KARAKTERISASI MOLEKULAR DAN UJI AKTIVITAS BAKTERI PEREDUKSI NITRAT DARI MUARA CIMANDIRI PELABUHAN RATU SUKABUMI JAWA BARAT HURIA MARNIS

Transkripsi

1 KARAKTERISASI MOLEKULAR DAN UJI AKTIVITAS BAKTERI PEREDUKSI NITRAT DARI MUARA CIMANDIRI PELABUHAN RATU SUKABUMI JAWA BARAT HURIA MARNIS SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

2 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Karakterisasi Molekular dan Uji Aktivitas Bakteri Pereduksi Nitrat dari Muara Cimandiri Pelabuhan Ratu Sukabumi Jawa Barat adalah benar hasil karya saya sendiri. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Januari 2008 Huria Marnis P

3 RINGKASAN Aktivitas bakteri pereduksi nitrat di lingkungan aquatik dapat menghasilkan nitrous oksida (N 2 O) melalui proses denitrifikasi dan reduksi nitrat menjadi amonium dissimilatif. Pada penelitian ini dilakukan isolasi dan karakterisasi bakteri pereduksi nitrat dari muara Sungai Cimandiri. Sebanyak 22 isolat bakteri pereduksi nitrat diperoleh dari medium pengkayaan dengan konsentrasi nitrat 100 µm dan 2000 µm, 15 isolat merupakan kelompok bakteri denitrifikasi dan 7 isolat termasuk kelompok bakteri pereduksi nitrat menjadi amonium dissimilatif. Isolat NFR1, NFR2, NFR3, NFR4, FR1 dan FR2 mempunyai kemampuan reduksi nitrat yang tinggi. Aktivitas reduksi nitrat dimulai pada awal inkubasi dan aktivitas reduksi nitrat paling tinggi terjadi selama fase eksponensial. Kecepatan maksimum (V maks ) reduksi nitrat isolat NFR1, NFR2, NFR3, NFR4, FR1 dan FR2 masing-masing adalah 0,65 mm/jam, 0,49 mm/jam, 0,25 mm/jam, 0,27 mm/jam, 0,38 mm/jam dan 0,56 mm/jam. Nilai K m masing-masing isolat 2,93 mm, 3,16 mm, 1,40 mm, 1,15 mm, 1,78 mm dan 2,93 mm. Nilai µ max masing-masing isolat 0,34 sel/jam, 0,2 sel/jam, 0,14 sel/jam, 0,19 sel/jam, 0,2 sel/jam dan 0,33 sel/jam. Hasil identifikasi 16S-rRNA isolat NFR1 mempunyai kemiripan dengan Microbacterium sp, sedangkan isolat NFR2 dan NFR4 mempunyai kemiripan dengan Shewanella algae dan isolat FR2 mempunyai kemiripan dengan Shigella flexneri.

4 ABSTRACT HURIA MARNIS. Molecular Characterization and Activity of Nitrate Reducing Bacteria from Cimandiri Estuary Pelabuhan Ratu Sukabumi West Java. Under the direction of ANJA MERYANDINI and IMAN RUSMANA. The activity of nitrate reducing bacteria in aquatic environment can produce nitrous oxide (N 2 O) via either denitrification and dissimilative nitrate reduction to ammonium processes. This research isolated and characterized nitrate reducing bacteria from Cimandiri Estuary. Twenty-two isolates of nitrate reducing bacteria isolated from enrichment medium with 100 µm and 2000 µm nitrate, 15 isolates were denitrifier bacteria and 7 isolates were dissimilative nitrate ammonifier bacteria. NFR1, NFR2, NFR3, NFR4, FR1 and FR2 isolates had the higher nitrate reducing activity. The activity of nitrate reduction was started in the first hour incubation and the highest nitrate reducing activity was occured during the exponential phase after 12 hours incubation. The V max value of NFR1, NFR2, NFR3, NFR4, FR1 and FR2 isolates were 0.65 mm.h -1, 0.49 mm.h -1, 0.25 mm.h -1, 0.27 mm.h -1, 0.38 mm.h -1 and 0.56 mm.h -1, respectively. While K m value were 2.93 mm, 3.16 mm, 1.40 mm, 1.15 mm, 1.78 mm and 2.93 mm, repectively. While u max value were 0.34 cell.h -1, 0.22 cell.h -1, 0.14 cell.h -1, 0.19 cell.h -1, 0.21 cell.h -1 and 0.33 cell.h -1, respectively. Based on 16S-rRNA sequence similarity, NFR1 isolate was closely related to Microbacterium sp; NFR2 and NFR4 isolates were closely related to Shewanella algae; FR2 isolate was closely related to Shigella flexneri. Keywords: activity nitrate reducing, denitrification, dissimilative nitrate reduction to ammonium

5 Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2008 Hak cipta dilindungi Undang-undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber. a. pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah. b. pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

6 KARAKTERISASI MOLEKULAR DAN UJI AKTIVITAS BAKTERI PEREDUKSI NITRAT DARI MUARA CIMANDIRI PELABUHAN RATU SUKABUMI JAWA BARAT HURIA MARNIS Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Bioteknologi SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

7 Penguji Luar Komisi: Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA

8 Judul : Karakterisasi Molekular dan Uji Aktivitas Bakteri Pereduksi Nitrat dari Muara Cimandiri Pelabuhan Ratu Sukabumi Jawa Barat Nama : HURIA MARNIS NRP : P Program Studi : BIOTEKNOLOGI Disetujui, Komisi Pembimbing Dr. Anja Meryandini, MS Ketua Dr. Iman Rusmana, M.Si Anggota Diketahui, Ketua Program Studi Bioteknologi Dekan Sekolah Pascasarjana IPB Dr. Muhammad Jusuf Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS Tanggal Ujian: 25 Januari 2008 Tanggal Lulus:

9

10 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT, karena hanya atas rahmat dan karunia serta ridho-nyalah tesis yang berjudul Karakterisasi Molekular dan Uji Aktivitas Bakteri Pereduksi Nitrat dari Muara Cimandiri Pelabuhan Ratu Sukabumi Jawa Barat dapat diselesaikan. Pelaksanaan penelitian dan penulisan tesis ini tidak terlepas dari bantuan dan bimbingan berbagai pihak. Pada kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Bapak Dr. Iman dan Ibu Dr. Anja Meryandini Rusmana selaku komisi pembimbing atas pengarahan dan bimbingan yang telah diberikan selama penelitian dan penulisan tesis ini sehingga penulis dapat menyelesaikan dengan baik. 2. Ketua Program Studi Bioteknologi, Ketua dan Staf Laboratorium Mikrobiologi Departeman Biologi, Fakultas Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor yang telah membantu dalam penyediakan fasilitas hingga terlaksananya penelitian ini. 3. Ayahanda A. M. Marnis dan Ibunda Risnawati, adik-adikku Cory Marnis, Saddam Marnis dan Andre Marnis dan Khairul Syahputra yang selama ini telah banyak memberikan dukungan, hingga penulis mampu menyelesaikan studi ini dengan baik. 4. Rekan-rekan angkatan 2005, 2006 dan 2007 Program Studi Bioteknologi dan rekan-rekan lab mikrobiologi (Mba Nana, Iis, Mba Ari, Bu It, Mba Aris, Mba Widia, Mba Rene, Mba Hanum, Rika, Rina) atas segala bantuan dan kerjasamanya. Akhirnya semoga tesis ini dapat bermanfaat bagi semuanya. Amin. Bogor, Januari 2008 Penulis

11 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bukittinggi, pada tanggal 14 Juni 1984 dari ayah A. M. Marnis dan ibu Risnawati. Penulis merupakan anak pertama dari empat bersaudara. Penulis lulus SLTA pada tahun 2001 dan melanjutkan program sarjana (S1) Jurusan Ilmu Kelautan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan di Universitas Riau, selesai pada tahun Pada bulan Agustus 2005, penulis melanjutkan kuliah ke sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor Program Studi Bioteknologi.

12 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR ISI... i DAFTAR TABEL... iii DAFTAR GAMBAR... iv DAFTAR LAMPIRAN... v PENDAHULUAN... 1 Latar Belakang... 1 Tujuan... 2 TINJAUAN PUSTAKA... 3 Muara Sungai Cimandiri... 3 Nitrogen... 4 Nitrat... 6 Nitrit... 7 Amoniak... 7 Dinitrous oksida... 8 Bakteri pereduksi senyawa nitrat S-rRNA Polymerase Chain Reaction (PCR) Sekuensing DNA METODE PENELITIAN Waktu dan tempat penelitian Bahan penelitian Analisis kimia sampel Analisis nitrat Analisis nitrit Analisis amonia Isolasi dan kakakterisasi morfologis bakteri pereduksi nitrat Kurva pertumbuhan bakteri reduksi nitrat hasil isolasi Aktivitas bakteri pereduksi nitrat Kinetika bakteri pereduksi nitrat Karakterisasi molekular bakteri terseleksi HASIL Kondisi perairan muara Sungai Cimandiri Hasil isolasi dan karakteristik morfologis bakteri pereduksi nitrat.. 22 Aktivitas reduksi nitrat Kinetika reduksi nitrat Karakterisasi molekular 16S-rRNA, gen napa dan narg PEMBAHASAN Kondisi perairan muara sungai cimandiri Isolasi dan kakakteristik morfologis bakteri pereduksi nitrat Aktivitas reduksi nitrat bakteri hasil isolasi... 37

13 Kinetika reduksi nitrat Karakterisasi molekular 16S-rRNA, gen napa dan narg PENUTUP Kesimpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 50

14 DAFTAR TABEL Halaman 1 Primer yang digunakan pada amplifikasi PCR Kondisi amplifikasi PCR Parameter yang diukur secara in situ Morfologi sel isolat bakteri pereduksi nitrat yang telah diisolasi dari perairan muara Sungai Cimandiri Daftar isolat hasil isolasi dengan konsentrasi nitrat 100 M dan 2000 M pada perairan muara Sungai Cimandiri Hasil uji reduksi nitrat tahap awal, inkubasi 3 hari suhu ruang (28-31 O C) Kinetika isolat NFR1, NFR2, NFR3, NFR4, FR1 dan FR2 dalam mereduksi nitrat per jam... 31

15 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Peta muara Sungai Cimandiri Siklus nitrogen Skema perubahan senyawa nitrat melalui aktivitas reduksi nitrat Skema kerja penelitian Kurva pertumbuhan isolat bakteri denitrifikasi pada media cair dengan sumber karbon asetat kondisi anerobik suhu ( C) Kurva pertumbuhan isolat bakteri DRNA pada media cair dengan sumber karbon asetat kondisi anerobik suhu ( C) Aktivitas reduksi nitrat, pembentukan senyawa nitrit dan amonia pada bakteri denitrifikasi (NFR1, NFR2, NFR3 dan NFR4) dan bakteri reduksi nitrat menjadi amonium dissimilatif (FR1 dan FR2) Hubungan aktivitas reduksi nitrat dengan pertumbuhan pada denitrifikasi (NFR1, NFR2, NFR3 dan NFR4) dan bakteri reduksi nitrat menjadi amonium dissimilatif (FR1 dan FR2) Reduksi nitrat, pembentukan nitrit dan amonia pada bakteri denitrifikasi (NFR1, NFR2, NFR3 dan NFR4) dan bakteri reduksi nitrat menjadi amonium dissimilatif (FR1 dan FR2) Hasil amplifikasi PCR 16S-rRNA Hasil amplifikasi gen napa Hasil amplifikasi gen narg

16 DAFTAR LAMPIRAN Lampiran Halaman 1 Gambar lokasi pengambilan sampel Koloni isolat bakteri pereduksi nitrat (denitrifikasi dan dissimilative nitrate reduction to amonia (DRNA) Kurva standar pertumbuhan isolat NFR1, NFR2, NFR3, NFR4, FR1 dan FR Tabel aktivitas reduksi nitrat Gambar uji fermentasi glukosa pada isolat hasil isolasi Pewarnaan garam isolat NFR1, NFR2, NFR3, NFR4, FR1 dan FR Hasil analisis sekuensing 16S-rRNA Hasil analisis similaritas berdasarkan sekuen 16S-rRNA... 58

17 PENDAHULUAN Latar Belakang Perairan muara Sungai Cimandiri terletak ± 3 km ke arah selatan dari pelabuhan Nusantara Pelabuhan Ratu. Berbagai sampah rumah tangga/pemukiman, limbah pertanian, pertambangan, perkebunan dan bahanbahan lain masuk ke Sungai Cimandiri dan terbawa arus sampai ke muara. Masukan air sungai ini di perkirakan akan memberikan pengaruh langsung terhadap kualitas perairan yang ada di muara sungai. Kualitas perairan dipengaruhi oleh berbagai senyawa yang masuk ke perairan tersebut, salah satu diantaranya berupa senyawa nitrogen. Nitrogen di perairan terdapat dalam bentuk organik dan anorganik. Nitrogen anorganik berupa N 2, NO 3, NO 2, NH 3 dan NH 4 (Hariyadi dan Widigdo 1992). Tingginya nitrogen anorganik pada suatu lingkungan berhubungan dengan peningkatan emisi gas N 2 O (Conrad 1995). Gas N 2 O merupakan salah satu gas rumah kaca yang berkontribusi pada pemanasan global. Gas ini memiliki potensi absorbsi panas 150 kali lebih tinggi dari pada CO 2 dan mempunyai waktu tinggal di atmosfir yang lama, kurang lebih 120 tahun. Konsentrasi N 2 O di atmosfir meningkat terus dengan laju antara 0,2-0,3% per tahun. Kurang lebih 90% emisi N 2 O global berasal dari proses biotik (Conrad 1995; Paul dan Clark 1996; Rusmana 2003a). Proses biotik di perairan yang berpotensi menghasilkan gas N 2 O diantaranya adalah reduksi nitrat oleh bakteri. Ada dua proses umum yang dilakukan oleh bakteri dalam mereduksi nitrat yaitu denitrifikasi dan reduksi nitrat menjadi amonium dissimilatif. Denitrifikasi adalah proses reduksi nitrat menjadi N 2 O atau N 2. Pada proses ini bakteri menggunakan nitrat sebagai penerima elektron terakhir untuk memperoleh energi pada kondisi O 2 terbatas (Richardson et al. 2001). Denitrifikasi adalah proses utama reduksi nitrat di lapisan sedimen estuari (Dong et al. 2002). Reduksi nitrat menjadi amonium dissimilatif adalah proses reduksi nitrat menjadi amonium untuk menghilangkan kelebihan tenaga pereduksi dan menunjang pertumbuhan bakteri pada kondisi anaerob (Chole 1996). Pada konsentrasi bahan organik tinggi bakteri pereduksi nitrat menjadi

18 amonium dissimilatif lebih kompetitif dari pada bakteri denitrifikasi (Rusmana 2003b). Produk akhir emisi N 2 O dari aktivitas reduksi nitrat ditentukan oleh keberadaan dan dominasi bakteri di lingkungan. Kemampuan mendominasi tersebut bergantung pada kemampuan fisiologi bakteri dengan kelengkapan enzimnya yang terlibat dalam proses reduksi nitrat. Enzim-enzim tersebut adalah periplasmic nitrate reductase (Nap), membrane bound nitrate reductase (Nar), cytochrom cd 1 nitrite reductase (NirS), copper nitrite reductase (NirK), nitrite oxide reductase (Nor), nitrous oxide reductase (Nos), dan multiheme cytochrom c nitrit reductase (Nrf) (Zumft 1997; Richardson 2000). Dominasi bakteri pereduksi nitrat yang tidak memiliki nos akan menghasilkan produk akhir berupa N 2 O dari aktivitas reduksi nitrat. Berdasarkan latar belakang di atas, maka perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui aktivitas reduksi nitrat yang berhubungan dengan emisi gas N 2 O pada Muara Cimandiri, mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri yang terlibat pada proses ini dengan berbagai metabolisme yang terjadi serta kelengkapan enzimenzim yang dimiliki oleh bakteri tersebut. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, mengkarakterisasi aktivitas reduksi nitrat serta mengidentifikasi isolat bakteri pereduksi nitrat dari Muara Sungai Cimandiri Sukabumi Jawa Barat berdasarkan sekuen nukleotida 16SrRNA.

19 TINJAUAN PUSTAKA Muara Sungai Cimandiri Perairan Pelabuhan Ratu berada di bagian selatan Propinsi Jawa Barat, dan termasuk dalam wilayah Kabupaten Sukabumi. Posisi geografis kawasan Teluk Pelabuhan Ratu adalah antara LS dan BT (Sanusi 1994). Teluk pelabuhan Ratu berhubungan langsung dengan Samudera Hindia yang berada di sebelah selatannya (Gambar 1). LOKASI PENGAMBILAN SAMPEL U Pelabuhan Ratu Sungai Cimandiri Gambar 1. Peta Muara Sungai Cimandiri Keterangan: Lokasi Pengambilan Sampel

20 Teluk Pelabuhan Ratu merupakan tempat bermuaranya beberapa sungai seperti Sungai Cimandiri, Sungai Cibareno, Sungai Cisolok, Sungai Cimaja, Sungai Citepus, Sungai Cipalabuhan, Sungai Cipangairan dan Sungai Cidadap. Sungai Cimandiri merupakan sungai terbesar dari semua sungai yang bermuara di Teluk Pelabuhan Ratu. Sungai Cimandiri merupakan bagian dari kawasan Daerah Aliran Sungai (DAS) Cimandiri yang terletak di bagian timur Teluk Pelabuhan Ratu dekat dengan perumahan penduduk dan banyak ditemukan berbagai macam aktivitas seperti penambangan pasir, kegiatan pertanian dan kegiatan budidaya perikanan. Berbagai jenis bahan pencemar yang berasal dari aktivitas manusia di pinggir perairan ini menyebabkan adanya perubahan kualitas perairan. Menurut Dahuri et al. (1996), ekosistem estuaria merupakan bagian dari wilayah pesisir. Estuari adalah bentuk pantai yang sebagian tertutup, dimana air tawar dan air laut bertemu dan bercampur (Chester 1990). Proses percampuran kedua massa air ini sangat bervariasi karena masing-masing memiliki karakteristik yang berbeda dan dipengaruhi oleh kekuatan tiga unsur yaitu daratan (sungai), lautan dan atmosfir. Namun demikian kekuatan utama yang mempengaruhinya adalah kekuatan sungai. Muara sungai berfungsi sebagai media filter bagi semua bahan organik dan anorganik yang ada di perairan. Semua bahan tersebut dari sungai masuk ke laut melalui muara. Bahan-bahan organik dan anorganik di muara sungai yang ada diendapkan, terlarut dan terbawa oleh arus ke laut. Salah satu proses yang mempengaruhi konsentrasi bahan organik dan anorganik yang ada di dalamnya adalah proses biologi (Chester 1990). Nitrogen Kennish (1994) menyatakan bahwa nitrogen adalah nutrien pembatas utama untuk produsen primer di estuari selain fosfat dan silikat. Selain itu nitrogen berperan penting bagi pertumbuhan organisme karena unsur utama pembentuk protein (Kirchman 2000). Selanjutnya Kennish (1994) juga menyatakan ada tiga bentuk nitrogen anorganik utama yang terlarut di estuari yaitu amonia, nitrit dan nitrat, sedangkan nitrogen organik terdapat pada bahan

21 organik yang terlarut dan dalam bentuk partikel tersuspensi. Menurut Hutagalung dan Rozak (1997) komposisi nitrogen sangat dipengaruhi oleh kandungan oksigen bebas dalam air. Pada saat oksigen rendah nitrogen akan bergerak menuju amonia, sedangkan pada oksigen tinggi nitrogen akan bergerak menuju nitrat. Siklus nitrogen di perairan estuari dijelaskan oleh Kennish (1994) seperti terlihat pada Gambar 2. TUMBUHAN PENGAMBILAN PEMANGSAAN METABOLISME KEMATIAN EKSKRESI HEWAN NITROGEN TERLARUT PEMANGSAAN PARTIKEL TERLARUT KEMATIAN DAN EKSKRESI SEDIMENTASI SEDIMEN HETEROTROF AKTIVITAS BAKTERI BUANGAN LIMBAH ASIMILASI BAKTERI AUTOLISIS BUANGAN LIMBAH BATUAN KRISTAL EKSKRESI LIMBAH PELAPUKAN PUPUK LIMPASAN NITROGEN ANORGANIK (NO 3 -, NO 2 -, NH 3 ) PEMINDAHAN LAUT FIKSASI NITROGEN DI DASAR DENITRIFIKASI Gambar 2. Siklus Nitrogen Terdapat lima proses dalam siklus nitrogen yaitu amonifikasi, nitrifikasi, asimilasi nitrogen, denitrifikasi dan fiksasi nitrogen. Amonifikasi adalah proses pembentukan amonia dari materi organik. Amonia juga dapat mengalami asimilasi menjadi asam amino dan dapat diasimilasi secara langsung oleh diatom,

22 alga selular dan tanaman tingkat tinggi. Nitrifikasi merupakan reaksi oksidasi yaitu proses pembentukan nitrat dari amonia. Proses ini dapat berlangsung secara bakteriologis atau kimiawi. Assimilasi nitrogen ini merupakan proses pemanfaatan nitrogen untuk pembentukan asam amino dalam protoplasma bagi fitoplankton, alga dan bakteri. Denitrifikasi merupakan reaksi reduksi nitrat menjadi nitrit, nitrit oksida, nitrous oksida dan terakhir dibentuk gas dinitrogen. Fiksasi nitrogen merupakan pengikatan gas nitrogen menjadi amonia dan nitrogen organik. Proses ini dapat terjadi pada daerah pantai, yang umumnya melibatkan simbiosis alga dengan bakteri. Nitrat Menurut Kirchman (2000), nitrat (NO - 3 ) adalah bentuk nitrogen yang dinamis dan menjadi bentuk yang paling dominan pada limpasan (run-off), masukan sungai, keluarnya air tanah dan deposisi atmosfir ke laut. Nitrat adalah nutrien utama bagi pertumbuhan alga. Nitrat sangat mudah larut dalam air dan bersifat stabil. Nitrat dihasilkan dari proses oksidasi sempurna senyawa nitrogen dan amonia di perairan (Effendi 2000). Sumber utama nitrat berasal dari erosi tanah, limpasan dari daratan termasuk pupuk dan limbah (Chester 1990). Konsentrasi nitrat di suatu perairan dipengaruhi oleh proses nitrifikasi. Proses nitrifikasi merupakan proses oksidasi senyawa amonia menjadi nitrat dalam kondisi aerob oleh bakteri autotrof (Galugu 1997). Proses nitrifikasi terjadi dalam dua tahap: 1) merubah amonia menjadi nitrit; 2) merubah nitrit menjadi nitrat. Jenis bakteri yang berperan dalam tahap pertama adalah bakteri Nitrosomonas sedangkan pada tahap kedua adalah Nitrobacter. Galugu (1997) mengemukakan bahwa pada saat konsentrasi oksigen berkurang dalam kolom air, maka proses denitrifikasi mengubah ion nitrat dan nitrit menjadi molekul N 2. Produk akhir proses denitrifikasi adalah gas nitrogen yang tidak dapat dimanfaatkan oleh tumbuhan secara langsung. Menurut Hutagalung dan Rozak (1997), distribusi horizontal kadar nitrat akan semakin tinggi ke arah pantai, dan kadar yang tinggi ditemukan di perairan muara. Peningkatan kadar nitrat di laut disebabkan oleh masuknya limbah domestik atau

23 pertanian (pemupukan). Distribusi vertikal kadar nitrat di laut menunjukkan bahwa kadar nitrat semakin tinggi bila kedalaman laut bertambah (Mann dan Lazier 1991). Nitrit Nitrit biasanya ditemukan sangat sedikit di perairan alami, kadarnya lebih kecil dari nitrat karena bersifat tidak stabil. Nitrit merupakan senyawa antara hasil oksidasi amonia. Nitrit merupakan bentuk peralihan antara amonia dan nitrat (nitrifikasi), antara nitrat dan gas nitrogen (denitrifikasi). Keberadaan nitrit menggambarkan berlangsungnya proses biologis perombakan bahan organik yang memiliki kadar oksigen terlarut sangat rendah. Sumber nitrit dapat berupa limbah industri dan limbah domestik. Kadar nitrit pada perairan relatif kecil karena segera dioksidasi menjadi nitrat. Perairan alami mengandung nitrit sekitar 0,001 mg/l (Effendi 2000). Meningkatnya kadar nitrit di perairan laut berkaitan erat dengan masuknya bahan organik yang mudah terurai. Penguraian bahan organik yang mengandung unsur nitrogen akan menghasilkan senyawa nitrat, nitrit atau amonia. Penguraian bahan organik oleh bakteri membutuhkan oksigen dalam yang jumlah banyak. Pada kondisi lingkungan anaerob, bakteri akan lebih cenderung menggunakan nitrat sebagai akseptor elektron dengan cara mereduksi senyawa nitrat menjadi nitrit (Hutagalung dan Rozak 1997). Senyawa nitrit oleh beberapa bakteri tertentu digunakan sebagai penerima elektron terakhir dalam proses metabolismenya. Hal ini terjadi pada kondisi lingkungan yang anaerobik. Mekanisme tersebut dikenal dengan istilah respirasi nitrit dan enzim yang berperan adalah nitrit reduktase (Madigan et al. 2003). Amonia Senyawa amonia yang terdapat dalam perairan merupakan hasil reduksi senyawa nitrat, atau nitrit oleh bakteri Dissimilative Nitrate Reduction to Ammonium (DNRA) (Rusmana 2003a). Effendi (2000) menambahkan bahwa sumber amonia di perairan berasal dari pemecahan nitrogen organik (protein dan urea) dan nitrogen anorganik yang terdapat dalam tanah dan air yang berasal dari

24 dekomposisi bahan organik (tumbuhan dan biota akuatik yang telah mati) oleh mikroba dan jamur. Tinja dan ekskresi biota akuatik merupakan limbah dari aktivitas metabolisme yang mengasilkan amonia. Sumber amonia yang lain adalah limbah industri dan domestik. Selain terdapat dalam bentuk gas, amonia membentuk komplek dengan beberapa ion logam. Amonia juga dapat terserap ke dalam bahan-bahan tersuspensi dan koloid sehingga mengendap di dasar perairan. Amonia di perairan dapat menghilang melalui proses volatilisasi karena tekanan parsial amonia dalam larutan meningkat dengan semakin meningkatnya ph. Hilangnya amonia ke atmosfir juga dapat meningkat dengan meningkatnya kecepatan angin dan suhu (Effendi 2000). Kadar amonia dalam air laut sangat bervariasi dan dapat berubah dengan cepat (Hutagalung dan Rozak 1997). Distribusi vertikal kadar amonia semakin tinggi dengan pertambahan kedalaman laut dan sejalan dengan semakin rendahnya oksigen, sedangkan distribusi horizontal kadar amonia semakin tinggi menuju ke arah perairan pantai atau muara sungai. Peningkatan kadar amonia berkaitan erat dengan masuknya bahan organik yang mudah terurai (Hutagalung dan Rozak 1997). Amonia yang terukur di perairan berupa amonia total (NH 3 dan NH + 4 ). Amonia bebas tidak dapat terionisasi, sedangkan amonium (NH + 4 ) dapat terionisasi. Persentase amonia bebas meningkat dengan meningkatnya nilai ph dan suhu perairan. Amonia bebas bersifat toksik terhadap organisme akuatik. Toksisitas ini akan meningkat jika terjadi penurunan kadar oksigen terlarut, ph dan suhu. Kadar amonia pada perairan alami biasanya kurang dari 0,1 mg/l (Effendi 2000). Kadar amonia yang tinggi mengindikasikan adanya pencemaran bahan organik yang berasal dari limbah domestik, industri dan limpasan pupuk pertanian (Effendi 2000). Dinitrous Oksida Gas nitrous oksida (N 2 O) merupakan salah satu gas yang dihasilkan pada proses denitrifikasi dan proses reduksi nitrat menjadi amonium dissimilatif (Rusmana 2003c). Gas tersebut merupakan salah satu gas yang menyebabkan efek

25 pemanasan global (rumah kaca). Gas tersebut secara alamiah diemisikan dari ekosistem perairan sungai, estuaria dan daratan yang mencapai sekitar 1,9 ton Nitrogen/th. Perairan sungai memberikan sumbangan gas nitrous oksida (N 2 O) sebesar 55%, estuaria 11% dan daratan sebesar 33% (Seitzinger dan Kroezen 1998). Produksi gas N 2 O dapat berasal dari aktivitas denitrifikasi yang dilakukan oleh bakteri. Laju denitrifikasi akan meningkat dengan meningkatnya kandungan nitrat pada sedimen (Jiang dan Bakken 1999). Pada sedimen konsentrasi senyawa nitrat akan mempengaruhi produksi gas N 2 O. Kandungan nitrat tinggi akan meningkatkan produksi N 2 O, sedangkan kandungan senyawa amonium tidak mempengaruhi produksi gas N 2 O (Liikanen et al. 2003). Bakteri Pereduksi Senyawa Nitrat Di lingkungan perairan senyawa nitrat banyak dimanfaatkan oleh kelompok mikroorganisme yang bersifat heterotrofik untuk membentuk bahan organik sel. Pada kondisi anaerobik nitrat atau nitrit akan digunakan sebagai penerima elektron terakhir pada proses dissimilasi nitrat (Madigan et al. 2003). Kelompok bakteri pereduksi nitrat dan nitrit umumnya termasuk ke dalam kelompok Proteobakteria sub kelas alfa, beta dan gama (Buchanan dan Gibbon 1974). Pada kondisi anaerobik kelompok bakteri denitrifikasi akan aktif mereduksi senyawa nitrat menjadi nitrit, nitrit oksida (NO), nitrous oksida (N 2 O) dan dinitrogen (N2), dengan bantuan sistem enzim nitrat dan nitrit reduktase. Masing-masing enzim mempunyai sensitifitas terhadap oksigen yang berbeda (Paul dan Clark 1996). Berbagai bakteri dapat melakukan proses denitrifikasi antara lain Alcaligenes sp, Paracoccus denitrificans, Thiobacillus denitrificans, Pseudomonas sp dan Achromobacter sp (Atlas dan Bartha 1998). Pada kondisi yang sesuai, beberapa genus dapat mereduksi nitrit menjadi amonia melalui proses reduksi nitrat dissimilasi. Reaksinya berjalan saat kandungan senyawa nitrit tinggi (Kelso et al. 1997). Bakteri ini memanfaatkan senyawa nitrat sebagai penerima elektron alternatif untuk mendapatkan energi di bawah kondisi oksigen terbatas (Richardson et al. 2001). Pola perubahan senyawa nitrat oleh aktivitas bakteri dapat dilihat pada Gambar 3. Bakteri fermentatif yang dapat memanfaatkan

26 senyawa nitrat sebagai penerima elektron terakhir pada kondisi anaerobik, antara lain jenis Aeromonas sp, Bacillus sp, Klebsiella sp dan Vibrio sp. NO N 2 O N 2 Denitrifikasi NO 3 - NO 2 - NH 4 DNRA NH 2 OH N 2 H 4 N 2 Anamoks NH 3 Gambar 3. Skema perubahan senyawa nitrat melalui aktivitas reduksi nitrat (Rusmana 2003a). Kelompok bakteri denitrifikasi banyak terdapat pada sistem perairan estuaria (Chabrerie 2001), dapat melakukan proses reduksi nitrat dan nitrit pada kondisi anerobik (Robertson et al. 1989). Patureau et al. (1994) menyatakan bahwa ada dua tipe enzim nitrat reduktase, yaitu nitrat reduktase yang berada pada membran (Nar) dan nitrat reduktase yang terdapat pada periplasmik (Nap). Enzim Nap tidak berhubungan langsung dengan proses respirasi pembentukan ATP, sedangkan pada enzim Nar aktivitasnya berhubungan langsung dengan proses respirasi pembentukan ATP. Gen nar dalam ekspresinya dipengaruhi oleh keberadaan oksigen, sedangkan pada gen nap tidak dipengaruhi oleh keberadaan oksigen (Moreno-vivian et al. 1999). Enzim yang berperan dalam aktivitas denitrifikasi adalah nitrat reduktase (Nar dan Nap) yang mengubah nitrat menjadi nitrit, nitrit reduktase (NirS dan NirK) yang mengubah nitrit menjadi nitrous oksida, nitrit oksida reduktase (Nor) yang mengubah nitrous oksida menjadi dinitrous oksida, dan nitrous oksida reduktase (Nos) yang mengubah dinitrous oksida menjadi gas nitrogen (Richardson et al. 2001). Enzim-enzim tersebut sangat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan dan mempunyai karakteristik yang beragam. Zumft (1992) mengemukakan bahwa enzim nitrit reduktase pada Paracoccus denitrificans aktif pada kondisi anaerob, sedangkan pada Thiosphaera pantotropha aktif pada kondisi aerob, serta pada Hypomicrobium X dan Alcaligenes aktif pada kondisi mikroaerofilik.

27 Philippot dan Hojberg (1999) melaporkan bahwa ada dua isoenzim nitrat reduktase, yaitu nitrat reduktase yang berkaitan dengan membran sel (Nar) dan periplasma (Nap). Enzim nitrat reduktase yang berperan pada membran (NarGHI) terdiri atas tiga subunit, dengan berat molekul sekitar kda, dengan berat molekul kda dan dengan berat molekul sekitar kda. Enzim nitrat reduktase yang berada di periplasma merupakan komplek dari dua subunit protein yang disandikan oleh operon napedabc. Subunit NapA (93,3 kda) mengikat kofaktor Molybdenum sebagai sisi aktif dari enzim. Subunit ini memiliki sekuen yang mirip dengan Nar dari E. coli dan Mo-enzim seperti assimilasi nitrat reduktase (Nas), formate dehidrogenase dan dimetil sulfoksida (DMSO) reduktase dari berbagai organisme. Subunit NapB (18,9 kda) mempunyai dua situs ikatan heme-c yang potensial. Perbedaan potensial redoks dari heme ini adalah 100 mv (+80 dan -15 mv). NapC yang merupakan sitokrom tipe tetraheme-c berperan dalam transpor elektron antara quinol dan NapAB. Fungsi NapD dan NapE untuk komplek NapAB belum diketahui (Richardson 2000; Zumft 1997). 16S-rRNA Terdapat dua kelompok RNA yang ditemukan di dalam sel, yaitu pertama yang behubungan dengan ekspresi gen, dan yang kedua tidak berhubungan dengan proses tersebut. Kelompok pertama ialah mrna, trna dan rrna. Ketiga jenis RNA ini berhubungan dengan ekspresi gen yang dihasilkan melalui proses transkripsi. Kelompok kedua adalah RNA yang berukran kecil seperti RNA primer yang terlibat dalam replikasi DNA atau RNA yang mampu membentuk struktur kromosom bakteri. rrna merupakan RNA terbanyak sekitar 83%, dari RNA yang dikandung oleh suatu sel. Besarnya jumlah rrna dalam sel karena molekul rrna bersifat stabil, berukuran besar dan jumlah ribosom dalam sel sangat banyak. Ribosom merupakan organel selular yang sangat penting, terdapat pada semua makhluk hidup yang berperan dalam sintesis protein, yaitu tempat pertemuan mrna dengan trna. Ribosom disusun oleh dua subunit yaitu ribosom besar dan ribosom kecil, keduanya disusun oleh protein dan rrna. Bakteri mempunyai ribosom berukuran 70S yang terdiri dari dua subunit yaitu,

28 subunit besar (50S) dan subunit kecil (30S). Pada subunit besar, rrna terbagi atas dua bagian yaitu 5S-rRNA dan 23S-rRNA, sedangkan pada subunit kecil hanya berupa 16S-rRNA (Madigan et al. 2003). Sekuen gen 16S-rRNA lebih sesuai digunakan untuk identifikasi bakteri jika dibandingkan dengan 5S-rRNA dan 23S-rRNA. Hal ini karena gen 16SrRNA mampu mewakili semua informasi filogenetik dan lebih praktis, sedangkan 5S-rRNA mempunyai ukuran nukleotida yang lebih pendek sehingga informasi filogenetiknya terbatas dan 23S-rRNA mempunyai informasi filogenetik yang banyak, tetapi ukuran nukleotidanya panjang sehingga tidak praktis digunakan untuk identifikasi bakteri. Analisis sekuen gen 16S rrna lebih akurat digunakan sebagai kronometer evolusi dari pada metode konvensional (Ludwig dan Klenk 2001). Polymerase Chain Reaction (PCR) Reaksi PCR terdiri atas 3 tahapan, tahap pertama yaitu denaturasi DNA template menjadi utas tunggal, tahap kedua yaitu annealing atau penempelan primer dan tahap ketiga yaitu proses perpanjangan oleh Taq DNA Polymerase dengan siklus reaksi sebanyak yang diinginkan. Untuk mendapatkan hasil yang optimal dapat menggunakan siklus sebanyak kali (Eeles dan Stamps 1993). Proses amplifikasi DNA target bersifat eksponensial, jumlah amplikon yang dihasilkan tergantung pada banyaknya siklus PCR. Reaksi PCR membutuhkan dua kontrol untuk setiap kali siklus yaitu kontrol positif dan negatif. Kontrol negatif adalah kontrol tanpa DNA template. kontrol ini digunakan untuk mengkonfirmasikan keadaan yang bebas DNA pengkontaminan pada setiap peralatan PCR. Kontrol positif akan diamplifikasi secara konsisten, kontrol ini menunjukkan sensitifitas dan efisiensi reaksi. Sampel kontrol positif yang konsentrasinya terlalu kecil dapat gagal teramplifikasi (Eeles dan Stamps 1993). Sekuensing DNA Potongan DNA dapat disekuen dengan menggunakan metoda Sanger. Metode ini melibatkan proses enzimatik yang memakai dideoksinukleotida

29 (ddntp) spesifik yang mengakhiri sintesis untai DNA pada nukleotida spesifik. Reaksi tersebut diatur sedemikian rupa sehingga diperoleh fragmen DNA yang menggambarkan terminasi pada setiap nukleotida. Label radioaktif pada ujung yang berlawanan dapat disatukan dengan tempat terminasi, kita dapat memisahkan fragmen tersebut menurut ukurannya dengan menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid. Pembuatan autoradiografi akan menghasilkan bayangan (pita) pada film sinar-x untuk tiap fragmen DNA. Bayangan ini dibaca untuk menentukan rangkaian DNA (Sambrook et al. 2001). Komponen-komponen yang diperlukan untuk sekuensing DNA menggunakan metode Sanger, adalah primer, DNA template (target), DNA polymerase, dan dntp (Deoxynucleoside triphosphates). 2, 3 ddntp tidak mempunyai gugus hidroksil pada posisi 3 deoxyribose. ddntp dapat digabungkan oleh enzim Taq polymerase pada untai DNA yang sedang disintesis melalui gugus trifosfat 5. Namun demikian, tidak adanya gugus 3 -hidroksil mencegah terbentuknya ikatan fosfodiester dengan dntp berikutnya. Sintesis DNA tidak mungkin dilanjutkan dan berhenti pada posisi ddntp. Dengan demikian, jika suatu jenis ddntp (misalnya ddatp) dicampur dengan dntp dalam satu larutan reaksi, terjadi kompetisi antara dntp yang memperpanjang molekul DNA dan ddntp yang memberhentikan proses pemanjangan tersebut (Sambrook et al. 2001). Hasil akhir dari reaksi tersebut adalah sejumlah potongan DNA yang panjangnya bervariasi tetapi semuanya berakhir dengan nukleotida A. Demikian juga bila dntp dicampur dengan ddntp yang lain. Setiap reaksi akan menghasilkan sejumlah molekul DNA yang panjangnya bervariasi dan basa terakhirnya sama tergantung dari ddntp yang digunakan (Sambrook et al. 2001).

30 METODE PENELITIAN Waktu dantempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari Bulan Februari sampai Desember 2007 di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Bahan Penelitian Sampel sedimen dan sampel air diambil dari dua lokasi sampling. Pengambilan sampel dimulai dari mulut muara mengarah ke hulu Sungai Cimandiri. Setiap lokasi sampling, dilakukan pengambilan sampel sebanyak 15 titik sampling. Pengambilan sampel sedimen diambil dengan sediment core sampai kedalaman 15 cm. Sampel air diambil pada permukaan dengan menggunakan botol sampel steril volume 300 ml. Pada masing-masing lokasi dilakukan pengukuran parameter ph, DO, Suhu air, konsentrasi nitrat, nitrit dan amonia menggunakan alat Water Quality Checker, sedangkan pengukuran salinitas menggunakan Hand Refraktometer. Analisis kimia sampel Parameter yang diukur pada penelitian ini adalah konsentrasi nitrat, nitrit dan amonium. Analisis Nitrat Analisis senyawa nitrat dengan menggunakan metode brusin (Cleseri et al. 1989). Kadar nitrat ditentukan dengan cara memasukkan 2 ml sampel yang telah diencerkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 0,2 ml brusin dan dikocok, setelah itu ditambahkan 4 ml asam sulfat pekat dan didiamkan selama setengah jam serta diukur pada panjang gelombang 420 nm. Analisis Nitrit Metode yang digunakan dalam analisis nitrit adalah metode sulfanilamide (Cleseri et al. 1989). Nitrit dengan amina aromatik pada sulfalinamide akan

31 membentuk diazonium. Senyawa tersebut dengan NED (N-I-Naphtyl Ethylene Diamine Dyhidrochloride) membentuk gugus kromofor yang berwarna merah muda. Kadar nitrit ditentukan dengan cara memasukkan 5 ml sampel yang telah diencerkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 0,1 ml sulfanilamide dan dikocok, didiamkan selama 2-8 menit. Lalu ditambahkan 0,1 ml NED dan dikocok, dan didiamkan selama 30 menit dan diukur OD pada panjang gelombang 540 nm. Analisis amonia Pengukuran konsentrasi amonia menggunakan metode phenate (Cleseri et al. 1989), kadar amonia ditentukan dengan cara 5 ml sampel yang diencerkan, dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 0,2 ml larutan fenol alkohol (C 6 H 5 OH) lalu dihomogenkan, diamkan selama 1 menit lalu ditambahkan 0,2 ml Na-Dihidro Nitroprusid (Na 2 [Fe(CN)NO] 2. H 2 O), kemudian ditambahkan 0,5 ml larutan oksidan yang terdiri atas natrium sitrat (C 6 H 5 Na 3 O. 7 2H 2 O) dan natrium hipoklorit (NaOCl 2 ) dan dibiarkan selama satu jam pada suhu ruang (28-31) ºC, kemudian diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 640 nm. Isolasi dan Karakterisasi Morfologis Bakteri Pereduksi Nitrat Isolasi bakteri pereduksi nitrat dilakukan dengan menggunakan teknik pengkayaan pada kondisi anaerobik dan menggunakan media cair. Media yang digunakan untuk isolasi terdiri atas dua macam yaitu media yang miskin nitrat (100 M) dan media yang kaya nitrat (2000 M) dengan natrium nitrat sebagai sumber nitrat. Komposisi media pengkayaan adalah: 10 g Natrium asetat, 5,0 g NaNO 3, 3,0 ekstrak khamir, 0,5 g(nh 4 ) 2 SO 4, 0,9 g K 2 HPO 4, 0,5 g MgSO 4 7H 2 O, 0,2 g KH 2 PO 4, 0,1 g CaCl 2 2H 2 O, dengan salinitas 2% dan ph 7 (Rodina 1972). Medium padat dibuat sama dengan medium cair hanya saja pada medium padat ditambahkan Bacto agar 20 g per liter. Media disterilisasi pada suhu 121 C selama 15 menit. Sampel air yang digunakan untuk pengkayaan adalah sebanyak 5 ml, sedangkan sampel sedimen yang digunakan adalah sebanyak 1 ml. Sampel sedimen menggunakan campuran sedimen dan air (1:1) diinokulasikan ke dalam

32 medium cair, kemudian diinkubasi pada suhu C selama 5-7 hari. Bakteri pereduksi nitrat diisolasi dengan metode gores kuadran pada media padat, kemudian diinkubasi pada suhu C selama 5 hari. Koloni sel yang tumbuh terpisah dimurnikan kembali dengan digoreskan kuadran pada media padat yang baru dan diinkubasi pada suhu ºC, selama 7-10 hari. Semua isolat murni yang didapatkan disimpan pada medium agar miring sebagai biakan stok. Isolat murni hasil isolasi diamati morfologi koloninya yang meliputi: bentuk, warna dan tepiannya (Hadioetomo 1993). Reaksi Gram tiap isolat ditentukan dengan pewarnaan Gram. Isolat diinokulasikan pada medium uji fermentasi glukosa. Sebanyak 5 ml media semi-padat steril yang mengandung biru methilen sebagai indikator keasaman pada tabung reaksi dengan menggunakan glukosa sebagai sumber karbonnya dituang dalam tabung reaksi berpenutup ulir dengan volume 12 ml. Media tersebut diinokulasi dengan bakteri hasil isolasi sebanyak satu lup. Permukaan media ditutup parafin cair steril dengan ketebalan lebih kurang 1 cm. Inkubasi dilakukan selama 7 hari pada suhu ºC. Fermentasi glukosa ditunjukkan oleh adanya perubahan warna dari biru menjadi kuning. Isolat non fermentatif diduga merupakan bakteri denitrifikasi (Hugh dan Leifson 1953). Denitrifikasi dilakukan oleh bakteri dengan tipe metabolisme respirasi, sedangkan Dissimilative Nitrate Reduction to Ammonium (DNRA) dilakukan oleh bakteri dengan tipe metabolisme fermentatif (Rusmana dan Nedwell 2004). Kurva Pertumbuhan Bakteri Pereduksi Nitrat Hasil Isolasi Masing-masing isolat bakteri hasil isolasi ditumbuhkan pada media cair denitrifikasi pada suhu ºC selama 3 hari dan digunakan sebagai inokulan isolat uji. Biakan tersebut diinokulasikan ke dalam 250 ml media denitrifikasi dengan konsentrasi nitrat 2 mm dan diinkubasi dalam kondisi aerobik pada suhu ºC selama 10 hari. Setiap 6 jam dianalisis nilai kerapatan optiknya (OD) dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 620 nm. Profil nilai OD tersebut dapat memperlihatkan pola pertumbuhan isolat bakteri pereduksi nitrat dan dapat digunakan sebagai dasar penentuan waktu pengamatan pada uji seleksi kemampuan pemanfaatan senyawa nitrat.

33 Aktivitas Bakteri Pereduksi Nitrat Seluruh isolat dianalisis kemampuannya dalam mereduksi nitrat. Masingmasing isolat bakteri ditumbuhkan pada media cair denitrifikasi dengan konsentrasi nitrat 2000 M dalam kondisi anaerobik. Konsentrasi nitrat, nitrit dan amonia diukur setelah dilakukan inkubasi selama 3 hari. Isolat-isolat yang menunjukkan aktivitas yang tinggi dalam mereduksi nitrat, selanjutnya diuji kembali aktivitasnya dengan tahapan sebagai berikut. kultur isolat pada fase eksponensial diinokulasikan sebayak 1 ml pada 40 ml medium denitrifikasi dengan konsentrasi nitrat 2000 M dan diinkubasi selama 3 hari pada suhu ºC. Setiap 12 jam contoh kultur diambil untuk dianalisis kadar nitrat, nitrit dan amonianya. Pada uji ini dilakukan pengulangan sebanyak dua kali. Isolat yang dipilih adalah isolat yang mempunyai kemampuan yang baik dalam mereduksi nitrat, membentuk nitrit, amonia dan gas N 2 O dan N 2. Jumlah senyawa nitrat yang tereduksi dihitung dengan rumus sebagai berikut: [NO 3 - ] red = [NO 3 - ] kontrol - [NO 3 - ] inokulasi [NO 3 - ] red % [NO 3 - ] red = x 100% [NO 3 - ] kontrol Jumlah senyawa nitrit yang terbentuk dihitung dengan rumus sebagai berikut: [NO 2 - ] terbentuk = [NO 2 - ] perlakuan [NO 2 - ] kontrol [NO 2 - ] perlakuan [NO 2 - ] kontrol % [NO 2 - ] terbentuk = x 100% [NO 3 - ] reduksi Jumlah senyawa amonia yang terbentuk dihitung dengan rumus sebagai berikut: [NH 4 + ] terbentuk = [NH 4 + ] perlakuan [NH 4 + ] kontrol [NH 4 + ] perlakuan [NH 4 + ] kontrol % [NH 4 + ] terbentuk = x 100% [NO 3 - ] reduksi

34 Produk akhir gas N 2 O dan N 2 yang dihasilkan dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: [Gas] = [NO - 3 ] reduksi [NO - 2 ] dibentuk [NH 3 ] dibentuk [Gas] % [Gas] = x 100% [NO 3 - ] reduksi Kinetika Bakteri Pereduksi Nitrat Isolat-isolat yang telah terseleksi (fase eksponensial) ditumbuhkan di dalam 40 ml medium cair denitrifikasi kemudian diinkubasi pada suhu ºC selama tiga hari. Kultur bakteri di sentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan rpm. Pelet dipisahkan dari supernatan dan diresuspensi dengan medium denitrifikasi tanpa nitrat. Kultur bakteri diinokulasikan ke dalam botol yang berisi 40 ml medium denitrifikasi dengan konsentrasi nitrat: 0, 100, 500, 1000, 2000 M. Masing-masing perlakuan diulang dua kali. Kontrol masing-masing perlakuan dibuat tanpa diinokulasikan kultur bakteri ke dalam media. Pengukuran reduksi nitrat dilakukan pada jam ke-0, 3, 6 dan 9. Analisis kinetika reduksi nitrat dilakukan dengan persamaan Michaelis-Menten (White 2000). Rumus kecepatan maksimum (V maks ) dan Ketetapan Michaelis-Menten (k m ) V 0 = V maks [S] k m + [S] Keterangan: V 0 = kecepatan awal pada konsentrasi substrat (Konsentrasi S) V maks = Kecepatan maksimum K m = Tetapan Michaelis-Menten enzim bagi substrat tertentu Rumus laju pertumbuhan spesifik (µ maks ) µ 0 = µ maks [S] k s + [S] Keterangan: µ 0 = Laju pertumbuhan spesifik awal µ maks = Laju pertumbuhan spesifik maksimum K s = Tetapan kejenuhan (yaitu konsentrasi substrat pada µ = ½ µ maks

35 Karakterisasi Molekuler Bakteri Terseleksi Empat isolat dipilih untuk digunakan dalam analisis 16S-rRNA. Keempat isolat tersebut antara lain: dua isolat dipilih dari kelompok bakteri denitrifikasi yang diperoleh dari media nitrat 2000 µm, satu isolat dipilih dari kelompok denitrifikasi yang diperoleh dari media nitrat 100 µm dan satu isolat dipilih dari kelompok bakteri Dissimilative Nitrate Reduction to Ammonium (DNRA) yang diperoleh dari media nitrat 100 µm. Isolasi DNA genom total bakteri dilakukan menurut metode yang telah dipaparkan oleh Sambrook et al. (2001). Isolat murni dikultur pada media cair LB selama 2 x 24 jam. Sebanyak 1,5 ml kultur disentrifugasi pada rpm selama 5 menit dan peletnya disuspensikan dalam 250 µl buffer TE dan 100 µl (20 mg/ml) lisozim. Suspensi dan inkubasi selama 1 jam pada suhu 37 C dan ditambahkan 100 µl SDS 10% sampai terbentuk lendir. Ke dalam suspensi ditambahkan 10 µl enzim protease K (10 mg/l), kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 C, kemudian ditambahkan 100 µl NaCl 5M dan dihomogenkan serta ditambah 100 CTAB dan diinkubasi pada suhu 65 0 C selama 30 menit. Selanjutnya ke dalam suspensi 500 µl ditambahkan campuran PCI (Phenol, Cloroform, Isoamilalkohol), kemudian dikocok kuat selama 30 detik dan sentrifugasi pada rpm selama 10 menit. Fase bagian atas hasil sentrifugasi (fase bening) dipindahkan ke tabung eppendorf dan kemudian ditambahkan 500 µl campuran CI (cloroform dan isoamilalkohol), kemudian kocok cepat dan disentrifugasi pada rpm selama 5 menit. Fase cair bagian atas (fase bening) diambil dan dipindahkan ke dalam tabung eppendorf dan ditambah etanol absolut 2 kali volume, kemudian digoyang pelan dan diinkubasi pada suhu C selama 30 menit. Selanjutnya suspensi disentrifugasi pada rpm selama 10 menit. Supernatannya dibuang kemudian peletnya (DNA) dicuci dengan 1 ml etanol 70% dan disentrifugasi pada rpm selama 10 menit. Pelet dikeringkan kemudian ditambah 20 µl ddh 2 O dan diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 30 menit kemudian disimpan pada suhu C. DNA yang telah berhasil diisolasi digunakan untuk identifikasi dan deteksi gen penyandi 16S-rRNA, gen penyandi nap dan nar dengan menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR).

36 Amplifikasi gen 16S-rRNA menggunakan primer 63f dan 1387r (Marchesi et al. 1998), sedangkan amplifikasi gen penyandi nap dan nar menggunakan primer spesifik untuk gen-gen tersebut (Smith et al. 2006). Primer dan kondisi PCR yang digunakan pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 1 dan 2. Tabel 1. Primer yang digunakan pada Amplifikasi PCR Primer Tipe Gen Target Sekuen (5 ke 3 ) *) narg 1960 narg 2659 napa V67 napa V F R F R F R narg narg napa napa 16S-rRNA 16S-rRNA TAY GTS GGC CAR GAR AA TTY TCR TAC CAB GTB GC TAY TTY YTN HSN AAR ATH ATG TAY GG DAT NGG RTG CAT YTC NGC CAT RTT CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC GGG CGG WGT GTA CAA GGC *) International Union for Bacteriology codes for bases: Y, C atau T; R, A atau G; M, A atau C; K, G atau T; S, G atau C; W, A atau T; H, A, C atau T; D, A, G, atau T; dan N, A, C, G atau T. Tabel 2. Kondisi Amplifikasi PCR Tahapan PCR 16S-rRNA napa narg Pra denaturasi Denaturasi Anealling Extention Post Siklus 94 ºC 2 menit 92 ºC 30 detik 55 ºC 30 detik 72 ºC 1 menit 72 ºC 5 menit ºC 2 menit 92 ºC 30 detik 55 ºC 30 detik 72 ºC 1 menit 72 ºC 5 menit ºC 2 menit 92 ºC 30 detik 60 ºC 45 detik 72 ºC 1 menit 72 ºC 5 menit 30 Hasil PCR dipisahkan dengan menggunakan elektroforesis gel agarose selama 45 menit, 70 volt dan 63 ma. Gel agarose direndam di dalam etidium bromida 2mg/ml selama 5 menit, dicuci dengan air selama 10 menit kemudian dilihat di bawah UV Transluminator (Hoefer Scientific Instrumens, San Fransisco, USA). Hasil amplifikasi dimurnikan dengan menggunakan kit gel and PCR clean up system (promega), kemudian ditentukan urutan nukleotidanya (sekuensing). Sekuensing dilakukan menggunakan alat DNA sequencing 310 genetic analysis system di Lab Risearch and Biotechnology Charoen Pokphan. Analisis hasil sekuensing dilakukan dengan menggunakan software BLAS-N yang tersedia di situs NCBI (National Centre for Biotechnology Information), National for Health, Amerika Serikat melalui Bagian alur penelitian yang dilakukan secara keseluruhan dapat dilihat pada Gambar 4.

37 PERAIRAN MUARA SUNGAI CIMANDIRI Pengambilan contoh air dan sedimen Kualias Air (ph, suhu, DO, dan Salinitas) Penentuan kadar senyawa (NO 3 -, NO 2, NH 3 ) Isolasi bakteri pereduksi nitrat Pemurnian Uji fermentasi glukosa ISOLAT MURNI Seleksi Isolat Uji reduksi nitrat tahap awal Uji reduksi nitrat Uji pembentukan gas Kinetika reduksi nitrat Analisis Molekuler Isolasi DNA genom total Amplifikasi PCR Sekuensing DNA Analisis kekerabatan Gambar 4. Skema Kerja Penelitian

38 HASIL Kondisi Perairan muara Sungai Cimandiri Hasil analisis kondisi perairan tempat pengambilan sampel muara Sungai Cimandiri yang meliputi parameter kimiawi dan biologis tergolong baik. Hasil pengukuran parameter ph, DO, salinitas, Suhu air, konsentrasi nitrat, nitrit dan amonia masih relatif cukup bagus untuk pertumbuhan organisme (Tabel 3). Tabel 3. Parameter yang diukur secara in situ Parameter Satuan Baku Mutu (Keputusan Lokasi Lokasi Menteri Negara Sampling I Sampling II Lingkungan Hidup ph 7,8 8,3 7-8,5 DO mg/l 7,47 8,31 >5 Salinitas % 0 3,2 0-3,3 Suhu air ºC Nitrat mg/l 0,006 0,008 0,008 Nitrit mg/l 0,0007 0,0009 0,001 Amonia mg/l 0,06 0,088 0,3 Hasil Isolasi dan Karakteristik Morfologis Bakteri Pereduksi Nitrat Pada penelitian ini medium pengkayaan untuk isolasi bakteri menggunakan konsentrasi nitrat yang berbeda yaitu 100 M dan 2000 M dengan kondisi inkubasi anaerobik. Hal ini dilakukan untuk memacu pertumbuhan bakteri denitrifikasi sedangkan pertumbuhan bakteri lainnya terhambat. Bakteri denitrifikasi menggunakan nitrat sebagai penerima elektron terakhir dalam keadaan anaerob (Richardson 2000). Sebanyak 22 isolat bakteri pereduksi nitrat telah berhasil diisolasi dari 2 lokasi sampling. Sebanyak 10 isolat diperoleh dari medium dengan konsentrasi nitrat 100 M dan sebanyak 12 isolat dari medium dengan konsentrasi nitrat 2000 M. Hasil pengamatan morfologi menunjukkan bahwa isolat ada yang bersifat Gram negatif dan ada juga yang bersifat Gram positif dengan sel berbentuk batang dan bulat (Tabel 4). Berdasarkan hasil uji fermentasi glukosa didapatkan 15 isolat bersifat non fermentatif dan 7 isolat bersifat fermentatif (Tabel 5).

39 Tabel 4. Morfologi sel isolat bakteri pereduksi nitrat yang telah diisolasi dari perairan muara Sungai Cimandiri. Kode Bentuk Morfologi Koloni Gram Isolat Sel Bentuk Tepian Elevasi Warna FR1 Batang Negatif Bulat Licin Tombol Kuning pucat FR2 Batang Negatif Bulat Licin Tombol Putih susu FR3 Kokus Negatif Bundar Licin Timbul Krem cerah FR4 Batang Negatif Bundar Berombak Licin Putih FR5 Batang Positif Bundar Berombak Berbukit Kuning FR6 Kokus Positif Bulat Licin Tombol kecoklatan FR7 Kokus Negatif Bundar Licin Timbul Kuning NFR1 Batang Positif Bundar Licin Cembung Kuning pucat NFR2 Batang Negatif Bundar Licin Tombol Coklat pucat NFR3 Batang Negatif Bundar Licin Tombol Coklat tua NFR4 Batang Negatif Bundar Licin Tombol Coklat muda NFR5 Batang Negatif Bundar Licin Timbul Pink muda NFR6 Kokus Negatif Bundar Licin Cembung Bening NFR7 Batang Negatif Bundar Licin Cembung Krem NFR8 Batang Negatif Bundar Licin Tetesan Putih susu NFR9 Batang Negatif Bundar Licin Timbul Putih NFR10 Kokus Negatif Bulat Licin Timbul Orange NFR11 Batang Negatif Bundar Licin Timbul Putih NFR12 Batang Positif Bulat Licin Tombol Orange NFR13 Kokus Positif Bundar Berlekuk Timbul Putih susu NFR14 Batang Negatif Bulat Licin Tombol Orange muda NFR15 Kokus Negatif Bundar Licin Timbul Putih