BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI AIR SUSU IBU (ASI) PADA PROSES PENGERINGAN BEKU DAN PENYIMPANAN adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan tercantum dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, November 2008 Ni Nyoman Puspawati NRP F

3 ABSTRACT NI NYOMAN PUSPAWATI. NRP. F Use of variouse of cryogenic agents on viability of Lactic Acid Bacteria isolated from breast milk in freeze drying process and shelf-life. Under direction of LILIS NURAIDA and DEDE ROBIATUL ADAWIYAH Lactic acid bacteria are the most important bacteria having potential as probiotic. The objectives of the present study were to evaluate cryogenic agents to protect the viability of lactobacilli during freeze drying and to calculate the shelflife of freeze dried lactic acid bacteria culture. Four cryogenic agents, i.e. sucrose, lactose, skim milk and maltodextrin, were used in freeze drying of three species of lactic acid bacteria, i.e. Pediococcus pentosaceus A16, Lactobacillus brevis A17 and Lactobacillus rhamnosus R21 isolated from breast milk. Evaluation included viability before and after freeze dried, survival of freeze dried culture in 0.5 % bile salt and low ph for 5 hours, predicted count of lactic acid bacteria until colon and the shelf life during storage was also determined. To predict the shelf life of freeze dried culture, further experiment was conducted by storage the freeze dried of Lactobacillus rhamnosus R21 at RH 75 and RH 89 and shelf life was predicted by sorption isotherm method. Evaluation was done on under act water content, viability, water activity, acidification activity, count of yeast and mold. The result showed that three of cryogenics, i.e. sucrose, lactose and skim milk improved viability of freeze dried of all lactic acid bacteria, except maltodextrin that did not give protection to Lactobacillus rhamnosus R21. Evaluation on survival in 0.5 % bile salt shows that cryogenic agents improved survival freeze dried of all lactic acid bacteria. The cryogenic improved survival rate in low ph, with the best protection given by skim milk on Lactobacillus rhamnosus R21. Lactobacillus rhamnosus R21 with skim milk as cryogenic give highest count in colon is 6.4 x 10 6 cfu/g. The predicted shelf life of the freeze dried Lactobacillus rhamnosus R21 culture if initial water content is 2.17% db, packaged in aluminium foil laminated by PE (polyethylene) and temperature 30 o C are 5.86 years at RH 75 and 5.10 years at RH 80. Keywords : Lactic acid bacteria,breast milk, freeze drying, cryogenic, probiotic

4 RINGKASAN NI NYOMAN PUSPAWATI. NRP. F Penggunaan Berbagai Jenis Bahan Pelindung untuk Mempertahankan Viabilitas Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Air Susu Ibu (ASI) pada Proses Pengeringan Beku dan Penyimpanan. Dibimbing oleh LILIS NURAIDA dan DEDE ROBIATUL ADAWIYAH Bakteri asam laktat merupakan mikroorganisme yang penting dalam teknologi fermentasi pangan karena mempunyai kemampuan untuk memperbaiki citarasa, tekstur dan aroma produk akhir yang secara organoleptik dan kualitas lebih dapat diterima oleh konsumen. Penggunaan bakteri asam laktat tidak hanya sebagai mikroorganisme yang berperan pada proses fermentasi pangan, namun juga dapat digunakan untuk tujuan fungsional seperti pengembangan produk probiotik. Bakteri asam laktat yang bersifat probiotik umumnya disolasi dari sampel klinis. Hal ini didasarkan pada asumsi bahwa isolat klinis dapat bertahan pada kondisi saluran pencernaan manusia. Beberapa isolat klinis yang diisolasi dari air susu ibu di daerah Bogor ternyata memiliki karakteristik sebagai probiotik dengan melakukan pengujian ketahanan terhadap ph rendah, ketahanan terhadap garam empedu, pengujian sifat antimikroba, aktifitas asidifikasi. Isolat bakteri asam laktat yang memiliki potensi menjadi probiotik diantaranya Pediococcus pentosaceus A16, Lactobacillus rhamnosus R21 dan Lactobacillus brevis A17. Kultur bakteri asam laktat bila disimpan segar atau dalam bentuk produk fermentasi, maka viabilitas kultur tersebut dapat menurun atau bahkan hilang. Untuk mencegah menurunnya viabilitas dan hilangnya sifat-sifat probiotik kultur bakteri tersebut, maka dapat dilakukan dengan mengawetkan kultur BAL tersebut, salah satunya dengan pengeringan beku (freeze drying), namun demikian pada proses pengeringan beku juga dapat menyebabkan terjadinya kerusakan sel (celluler injury). Kerusakan sel pada proses pengeringan beku dapat diminimalisasi dengan adanya bahan-bahan pelindung (kriogenik). Selain itu kondisi lingkungan penyimpanan juga berpengaruh terhadap kerusakan kultur sel. Adapun tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh isolat ASI terbaik dan mengidentifikasi jenis bahan pelindung yang dapat mempertahankan viabilitas bakteri asam laktat asal ASI selama proses pengeringan beku, mengetahui stabilitas kultur kering bakteri asam laktat selama penyimpanan serta melakukan pendugaan umur simpan kultur kering beku isolat asal ASI. Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan informasi tentang viabilitas kultur bakteri asam laktat yang berasal dari ASI selama proses pengeringan beku, mengetahui berbagai jenis bahan pelindung yang berpengaruh terhadap viabilitas sel selama proses pengeringan beku dan memberikan informasi tentang pengaruh kelembaban terhadap viabilitas sel selama penyimpanan dimana selanjutnya dapat digunakan untuk menduga umur simpan kultur kering beku bakteri asam laktat. Penelitian ini secara garis besar dibagi menjadi 2 bagian yaitu penelitian pendahuluan yang meliputi: konfirmasi dan persiapan kultur, penentuan kurva pertumbuhan kultur bakteri asam laktat. Penelitian utama yang terdiri dari 2 tahap yaitu: tahap 1. melihat pengaruh penggunaan berbagai jenis bahan pelindung pada

5 kultur bakteri asam laktat pada proses pengeringan beku. Tahap 2. hasil terbaik dari penelitian tahap 1 dilakukan penyimpanan pada tingkat kelembaban berbeda selanjutnya dilakukan pendugaan umur simpan dengan menggunakan metode sorpsi isotermis dengan pendekatan kadar air kritis. Kultur bakteri asam laktat yang digunakan adalah isolat asal ASI yaitu Pediococcus pentosaceus A16, Lactobacillus brevis A17 dan Lactobacillus rhamnosus R21, sedangkan bahan pelindung yang digunakan: buffer phospat ph 7 (kontrol), sukrosa 10%, laktosa 10%, susu skim 10 % dan maltodekstrin 10%. Parameter yang diamati meliputi perubahan total BAL selama pengeringan beku, ketahanan terhadap ph rendah, ketahanan terhadap garam empedu dan perkiraan jumlah bakteri asam laktat yang mampu mencapai kolon. Penelitian tahap 2 dilakukan penyimpanan kultur kering terpilih dari tahap 1 pada kondisi lingkungan dengan kelembaban 75% dan 90%. Selama proses penyimpanan dilakukan analisa yang meliputi: perubahan total BAL selama pengeringan beku, kadar air, aktivitas air, total kapang khamir, aktivitas asidifikasi. Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap Faktorial dengan 2 kali ulangan. Proses pengeringan beku menghasilkan kultur kering probiotik yang memiliki viabilitas yang tinggi untuk semua jenis isolat dan penggunaan bahan pelindung. Tingkat ketahanan ketiga isolat bakteri asam laktat setelah pengeringan beku relatif tinggi. Rata-rata jumlah bakteri sebelum freeze drying adalah 11,79 log cfu/g dan setelah pengeringan beku menurun menjadi 10,19 log cfu/g. Ketahanan kultur kering probiotik terhadap ph rendah cukup rendah dimana penurunan jumlah sel setelah inkubasi 5 jam bervariasi dan cenderung tinggi. Rata-rata penurunan jumlah bakteri asam laktat setelah terpapar ph 2,0 yaitu 0,46 log cfu/g sampai 9,35 log cfu/g. Ketahanan kultur kering probiotik terhadap garam empedu cukup tinggi dan dari hasil uji statistik menunjukkan nilai ketahanan yang berbeda nyata diantara jenis kultur dan bahan pelindung yang digunakan. Rata-rata penurunan jumlah bakteri asam laktat setelah terpapar garam empedu 0,5% selama 5 jam yaitu 0,03 log cfu/g sampai 4,56 log cfu/g. Perkiraan jumlah bakteri asam laktat yang mampu mencapai kolon menunjukkan hasil yang bervariasi dimana kultur Lactobacillus rhamnosus R21 dengan bahan pelindung susu skim mampu mencapai kolon dalam jumlah paling tinggi yaitu sebesar 6,4 x 10 6 cfu/g. Dari hasil pengujian pada tahap 1 diperoleh kultur yang terpilih untuk dilanjutkan pada tahap ke-2 yaitu kultur Lactobacillus rhamnosus R21 dengan bahan pelindung susu skim 10% dengan pertimbangan: memiliki laju pertumbuhan yang paling tinggi diantara isolat yang lain, susu skim mampu melindungi terhadap kerusakan karena paparan asam tinggi (ph rendah) dan garam empedu 0,5%. Penyimpanan kultur kering dapat meningkatkan kadar air yang menyebabkan terjadinya penurunan viabilitas dan aktifitas asidifikasi kultur kering Lactobacillus rhamnosus R21. Pendugaan umur simpan kultur kering Lactobacillus rhamnosus R21 dengan menggunakan pendekatan kurva sorpsi isotermis diperoleh hasil: jika kadar air awal 2,17% bk, disimpan dengan pengemas aluminium foil yang dilaminasi dengan PE (polyethylene) pada suhu 30 o C adalah 5,86 tahun pada RH 75 dan 5,10 tahun pada RH 80. Kata kunci : bakteri asam laktat, ASI, pengeringan beku, bahan pelindung, probiotik

6 Hak Cipta milik IPB, tahun 2008 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

7 PENGGUNAAN BERBAGAI JENIS BAHAN PELINDUNG UNTUK MEMPERTAHANKAN VIABILITAS BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI AIR SUSU IBU (ASI) PADA PROSES PENGERINGAN BEKU DAN PENYIMPANAN NI NYOMAN PUSPAWATI Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Pangan SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

8 Judul Tesis : Penggunaan Berbagai Jenis Bahan Pelindung untuk Mempertahankan Viabilitas Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Air Susu Ibu (ASI) pada Proses Pengeringan Beku dan Penyimpanan Nama : Ni Nyoman Puspawati NRP : F Program Studi : Ilmu Pangan Disetujui, Komisi Pembimbing Dr. Ir. Lilis Nuraida, M.Sc. Ketua Dr. Ir. Dede Robiatul Adawiyah, M.Si. Anggota Diketahui, Ketua Program Studi Ilmu Pangan Dekan Sekolah Pascasarjana Dr.Ir. Ratih Dewanti Hariyadi, M.Sc. Prof.Dr.Ir.Khairil Anwar Notodiputro, MS. Tanggal Ujian: 19 November 2008 Tanggal Lulus:

9 PRAKATA Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas segala karunia-nya sehingga penulis mampu menyelesaikan tugas akhir penelitian yang berjudul Penggunaan Berbagai Jenis Bahan Pelindung untuk Mempertahankan Viabilitas Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Air Susu Ibu (ASI) pada Proses Pengeringan Beku dan Penyimpanan disusun dalam rangka menyelesaikan tugas akhir pada Program Studi Ilmu Pangan, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Penyelesaian penulisan tesis ini tidak terlepas dari bantuan, arahan dan dorongan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaiakn ucapan terimakasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada: 1. Dr. Ir. Lilis Nuraida, M.Sc. sebagai ketua komisi pembimbing yang dengan segala dedikasi, arahan, bimbingan dan waktu yang telah diberikan dalam menyelesaikan tesis ini. 2. Dr. Ir. Dede Robiatul Adawiyah, M.Si. selaku anggota komisi pembimbing yang dengan sabar memberikan bimbingan, motivasi dan masukan-masukan, yang sangat berharga dalam menyelesaikan tesis ini. 3. Dr. Ir. Nuri Andarwulan, M.Si. selaku penguji luar komisi atas perhatian dan masukan-masukan yang sangat berharga yang telah diberikan dalam menyelesaikan tesis ini. 4. Ayahanda I Wayan Sukita dan ibunda Ni Made Asih, ayah dan bunda penulis atas kasih sayangnya yang tiada henti dan doa restu yang telah diberikan selama ini kepada penulis. 5. Pemerintah Republik Indonesia khususnya Direktur Jenderal Pendidikan Tinggi yang telah memberikan beasiswa BPPS bagi penulis. 6. Dosen dan pegawai di Program Studi Ilmu Pangan Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, yang telah memberikan berbagai fasilitas dan kemudahan selama mengikuti kegiatan akademis. 7. Seluruh saudara-saudaraku tersayang, keponakanku Enjie, Ochi, Didia dan Kesya yang selalu mampu memberikan tawa dan penghiburan tiada henti bagi penulis.

10 8. Seluruh teman-teman seperjuangan di Program Studi Ilmu Pangan khususnya Angkatan 2006; Via, Sil, Fin, Reza, Tety, Santi yang merupakan sumber inspirasi, tawa dan semangat yang tiada pernah habis selama menempuh pendidikan di PS. Ilmu Pangan. 9. Teman teman di lab; Mba Ari, Sofah, Bu Entin, Bu Sari, Mas Tofik yang telah banyak meluangkan waktu untuk membantu dan menemani penulis selama menyelesaikan hari-hari melelahkan di laboratorium. 10. Teman-teman seperjuangan di Wisma Gardu Raya: Ibu Ni Made Laksmi Ernawati, Bapak Nyoman Suarsana, Bapak Ngurah Sudisma, Rai Widarta, Ketut Sutiari, Wayan Sukanata, Gus Yoga, Yuli, Arnata, Mbok Diah, Yudi dan Pak Rai Yasa atas segala warna warni kehidupan selama di Bogor, tali persaudaraan baik dalam suka maupun duka. Kepada semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu, penulis juga menyampaikan terimakasih dan penghargaan yang setinggitingginya. Karya ini merupakan persembahan terbaik penulis, namun tiada luput dari kekurangan walau demikian penulis tetap berharap semoga karya ini dapat bermanfaat bagi yang membacanya. Bogor, November 2008 Ni Nyoman Puspawati

11 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada tanggal 10 Mei 1979 di Kota Singaraja, Kabupaten Buleleng, Propinsi Bali, sebagai putri ketiga dari ayah I Wayan Sukita dan ibu Ni Made Asih. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SD Negeri 2 Paket Agung pada tahun Pada tahun 1994 penulis menamatkan pendidikan sekolah menengah pertama di SMP Negeri 1 Singaraja dan pada tahun 1997 menyelesaikan pendidikan sekolah menengah atas di SMU Negeri 1 Singaraja. Pada tahun 1997 penulis melanjutkan pendidikan sarjana di Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana jurusan Teknologi Hasil Pertanian dan tamat pada tahun Pada tahun 2006 penulis mendapat beasiswa BPPS untuk melanjutkan pendidikan pascasarjana untuk Program Magister Sains di Program Studi Ilmu Pangan, Institut Pertanian Bogor. Pada tahun 2004 sampai sekarang penulis bekerja sebagai staf pengajar di Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Udayana. Selama mengikuti program S2, penulis aktif menjadi anggota Forum Mahasiswa Pascasarjana (Formasip), Program studi Ilmu Pangan IPB.

12 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR ISI... xii DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR... DAFTAR LAMPIRAN... xiv xv xvii PENDAHULUAN... 1 Latar Belakang... 1 Tujuan Penelitian... 5 Hipotesis... 5 Perumusan Masalah... 5 Manfaat Penelitian TINJAUAN PUSTAKA... 7 Bakteri Asam Laktat... 7 Peranan Bakteri Asam Laktat dalam Fermentasi... 9 Bakteri Asam Laktat sebagai Probiotik Isolat Bakteri Asam Laktat Asal Air Susu Ibu (ASI) Pengawetan Kultur Bakteri Asam Laktat Bahan pelindung (kriogenik) Stabilitas Kultur Kering Lactobacillus Selama Penyimpanan BAHAN DAN METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Bahan dan Alat Pelaksanaan Penelitian Metode Analisis HASIL DAN PEMBAHASAN Konfirmasi Kultur Bakteri Asam Laktat Kurva Pertumbuhan Kultur Bakteri Asam Laktat Pengaruh Bahan Pelindung (Kriogenik) terhadap Bakteri Asam Laktat Selama Pengeringan Beku (Freeze Drying) Perubahan Total Bakteri Asam Laktat selama pengeringan Beku Ketahanan terhadap ph Rendah (ph 2,0) Ketahanan terhadap Garam Empedu 0,5% Perkiraan Jumlah Bakteri Asam Laktat yang Mencapai Kolon Pengaruh Penyimpanan terhadap Viabilitas Kultur Kering Beku Lactobacillus rhamnosus R Pengaruh Kadar Air dan a w terhadap Viabilitas Kultur Kering Lactobacillus rhamnosus R

13 Pengaruh Viabilitas dan Kadar Air Kultur Kering Lactobacillus rhamnosus R21 terhadap Aktivitas Asidifikasi Total Kapang Khamir Pendugaan Umur Simpan Kultur Kering Lactobacillus rhamnosus R SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN

14 DAFTAR TABEL Halaman 1. Karakteristik tiga grup Lactobacillus Populasi kelompok bakteri utama pada usus manusia Komposisi maltodekstrin DE 15 dan Tahapan penelitian, tujuan dan hasil yang diharapkan Ringkasan percobaan dari tiap percobaan penelitian Hasil konfirmasi bakteri asam laktat Perkiraan jumlah bakteri asam laktat yang mampu mencapai kolon Pendugaan umur simpan kultur kering Lactobacillus rhamnosus R21 pada RH 75 dan 80, pada suhu 30 o C Pendugaan umur simpan kultur kering Lactobacillus rhamnosus R21 pada RH 75 dan 80, pada suhu 30 o C jika diasumsikan kadar air awal 4% bk... 86

15 DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Diagram fase air Diagram alir proses penelitian Diagram alir penentuan kurva pertumbuhan bakteri asam laktat Diagram alir pembuatan biomassa Skema uji ketahanan isolat bakteri asam laktat terhadap ph rendah Kultur Pediococcus pentosaceus A Kultur Lactobacillus brevis A Kultur Lactobacillus rhamnosus R Kurva pertumbuhan isolat bakteri asam laktat dari ASI Penurunan jumlah bakteri asam laktat setelah proses pengeringan beku (Freeze Drying), (a) Pediococcus pentosaceus A16, (b) Lactobacillus brevis A17, (c) Lactobacillus rhamnosus R Penurunan jumlah bakteri asam laktat setelah proses pengeringan beku inkubasi dalam media MRSB dengan ph 2,0 selama 5 jam (a) Pediococcus pentosaceus A16, (b) Lactobacillus brevis A17, (c) Lactobacillus rhamnosus R Penurunan jumlah bakteri asam laktat setelah proses pengeringan beku inkubasi dalam media MRSB yang mengandung garam empedu 0,5% selama 5 jam(a) Pediococcus pentosaceus A16, (b) Lactobacillus brevis A17, (c) Lactobacillus rhamnosus R Peningkatan kadar air kultur kering Lactobacillus rhamnosus R21 selama penyimpanan pada RH 75 dan RH Peningkatan aktivitas air (a w ) kultur kering Lactobacillus rhamnosus R21 selama penyimpanan pada RH 75 dan RH Hubungan total bakteri asam laktat dengan kadar air selama penyimpanan Hubungan total bakteri asam laktat dengan aktivitas air (a w ) selama penyimpanan... 75

16 17. Hubungan total bakteri asam laktat dengan total asam tertitrasi yang dihasilkan pada susu skim yang diasamkan selama 10 jam Hubungan total bakteri asam laktat dengan ph yang dihasilkan pada susu skim yang diasamkan selama 10 jam Hubungan kadar air kultur kering Lactobacillus rhamnosus R21 dengan total asam tertitrasi yang dihasilkan pada susu skim yang diasamkan selama 10 jam Hubungan kadar air kultur kering Lactobacillus rhamnosus R21 dengan ph yang dihasilkan pada susu skim yang diasamkan selama 10 jam Hubungan total bakteri asam laktat dengan kadar air selama penyimpanan untuk penentuan kadar air kritis (Mc) Kurva sorpsi isotermis kultur kering Lactobacillus rhamnosus R21 untuk penentuan kadar air kesetimbangan (Me)... 84

17 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Hasil konfirmasi bakteri asam laktat dengan menggunakan API 50 CHL Data absorbansi atau optical density (λ = 600 nm) pada penentuan kurva pertumbuhan kultur bakteri asam laktat Pembuatan kultur kering beku bakteri asam laktat dengan pengeringan beku Produk kultur kering beku dari isolat Pediococcus pentosaceus A Produk kultur kering beku dari isolat Lactobacillus brevis A Produk kultur kering beku dari isolat Lactobacillus rhamnosus R Data ketahanan kultur kering beku setelah pengeringan beku Data total bakteri asam laktat Pediococcus pentosaceus A Data total bakteri asam laktat Lactobacillus brevis A Data total bakteri asam laktat Lactobacillus rhamnosus R Perhitungan statistik ketahanan kultur kering beku setelah pengeringan beku Data ketahanan kultur kering beku terhadap ph rendah (ph 2,0) Data ketahanan kultur kering beku Pediococcus pentosaceus A16 terhadap ph rendah (ph 2,0) Data ketahanan kultur kering beku Lactobacillus brevis A17 terhadap ph rendah (ph 2,0) Data ketahanan kultur kering beku Lactobacillus rhamnosus R21 terhadap ph rendah (ph 2,0) Perhitungan statistik ketahanan kultur kering beku setelah pengeringan beku terhadap ph rendah (ph 2,0) Data ketahanan kultur kering beku terhadap garam empedu (0,5 %)

18 18. Data ketahanan kultur kering beku Pediococcus pentosaceus A16 terhadap garam empedu (0,5 %) Data ketahanan kultur kering beku Lactobacillus brevis A17 terhadap garam empedu (0,5 %) Data ketahanan kultur kering beku Lactobacillus rhamnosus R21 terhadap garam empedu (0,5 %) Perhitungan statistik ketahanan kultur kering beku terhadap garam empedu (0,5 %) Data perkiraan jumlah bakteri asam laktat yang mampu mencapai kolon Perhitungan statistik jumlah bakteri asam laktat yang mampu mencapai kolon Kultur kering beku selama penyimpanan pada RH Kultur kering beku selama penyimpanan pada RH Data kadar air kultur kering beku selama penyimpanan Data aktivitas air kultur kering beku selama penyimpanan Data total BAL kultur kering beku selama penyimpanan Data total asam tertitrasi (%) pada susu skim yang diinokulasi dengan kultur kering beku selama penyimpanan Data keasaman (ph) pada susu skim yang diinokulasi dengan kultur kering beku selama penyimpanan Tekanan uap air jenuh pada suhu 0 60 o C (mmhg) Pendugaan umur simpan kultur kering beku Lactobacillus rhamnosus R Pendugaan umur simpan kultur kering beku Lactobacillus rhamnosus R21 jika kadar air awal maksimal diasumsikan 4% bk (0,04 g H 2 O/g padatan)

19 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Ir. Nuri Andarwulan, M.Si.

20 PENDAHULUAN Latar Belakang Bakteri asam laktat merupakan mikroorganisme yang penting dalam teknologi fermentasi pangan karena mempunyai kemampuan untuk memperbaiki citarasa, tekstur dan aroma produk akhir yang secara organoleptik dan kualitas lebih dapat diterima oleh konsumen. Bakteri asam laktat umumnya digunakan pada produksi makanan fermentasi seperti keju, yoghurt, sosis, wine, adonan roti dan sauerkraut. Selain itu bakteri asam laktat juga mempunyai kemampuan sebagai antimikroba baik itu anti bakteri maupun antimitotik. Sampai saat ini penggunaan bakteri asam laktat tidak hanya sebagai mikroorganisme yang berperan pada proses fermentasi pangan, namun juga dapat digunakan sebagai pangan fungsional seperti pengembangan produk probiotik. Bakteri asam laktat sebagai mikroorganisme probiotik memegang peranan penting dalam meningkatkan dan menjaga kesehatan sehingga mendorong penggunaan bakteri asam laktat untuk pengembangan pangan fungsional dan farmasetikal. Probiotik didefinisikan sebagai mikroorganisme hidup yang mampu mencapai saluran pencernaan dalam jumlah tertentu dan memberi manfaat terhadap kesehatan. Probiotik merupakan mikroorganisme hidup yang digunakan dalam produk makanan dengan tujuan untuk meningkatkan kesehatan dengan mempengaruhi keseimbangan mikroflora usus (Fuller 1989). Bakteri probiotik mempunyai mekanisme untuk mempertahankan mikroflora saluran pencernaan sehingga dapat mengatasi masalah gangguan pencernaan. Untuk dapat berfungsi sebagai probiotik, bakteri harus memenuhi persyaratan antara lain; berasal dari manusia, tidak bersifat patogen, toleran terhadap asam lambung dan garam empedu, mempunyai kemampuan untuk bertahan dalam proses pengawetan dan selama penyimpanan, serta telah terbukti mempunyai efek terhadap kesehatan (Shortt 1999). Kemampuan untuk menempel dan mengkoloni usus minimal dalam jangka waktu pendek (untuk sementara) juga merupakan salah satu syarat dari galur probiotik untuk dapat memberikan manfaat sepenuhnya (Lick et al. 2001).

21 2 Bakteri asam laktat yang bersifat probiotik umumnya diisolasi dari sampel klinis. Hal ini didasarkan pada asumsi bahwa isolat klinis dapat bertahan pada kondisi saluran pencernaan manusia. Nuraida et al. (2008) mengisolasi bakteri asam laktat dari air susu ibu (ASI) diantaranya Pediococcus pentosaceus A16, Lactobacillus rhamnosus R21 dan Lactobacillus brevis A17. Isolat-isolat tersebut memiliki karakteristik sebagai probiotik dimana secara in vitro memiliki sifat tahan terhadap garam empedu, tahan terhadap ph rendah, dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen seperti: Eschericia coli, Bacillus cereus dan Staphylococcus aureus. Pengujian secara in vivo menunjukkan bahwa isolat tersebut memiliki kemampuan dapat meningkatkan jumlah bakteri asam laktat serta dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen seperti E. coli di sekum. Manfaat bakteri asam laktat sebagai probiotik dalam meningkatkan kesehatan dapat terjadi bila kultur dikonsumsi dalam keadaan hidup dan mampu bertahan dalam saluran pencernaan, selain itu bakteri asam laktat juga harus mampu bertahan selama proses pengolahan dan selama penyimpanan. Untuk dapat berperan sebagai probiotik, bakteri asam laktat harus berada dalam jumlah cukup untuk mencapai saluran pencernaan. Jumlah sel mikroba hidup yang harus terdapat pada produk probiotik masih menjadi perdebatan tetapi umumnya sebesar cfu/ml (Tannock 1999). Proses pengolahan pangan seperti pendinginan maupun pengeringan dapat mengurangi bakteri asam laktat karena perlakuan-perlakuan yang diberikan. Proses penyimpanan dan pengolahan dapat menurunkan jumlah bakteri asam laktat sehingga perannya sebagai probiotik juga akan menurun. Kerusakan sel bakteri asam laktat yang diakibatkan karena perlakuan pengolahan dapat menyebabkan tidak berfungsinya produk tersebut sebagai probiotik. Disisi lain, penyimpanan kultur dalam keadaan segar tidak dapat dilakukan untuk jangka waktu yang lama. Dengan demikian perlu suatu metode pengawetan (preservasi) bakteri asam laktat yang dapat mempertahankan viabilitasnya. Proses preservasi merupakan salah satu tahapan untuk mempertahankan sifat-sifat dan keunggulan dari suatu isolat bakteri asam laktat yang berpotensi sebagai probiotik. Enkapsulasi merupakan salah satu cara untuk mempertahankan viabilitas probiotik dan melindungi probiotik dari kerusakan akibat kondisi

22 3 lingkungan yang tidak menguntungkan seperti asam lambung dan garam empedu (Wu et al. 2000). Di Indonesia, bakteri asam laktat digunakan untuk kultur starter ataupun produk probiotik. Kultur bakteri asam laktat biasanya disimpan dalam bentuk beku atau kering. Pada proses penyimpanan kultur bakteri dapat mengalami penurunan viabilitas akibat kematian sel, perubahan sifat genetik bahkan kemungkinan kehilangan sifat-sifat potensialnya. Untuk mendapatkan kultur probiotik bakteri asam laktat yang mengandung sel hidup dalam jumlah tinggi dan tahan lama maka dapat diawetkan dengan cara pengeringan semprot (spray drying), pembekuan (freezing) dan pengeringan beku (freeze drying) (Fu & Etzel 1995). Pengeringan beku (freeze drying) merupakan teknik yang umumnya digunakan untuk mempertahankan atau mengawetkan kultur dan untuk produksi konsentrat kultur starter. Adanya komponen terlarut yang cocok dalam medium pengeringan dapat meningkatkan ketahanan mikroba terhadap proses pengeringan tersebut. Nuraida et al. (1995) dan Harmayani et al. (2001) menyatakan bahwa penggunaan teknik pengawetan yang tepat seperti oven vakum, pengeringan semprot (spray drying) dapat mempertahankan viabilitas sel bakteri. Pengawetan kultur starter yoghurt dengan menggunakan oven vakum diperoleh hasil penurunan jumlah sel dari 10 8 koloni/g menjadi 10 7 koloni/g (Nuraida et al. 1995). Pada penelitian yang dilakukan oleh Harmayani et al. (2001) menunjukkan bahwa pengawetan kultur Lactobacillus sp dengan metode pengering semprot diperoleh hasil penurunan jumlah sel dari 10 9 cfu/ml menjadi 10 8 cfu/g sedangkan dengan pengeringan beku diperoleh penurunan sel dari cfu/g menjadi cfu/g. Pada proses pengeringan kultur bakteri berarti akan terjadi perubahan kondisi kultur dari fase cair menjadi fase padat (bentuk kering). Hal ini akan berpengaruh terhadap sifat-sifat kultur yang dimiliki. Kultur bakteri asam laktat akan kehilangan air yang cukup banyak di dalam sel sehingga proses metabolisme dan aktivitas seluler berhenti atau sel berada pada masa istirahat (dorman), namun resistensi bakteri asam laktat terhadap proses pengeringan beku tergantung pada strain bakteri asam laktat dan kondisi kultur sebelum dibekukan, cara pemanenan,

23 4 formulasi medium pembekuan, kondisi pembekuan dan kondisi pengeringan beku (Fonseca et al. 2006). Kemampuan bakteri asam laktat untuk bertahan terhadap proses pengeringan beku sangat penting untuk mempertahankan karakteristik bakteri asam laktat pada proses fementasi serta untuk mempertahankan karakteristik probiotik sedangkan respon bakteri asam laktat terhadap proses pengeringan beku sangat bervariasi diantara spesies bakteri asam laktat. Kerusakan sel bakteri asam laktat akibat proses pengeringan beku dapat diminimumkan dengan penambahan bahan pelindung tertentu sebelum proses pembekuan dan pengeringan beku dilakukan (Tamime 1981). Enkapsulasi merupakan salah satu cara untuk mempertahankan viabilitas probiotik dari kerusakan akibat kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan seperti asam lambung dan garam empedu (Wu et al. 2000). Lingkungan penyimpanan berpengaruh terhadap kerusakan kultur sel. Suhu dan kelembaban ruang penyimpanan akan mempengaruhi ketahanan kultur sel. Enkapsulasi Lactobacillus acidophilus R0052 dapat menghasilkan viabilitas sel dari 9,1 x 10 9 cfu menjadi 5,3 x 10 9 pada hari ke 50 pada penyimpanan 4 o C dengan kelembaban (RH 75) (Siuta-Cruce & Goulet 2001). Untuk melengkapi informasi yang akan mendasari penggunaan bakteri asam laktat asal ASI yang secara in vitro telah mampu menunjukkan kemampuannya sebagai probiotik maka perlu juga diketahui viabilitas dan ketahanannya terhadap proses pengeringan beku (freeze drying). Untuk menekan kerusakan karena proses pengeringan beku maka perlu di cari bahan pelindung (kriogenik) yang dapat menekan sekecil mungkin penurunan mutu kultur kering beku yang dihasilkan dan stabilitas kultur kering beku selama penyimpanan pada RH tertentu yang dapat mempertahankan viabilitasnya.

24 5 Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh isolat ASI yang memiliki ketahanan terbaik terhadap proses pengeringan beku (freeze drying), mengidentifikasi jenis bahan pelindung (kriogenik) yang dapat mempertahankan viabilitas isolat asal ASI selama proses pengeringan beku (freeze drying) dan mengevaluasi stabilitas kultur kering bakteri asam laktat selama penyimpanan serta melakukan pendugaan umur simpan kultur kering beku isolat asal ASI. Hipotesis Spesies dan strain bakteri asam laktat yang berbeda akan memiliki ketahanan yang berbeda terhadap proses pengeringan beku. Penggunaan bahan pelindung (kriogenik) dapat meningkatkan ketahanan kultur yang berasal dari ASI terhadap proses pengeringan beku dan melindungi sel terhadap ph rendah dan garam empedu 0,5%. Penyimpanan kultur kering beku pada RH rendah akan mampu memperpanjang umur simpan lebih lama sedangkan viabilitas kultur bakteri asam laktat selama penyimpanan dapat mengalami penurunan. Perumusan Masalah Pengawetan kultur dengan proses pembekuan dan pengeringan dapat menurunkan viabilitas yang mengakibatkan perubahan sifat fungsional kultur bakteri asam laktat. Oleh karena itu perlu dicari suatu metode pengawetan yang dapat meminimalkan kerusakan sel dan mempertahankan sifat fungsionalnya. Viabilitas kultur akan menurun selama proses penyimpanan karena pengaruh lingkungan. Oleh karena itu perlu dicari kondisi penyimpanan yang dapat mempertahankan viabilitas kultur bakteri asam laktat.

25 6 Manfaat Penelitian Manfaat dari penelitian ini adalah: 1. Memberikan informasi tentang viabilitas kultur bakteri asam laktat yang berasal dari ASI selama proses pengeringan beku. 2. Mengetahui berbagai jenis bahan pelindung (kriogenik) yang berpengaruh terhadap viabilitas sel selama proses pengeringan beku (freeze drying). 3. Memberikan informasi tentang pengaruh kelembaban terhadap viabilitas sel selama penyimpanan dimana selanjutnya dapat digunakan untuk menduga umur simpan kultur kering beku bakteri asam laktat.

26 7 TINJAUAN PUSTAKA Bakteri Asam Laktat Bakteri asam laktat merupakan bakteri gram positif, bersifat anaerob aerotoleran, tahan asam, fermentatif, berbentuk batang dan bulat, habitatnya harus kaya nutrisi (fastidious), komposisi basa nitrogen DNA kurang dari 50% mol G + C (Axelsson 2004; Adam & Moss 1995). Bakteri tersebut umumnya bersifat katalase negatif tetapi kadang-kadang terdeteksi katalase semu pada kultur yang ditumbuhkan pada konsentrasi gula rendah. Pertumbuhannya membutuhkan karbohidrat yang dapat difermentasi (Pot et al. 1994). Bakteri asam laktat secara alami dapat berasal dari saluran pencernaan manusia, produk-produk susu dan permukaan tanaman tertentu. Beberapa spesies bakteri asam laktat dapat digunakan secara komersial untuk memproduksi susu fermentasi dan produk-produk daging. Menurut Hayakawa (1992), bakteri asam laktat adalah kelompok bakteri yang menguntungkan yang dapat memfermentasi gula sebagai sumber energi untuk memproduksi asam laktat dalam jumlah besar dan jika memecah protein, tidak membentuk senyawa putrefaktif (senyawa yang berbau busuk). Dalam produk pangan umumnya bakteri asam laktat tidak berbahaya dan memenuhi status GRAS (Generally Recognized As Safe). Bahkan bakteri ini dapat memberi efek bermanfaat bagi manusia karena komponen metabolit yang dihasilkannya dapat menghambat bakteri enterik patogen, mengatasi masalah lactose intolerance, menurunkan kadar kolesterol, antimutagenik dan antikarsinogenik serta memperbaiki sistem kekebalan tubuh (Surono 1998). Pada awalnya, bakteri asam laktat dibedakan menjadi 4 genus yaitu Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus dan Pediococcus, dimana didasarkan pada ciri morfologi, tipe fermentasi, perbedaan tumbuh pada suhu tertentu, konfigurasi produksi asam laktat (D-asam laktat atau L-asam laktat), kemampuan tumbuh pada konsentrasi garam tinggi dan kemampuan toleransinya terhadap asam dan basa. Klasifikasi bakteri asam laktat selanjutnya berkembang

27 8 berdasarkan perbedaan komposisi asam lemak pada membran sel, motilitas, urutan rrna dan persentase guanin dan sitosin (% G dan % C) pada DNA (Pot et al. 1994). Genus Lactobacillus berkembang menjadi Lactobacillus dan Carnobacterium, genus Streptococcus berkembang menjadi 4 yaitu: Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus dan Enterococcus. Genus Pediococcus berkembang menjadi Pediococcus, Tetragenococcus dan Aerococcus sedangkan pada genus Leuconostoc tidak mengalami perubahan. Menurut Fardiaz (1989), klasifikasi bakteri asam laktat yang tidak kalah penting adalah kemampuan dalam memfermentasi glukosa yang dibedakan menjadi homofermentatif dan heterofermentatif. Bakteri asam laktat homofermentatif dapat mengubah keseluruhan glukosa menjadi asam laktat sedangkan bakteri asam laktat heterofermentatif mempunyai kemampuan untuk memfermentasikan glukosa menjadi asam laktat, etanol/asam asetat dan CO 2. Bakteri asam laktat homofermentatif sering digunakan dalam pengawetan pangan karena produksi asam laktat dalam jumlah besar dan mampu menghambat bakteri penyebab kerusakan pada bahan pangan sedangkan bakteri asam laktat heterofermentatif lebih banyak dimanfaatkan dalam pembentukan flavor dan komponen aroma seperti asetaldehid dan diasetil. Namun kedua jenis bakteri asam laktat tersebut tetap memiliki kemampuan untuk menghasilkan asam organik, hidrogen peroksida dan bakteriosin (Gomes & Malcata 1999). Tabel 1. Karakteristik tiga grup genus Lactobacillus Grup I: Grup II: Grup III: Karakteristik Obligat Fakultatif Obligat homofermentatif heterofermentatif heterofermentatif Fermentasi pentosa CO 2 dari Glukosa CO 2 dari Glukonat - + a + a Aldolase Fosfoketolase - + b + Spesies L. acidophilus L. delbrueckii L. helveticus L. salivarius L. casei L. curvatus L. plantarum L. sake L. brevis L. buchneri L. fermentum L. reuteri Keterangan: a : pada saat fermentasi b : induksi oleh pentosa Sumber : Axelsson (2004) diacu dalam Salminen et al. (2004)

28 9 Bakteri asam laktat mempunyai aktivitas antimikroba berupa produk asam organik (asam laktat, asam format dan asam asetat), diasetil, hidrogen peroksida, karbondioksida dan bakteriosin (Larsen et al. 1993; De Vuyst & Vandamme 1994). Menurut Ouwehand diacu dalam Salminen dan Wright (2004), asam organik (asam laktat dan asam asetat) menyebabkan penurunan ph sitoplasma yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba. Hal ini disebabkan akumulasi anion yang terbentuk menyebabkan penurunan laju sintesis makromolekul dan mempengaruhi perpindahan senyawa melalui membran sel. Golongan Bifidobacterium memiliki % mol G + C diatas 55 %, walaupun % G + C-nya berbeda dengan bakteri asam laktat namun karena memiliki sifat fungsional yang sama dengan bakteri asam laktat maka seringkali dimasukkan sebagai bakteri asam laktat. Peranan Bakteri Asam Laktat dalam Fermentasi Bakteri asam laktat mempunyai peranan yang sangat penting dalam proses fermentasi pangan. Fermentasi makanan yang melibatkan bakteri asam laktat merupakan salah satu cara untuk mengawetkan makanan. Hal ini disebabkan karena bakteri asam laktat menghasilkan asam laktat dan berbagai senyawa metabolit yang bersifat sebagai antimikroba. Bakteri asam laktat menjadi penting dalam pengolahan makanan karena kemampuannya memproduksi berbagai macam senyawa yang berperan terhadap flavor, warna, tekstur dan konsistensi makanan fermentasi yang dihasilkan (Surono 2004). Makanan fermentasi memiliki citarasa yang lebih enak dibandingkan dalam bentuk segarnya dan mempunyai nilai gizi yang lebih tinggi pula karena umumnya lebih mudah dicerna karena telah mengalami penguraian selama proses fermentasi. Istilah bakteri asam laktat pertama kali dikenal sebagai organisme pengasam susu. Lactobacillus acidophilus dan Lactobacillus casei yang terdapat pada produk susu fermentasi merupakan galur bakteri asam laktat pertama yang digunakan sebagai probiotik (Tannock 1999). Sejak tahun 1920 di Jepang, produk-produk fermentasi yang mengandung mikroba probiotik untuk konsumsi

29 10 manusia telah banyak dipasarkan. Produk-produk probiotik yang ada saat ini tidak hanya dalam bentuk makanan dan minuman tetapi juga dalam bentuk tablet atau kapsul. Bentuk produk probiotik yang banyak ada pada saat ini seperti susu terfermentasi, makanan bayi, susu formula untuk bayi, produk minuman buah, produk serealia dan farmasetikal (tablet dan kapsul) (Donohue et al. 1998). Konsumsi produk pangan yang mengandung kultur bakteri probiotik dapat menstimulasi pertumbuhan mikroorganisme yang menguntungkan, menekan jumlah bakteri yang merugikan dan mengembalikan mekanisme pertahanan alami tubuh (Dunne 2001; Gismondo et al. 1999). Peranan utama bakteri asam laktat adalah sebagai kultur starter dalam produk-produk yang melibatkan proses fermentasi untuk memperoleh produk akhir dengan tingkat konsistensi yang tinggi. Selain itu juga dapat mempunyai efek untuk mengawetkan produk fermentasi yang diinginkan. Bakteri asam laktat homofermentatif sering digunakan sebagai pengawet pada makanan karena dapat menghasilkan asam laktat dalam jumlah yang lebih banyak dan mampu menghambat bakteri penyebab kebusukan pada makanan dan bakteri patogen lainnya sedangkan bakteri asam laktat yang bersifat heterofermentatif lebih ditujukan pada pembentukan flavor dan komponen aroma seperti asetaldehid dan diasetil (Axelsson 2004 diacu dalam Salminen et al. 2004). Produk makanan fermentasi yang melibatkan bakteri asam laktat dikelompokkan menjadi dua yaitu produk fermentasi susu dan produk fermentasi non-susu. Lactobacillus banyak digunakan pada produk makanan fermentasi seperti produk-produk susu fermentasi (yogurt, keju, yakult), produk fermentasi daging (sosis fermentasi), serta produk fermentasi sayuran (pikel dan sauerkraut). Lactobacillus berkontribusi untuk pengawetan, ketersediaan nutrisi dan flavor pada produk fermentasi tersebut. Chateau et al. (1993) diacu dalam Meutia (2003) menyatakan bahwa galur murni Lactobacillus sp. yang diisolasi dari produk probiotik komersial mampu menghambat L. monocytogenes, E. coli, S. typhimurium dan S. enteritidis. Sifat antimikroba patogen yang dimiliki oleh bakteri asam laktat disebabkan oleh sifatnya yang cocok dengan nutrisi yang tersedia sehingga lebih unggul dalam berkompetisi dengan mikroba patogen. Disamping itu bakteri asam laktat juga menghasilkan metabolit seperti asam

30 11 organik, H 2 O 2, bakteriosin dan dapat menstimulir sistem kekebalan tubuh (Surono 1997). Pediococci merupakan bakteri asam laktat yang berbentuk bulat dan termasuk bakteri gram positif, bersifat homofermentatif. Pediococci memegang peranan penting pada teknologi pangan. Karakteristik utama yang membedakan spesies pada Pediococcus adalah kemampuannya memfermentasikan gula, kemampuan menghidrolisis arginin, pertumbuhan pada ph yang berbeda (ph 7,0 dan ph 4,5), serta konfigurasi asam laktat yang dihasilkan. Beberapa spesies Pediococcus memiliki pengaruh negatif pada industri pangan, contohnya P. damnosus yang memiliki pengaruh buruk pada industri bir dimana bakteri ini dapat menghasilkan diacetyl atau membentuk acetoin yang dapat menimbulkan rasa asam. Namun disisi lain ada beberapa spesies Pediococcus yang mempunyai pengaruh positif seperti P. acidilactici dan P. pentocaseus dapat digunakan sebagai kultur starter pada proses pembuatan sosis dan sebagai inokulan silase. Pediococci juga berperan penting pada proses pematangan keju (Axelsson 2004). Spesies Pediococcus yang paling sering digunakan dalam industri adalah Pediococcus pentosaceus dan Pediococcus acidilactici, yang digunakan sebagai kultur starter pada proses fermentasi daging dan sayur (Baliarda et al. 2002). Pediococcus pentosaceus biasanya dihubungkan dengan makanan tradisional seperti fermentasi maizena (kenkey) (Halm et al. 1993; Olsen et al. 1995) dan roti (Gassem 1999 diacu dalam Baliarda et al. 2002). Strain ini juga memiliki peran dalam proses pematangan keju (Bhowmik & Marth 1990 diacu dalam Baliarda et al. 2002). Lactobacillus brevis merupakan bakteri asam laktat yang berbentuk batang. Di dalam Bergey s Manual for Determinative Bacteriology (1974) disebutkan bahwa Lactobacillus brevis hidup dalam bentuk tunggal atau rantai pendek, berukuran diameter 0,7 1,0 μm dan panjang 2,0 4,0 μm, bersifat nonmotil. Lactobacillus brevis bersifat obligat heterofermentatif, dapat menghasilkan asam asetat, CO 2 dan etanol dari fermentasi karbohidrat (Axelsson 2004 diacu dalam Salminen et al. 2004). Suhu optimum pertumbuhan Lactobacillus brevis sekitar 30 o C, dapat tumbuh pada ph rendah namun

31 12 ketahanannya tergantung pada jenis asam. Pada asam laktat hanya tahan serendahrendahnya pada ph 3,7 (Juven 1976 diacu dalam ICMFS 1980). Pada industri pangan, Lactobacillus brevis berperan pada tahap kedua fermentasi sayuran seperti asinan, pikel ketimun dan kol (Stamer 1983), fermented olive (Diez 1983), pembuatan kefir (Bottazi 1983) dan dalam pembentukan flavor pada minuman anggur (Ribereau-Gayon et al di acu dalam Lafon- Lafourcade 1983). Lactobacillus brevis dalam jumlah berlebihan dapat mengakibatkan kerusakan pada anggur dan bir karena membentuk kekeruhan dan aroma yang tidak disukai demikian pula pada sari buar (Stamer 1979). Sedangkan pada keju, jumlah Lactobacillus brevis yang berlebihan akan membentuk gelembung gas yang tidak diinginkan akibat produksi CO 2 (Wibowo 1989) Bakteri Asam Laktat sebagai Probiotik Probiotik adalah pangan mengandung mikroorganisme hidup yang secara aktif meningkatkan kesehatan dengan cara memperbaiki keseimbangan flora usus jika dikonsumsi dalam keadaan hidup dalam jumlah yang memadai (Fuller 1989). FAO dan WHO (2001) mendefinisikan probiotik sebagai mikroorganisme hidup (bakteri atau khamir) yang apabila dikonsumsi atau digunakan dalam jumlah yang cukup dapat meningkatkan kesehatan yang mengkonsumsinya. Pada awalnya, definisi probiotik digunakan pada pemberian pakan ternak yang disuplementasi dengan mikroba untuk membantu hewan ternak khususnya dalam saluran pencernaannya. Dalam perkembangannya banyak dilakukan penelitian mengenai mekanisme probiotik dengan menggunakan hewan percobaan untuk diekstrapolasikan pada manusia (Pessi et al. 1998; Fuller 1999). Menurut Shortt (1999), untuk dapat berfungsi sebagai isolat probiotik maka bakteri asam laktat harus memenuhi persyaratan antara lain: 1. Stabil terhadap asam lambung sehingga mampu bertahan dan hidup selama melalui lambung dan usus. 2. Stabil terhadap garam empedu dan mampu bertahan hidup selama berada pada bagian atas usus kecil.

32 13 3. Memproduksi senyawa antimikroba seperti asam laktat, hidrogen peroksida dan bakteriosin. 4. Mampu menempel dan mengkolonisasi sel usus manusia. Hal ini akan mampu meningkatkan kompetisi dengan mikroba patogen dan penyebab karsinogen. 5. Tumbuh baik dan berkembang dalam saluran pencernaan. Pada beberapa genus lactobacili dan bifidobakteria dapat tumbuh baik pada saluran pencernaan tanpa adanya oksigen. 6. Aman digunakan oleh manusia. Pengujian secara in vivo merupakan salah satu indikator bahwa probiotik tersebut dapat dikonsumsi oleh manusia. 7. Tahan terhadap mikrobisida dan spermisidal vaginal. Sifat ini diperlukan untuk probiotik yang ditujukan untuk mengobati infeksi saluran urinovaginal. 8. Koagregasi membentuk lingkungan mikroflora yang normal dan seimbang, koagregasi juga mencerminkan kemampuan interaksi antar kultur untuk saling menempel. Bakteri asam laktat yang tergolong probiotik memiliki dinding sel muramylpeptidase (strain Lactobacillus) yang memiliki efek pirogenik dan antitumor, layaknya strain bakteri lainnya, strain probiotik ini memiliki endotoxic lipopolysakarida, peptidoglikan, lipotheichoic acid yang berguna sebagai imunomodulator (Anonim 2008). Bakteri asam laktat yang berpotensi sebagai probiotik harus tahan terhadap asam lambung dan garam empedu. Hal ini disebabkan karena bila isolat bakteri asam laktat masuk ke dalam saluran pencernaan manusia, maka isolat tersebut harus mampu bertahan dari ph asam lambung untuk mencapai usus. Mitsuoka (1989) melaporkan bahwa pada ph lambung manusia dalam keadaan kosong (tanpa makanan) berkisar antara 3,0 3,5. Asam lambung terdiri atas air (97-99%), musin (lendir) serta garam anorganik, enzim pencernaan (pepsin dan renin) dan lipase. Waktu yang diperlukan mulai saat bakteri masuk sampai keluar dari lambung sekitar 90 menit (Chou & Weimer 1999). Jadi isolat bakteri asam laktat yang digunakan sebagai probiotik harus mampu bertahan dalam keadaan asam di lambung selama sedikitnya 90 menit. Conway et al. (1987) diacu dalam Lick et al. (2001)

33 14 menyatakan bahwa secara in vitro Lactobacillus gasseri dan Lactobacillus acidophilus memiliki ketahanan terhadap asam lambung yang lebih baik dibandingkan dengan Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, sedangkan Streptococcus thermophilus memiliki ketahanan yang sangat rendah. Pertahanan utama sel bakteri terhadap lingkungannya adalah dengan membran seluler yang terdiri atas struktur lemak dua lapis. Bila sel bakteri terpapar pada kondisi yang sangat asam, maka membran sel dapat mengalami kerusakan dan menyebabkan kehilangan komponen-komponen intraseluler seperti Mg, K, lemak dan biasanya kerusakan ini dapat menyebabkan kematian pada sel. Kondisi ini dapat dideteksi dengan cara mengukur konsentrasi komponen intraseluler yang keluar dari dalam sel. Ketahanan bakteri asam laktat yang cukup tinggi terhadap asam lambung disebabkan karena kemampuannya untuk mempertahankan ph sitoplasma lebih basa dari pada ph ektraseluler. Menurut Siegumfeldt et al. (2000), pada bakteri asam laktat terjadi perubahan ph intraseluler secara dinamis seiring dengan terjadinya penurunan ph ekstraseluler sehingga tidak terjadi gradien proton yang besar. Gradien proton yang besar tidak menguntungkan bagi bakteri asam laktat karena gradien proton yang besar memerlukan banyak energi. Selain itu dapat juga menyebabkan terjadinya akumulasi anion, asam organik dalam sitosol yang bersifat toksik bagi sel itu sendiri. Ketahanan bakteri asam laktat yang akan digunakan sebagai probiotik terhadap garam empedu merupakan syarat penting yang harus dipenuhi. Lactobacillus merupakan mikroflora alami pada saluran pencernaan manusia dan mempunyai ketahanan yang bervariasi terhadap garam empedu. Garam empedu disintesis dalam hati dari kolesterol yang menghasilkan senyawa asam empedu primer. Asam empedu ini berkonjugasi dengan glisin dan taurin dan disekresikan ke dalam kantong empedu sebagai asam empedu terkonjugasi. Asam empedu di dalam kantung empedu dilepaskan ke dalam lumen duodenum dalam bentuk misel dengan asam lemak dan gliserol yang dihasilkan oleh pencernaan lipase pankreatik. Sekresi asam empedu ke dalam usus kecil manusia setiap hari berfungsi untuk membantu absorpsi lemak pada makanan, kolesterol, vitamin yang larut

34 15 lemak (hidrofobik) dan senyawa larut lemak yang lain. Asam empedu terkonjugasi akan diserap dari usus kecil (sekitar 97 %) dan dikembalikan ke dalam hati sedangkan sebagian kecil ( mg) yang tidak terserap akan hilang dari tubuh manusia sebagai asam empedu bebas di feses. Mekanisme penyerapan, sintesis kembali dan sekresi asam empedu di usus halus dan usus besar dikenal sebagai sirkulasi hepatik (Surono 2004). Beberapa jenis Lactobacillus mempunyai enzim yang dapat menghidrolisis garam empedu yaitu bile salt hydrolase (BSH). Enzim ini mampu mengubah kemampuan fisik-kimia yang dimiliki oleh garam empedu sehingga menjadi bersifat tidak beracun bagi bakteri asam laktat (Smet et al. 1995). Semakin tinggi konsentrasi garam empedu akan mempengaruhi jumlah bakteri asam laktat dimana jumlahnya akan semakin menurun (Ngatirah et al. 2000; Kusumawati 2002). Hal ini disebabkan karena terjadinya peningkatan aktivitas enzim β-galaktosidase terhadap garam empedu sehingga meningkatkan permeabilitas membran sel. Peningkatan permeabilitas membran sel dapat meningkatkan keluarnya materi intraseluler dari dalam sel dan bila terus terjadi dapat menyebabkan lisis pada sel bakteri. Bakteri asam laktat yang bersifat paling resisten terhadap garam empedu terdapat pada bagian atas usus halus (jejunum). Menurut Ray (1996) dan Drouault et al. (1999) bahwa jumlah bakteri asam laktat yang terdapat pada jejunum lebih rendah dibandingkan pada bagian ileum, caecum dan kolon seperti terlihat pada Tabel 2. Hal ini disebabkan karena konsentrasi garam empedu pada bagian jejunum paling tinggi dari pada bagian ileum dimana karena lokasinya paling dekat bila garam empedu masuk ke dalam saluran usus. Wirawati (2002) melaporkan bahwa ketahanan isolat bakteri asam laktat yang berasal dari tempoyak terhadap garam empedu 0,3% berkisar antara 34,8 100 %. Pada kisaran tersebut diketahui bahwa isolat bakteri asam laktat relatif tahan terhadap garam empedu bahkan untuk isolat L. plantarum To 8 tidak menunjukkan adanya penurunan selama inkubasi 24 jam.