Validasi Metode Analisis Kolesterol dalam Telur dengan HPLC-ELSD. (Method Validation of Cholesterol Analysis in Egg Using HPLC-ELSD)

Transkripsi

1 Jurnal Ilmu Pertanian Indonesia (JIPI), Desember 2013 ISSN Vol. 18 (3): Validasi Metode Analisis Kolesterol dalam Telur denan HPLC-ELSD (Method Validation of Cholesterol Analysis in E Usin HPLC-ELSD) Hanifah Nuryani Lioe*, Tika Setianinrum, Ririn Anraeni ABSTRAK Metode analisis kolesterol dalam telur menunakan instrumen kromatorafi cair kinerja tini (HPLC) yan dilenkapi denan detektor evaporative liht scatterin (ELSD) divalidasi dalam penelitian ini. Kolom silika dan campuran tunal fase erak yan terdiri atas 90% heksana dan 10% isopropanol dipakai untuk menentukan kolesterol denan HPLC. Kolesterol terdeteksi pada waktu retensi 1,5 menit memakai standar kolesterol dan kondisi HPLC-ELSD: suhu evaporasi 50 ºC, tekanan udara 2,2 bar, dan laju alir fase erak 2 ml/min. Linearitas metode analisis kolesterol menunakan matriks sampel telur dicapai pada konsentrasi µ/ sampel, denan R 2 >0,990. Limit deteksi instrumen dan limit kuantifikasi berturut-turut diperoleh pada konsentrasi larutan kolesterol 1,07 dan 3,56 µ/ml. Hasil uji rekoveri denan metode penambahan kolesterol standar dalam matriks sampel telur pada konsentrasi rendah (50 µ/), sedan (250 µ/), dan tini (3000 µ/) masin-masin adalah 122,13, 108,23, dan 44,71%, denan nilai presisi masin-masin 5,26, 4,29, dan 10,11%. Limit deteksi metode diketahui pada konsentrasi 2,30 µ/. Reprodusibilitas intralab untuk menanalaisis sebuah sampel telur adalah 0,04%. Metode analisis kolesterol dalam telur ini dinyatakan valid apabila diunakan untuk analisis kolesterol pada konsentrasi rendah dan sedan dalam sampel. Kata kunci: HPLC-ELSD, kolesterol, telur, validasi metode ABSTRACT A method usin hih-performance liquid chomatoraphy (HPLC) coupled with an evaporative liht-scatterin detector (ELSD) for the determination of cholesterol in e was validated. A silica column and a binary mixture of hexane and isopropanol (90:10) as a mobile phase were used to separate cholesterol. Cholesterol was detected at 1.5 min usin cholesterol standard and HPLC-ELSD condition: evaporation temperature 50 ºC, air pressure 2.2 bars, and flow rate of mobile phase 2 ml/min. A method linearity for the cholesterol analysis in e as a sample matrix was obtained at a rane of 50 to 3000 µ/ sample, with R 2 > Instrument detection limit and limit of quantitation were determined at 1.07 and 3.56 µ/ml, respectively. Recovery test results by spikin cholesterol standard in e sample at low, medium, and hih concentrations (50, 250 and 3000 µ/ ) were , , and 44.71%, respectively. Their correspondin repeatability values were 5.26, 4.29, and 10.11%. Method detection limit and intralab reproducibility (to analyze a sample) were observed at 2.30 µ/ and 0.04%. The method is valid for cholesterol analysis in e at low and medium concentrations. Keywords: cholesterol analysis, e, HPLC-ELSD, method validation PENDAHULUAN Kolesterol merupakan jenis steroid yan palin dikenal denan 27 atom karbon. Kolesterol hanya ditemukan pada panan yan berasal dari hewan. Berikut adalah beberapa contoh kandunan kolesterol dalam produk panan berdasarkan hasil penelitian USDA (2011). Kandunan kolesterol dalam produk dain dan olahannya adalah m/100, untuk produk telur dan olahannya mencapai m/100, untuk produk ikan dan olahannya mencapai m/100, dan produk ayam dan olahannya mencapai m/100. Menurut anjuran yan dikeluarkan oleh USDA (2011), produk panan yan menandun lebih dari 300,00 m/100 sebaiknya dihindari, terutama penaruhnya Departemen Ilmu dan Teknoloi Panan, Fakultas Teknoloi Pertanian, Institut Pertanian Boor, Kampus IPB Darmaa, Boor * Penulis korespondensi: hanilioe@hotmail.com terhadap risiko penyakit jantun koroner (Ference et al. 2012). Kolesterol pun dapat membentuk produk hasil oksidasi kolesterol dalam panan olahan selama proses pemanasan, contohnya pada penolahan pasta yan menandun telur. Kecukupan asupan kolesterol yan dibutuhkan oleh tubuh dapat diperoleh dari bahan panan yan dikonsumsi sehari-hari. Informasi menenai kadar kolesterol dari berbaai bahan panan yan dikonsumsi setiap harinya sanat pentin untuk diketahui meninat setiap jenis bahan panan memiliki kandunan kolesterol yan berbedabeda. Kadar kolesterol di dalam bahan panan dapat diukur denan berbaai metode, akan tetapi tahap yan palin kritis dalam metode analisis kolesterol adalah tahap persiapan sampel. Analisis diawali denan proses ekstraksi; proses ini dipenaruhi oleh banyak hal. Salah satu hal pentin yan menentukan dalam proses ekstraksi adalah matriks bahan panan (Min & Steenson 1998). Matriks bahan panan adalah jarinan makanan tempat zat izi terperankap.

2 ISSN JIPI, Vol. 18 (3): Proses persiapan sampel berupa hidrolisis oleh asam dapat diunakan untuk menhilankan interaksi yan menhambat ekstraksi komponen taret. Menurut Min dan Streenson (1998), hidrolisis oleh asam dapat memecah ikatan kovalen dan ikatan ionik pada sampel sehina ikatan antara senyawa taret dan komponen matriks sampel dapat terlepas. Hal ini menyebabkan senyawa taret mudah diekstraksi. Berdasarkan penelitian Osman dan Chin (2006), kolesterol dapat dideteksi dan ditentukan kuantitasnya denan menunakan beberapa metode seperti spektrofotometer UV-VIS, kromatorafi as (GC), dan kromatorafi cair kinerja tini (HPLC) denan detektor UV. Denan metode spektrofotometer UV- VIS kolesterol dapat dideteksi hina konsentrasi 14 µ/ml, denan menunakan GC kolesterol terdeteksi hina 4,00 µ/ml, dan denan menunakan HPLC-UV terdeteksi hina 0,08 µ/ml. HPLC yan dipadu denan detektor evaporative liht scatterin detector (ELSD) masih jaran diunakan untuk analisis kolesterol, akan tetapi menurut Letter (1992), HPLC-ELSD dapat diunakan untuk menklasifikasikan fosfolipid (kolesterol, fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin, fosfatidikolin, dan spinomielin) pada konsentrasi 350 µ/µl. Metode analisis yan tidak baku dan yan dikembankan suatu laboratorium, serta metode baku yan diunakan di luar linkup yan dimaksudkan memerlukan proses validasi metode (Hadi 2007). Validasi metode adalah suatu proses untuk menkonfirmasi bahwa prosedur analisis yan dilakukan untuk penujian tertentu sesuai denan tujuan yan diharapkan (Huber 2001). Tujuan penelitian ini adalah memvalidasi analisis kolesterol dalam bahan panan denan matriks sampel telur denan menunakan metode deteksi HPLC-ELSD. Validasi metode analisis terdiri atas uji presisi instrumen, spesifisitas, linearitas metode, limit deteksi instrumen (LDI) dan limit kuantifikasi, rekoveri, keterulanan, metode deteksi limit (method detection limit, MDL), dan intralab reprodusibilitas. Validasi metode dilakukan denan menunakan matriks. METODE PENELITIAN Sampel yan diunakan adalah telur ayam broiler (Gallus sp.) yan diperoleh dari pasar lokal di sekitar Boor. Jumlah sampel yan dibeli adalah satu kotak (10 butir). Preparasi sampel diawali denan pencampuran 10 butir telur dalam sebuah wadah, kemudian dikocok hina tercampur rata. Sampel yan telah tercampur rata kemudian di masukkan ke dalam 15 kantun plastik kecil dan disimpan dalam lemari pembeku denan suhu -18 ºC hina dilakukan validasi analisis. Bahan pereaksi dan pelarut yan diunakan adalah metanol, KOH, heksan, as N 2 teknis, as N 2 HP (hih purity), HCl, 2 propanol (isopropanol), standar kolesterol kemurnian 95% (Sima Chemical Inc, USA), air bebas ion, Na 2 SO 4 anhidrous, dan kertas sarin. Alat yan diunakan pada penelitian ini timbanan analitik, waterbath, seperankat alat elas dan HPLC LC 6A (Shimadzu, Jepan) yan dilenkapi kolom normal phase silika LiChrosorb Si 60 (10µm) (25 cm x i.d. 4,6 cm) (Merck, Jerman), dan detektor ELSD Sedex 55 (Sedere, Prancis). Validasi metode analisis yan dilakukan meliputi uji presisi instrumen, spesifisitas, penukuran linearitas metode, limit deteksi instrumen (IDL), limit kuantifikasi (LOQ), ketepatan (akurasi), dan ketelitian (presisi) dari hasil uji rekoveri pada konsentrasi rendah, sedan, dan tini, penentuan limit deteksi metode (method detection limit, MDL) dan intrareprodusibilitas menurut EURACHEM (1998) dan FDA (2012). Uji Presisi Instrumen Uji ini dilakukan denan cara meninjeksikan larutan standar kolesterol (konsentrasi 50 μ/ml) sebanyak 7 ulanan ke instrumen HPLC, kemudian dihitun nilai standar deviasi (SD)-nya dan standar deviasi relatif (RSD)-nya dari waktu retensi dan luas puncak kolesterol yan terdeteksi. Batas keberterimaan menurut JECFA (2006) adalah RSD 2,00%. Spesifisitas Spesifisitas diamati dari hasil injeksi larutan standar kolesterol, larutan sampel telur denan dan tanpa tambahan kolesterol standar. Linearitas Metode Linearitas metode ditentukan denan meninjeksikan larutan sampel telur (3 sampel) yan ditambahkan standar kolesterol pada 6 konsentrasi yan berbeda (300, 750, 1500, 3000, 7500, dan µ/ml). Penujian dilakukan 3 kali pada setiap konsentrasi kolesterol standar. Linearitas diukur denan nilai R 2 dari kurva hubunan antara luas puncak kolesterol (sebaai sumbu y) dan konsentrasinya (µ/) (sebaai sumbu x). Linearitas yan baik adalah R 2 lebih dari 0,990. Limit Deteksi Instrumen dan Limit Kuantifikasi Limit deteksi instrumen (IDL) dan limit kuantifikasi (LOQ) ditentukan denan cara meninjeksikan larutan standar kolesterol pada konsentrasi terendah yan dapat dideteksi oleh HPLC-ELSD. Injeksi ini dilakukan sebanyak 7 kali sehina diperoleh 7 hasil konsentrasi yan terukur. Standar deviasi dari 7 konsentrasi ini dihitun, kemudian nilai IDL ditentukan dari rumus 3 SD, sedankan LOQ dari 10 SD. Akurasi dan Presisi Akurasi dan presisi ditentukan dari uji rekoveri. Uji ini dilakukan denan menunakan sampel spike pada 3 konsentrasi kolesterol berbeda. Konsentrasi spikin yan diuji adalah konsentrasi rendah (50 µ/), konsentrasi sedan (250 µ/), dan konsentrasi tini, yaitu konsentrasi kolesterol tertini yan dapat

3 180 ISSN JIPI, Vol. 18 (3): ditemui dalam telur (3000 µ/). Spikin dicoba sebanyak 7 kali untuk setiap tinkat konsentrasi. Rekoveri dihitun denan menunakan rumus berikut: m - m Presisi atau keterulanan dapat diketahui dari hasil penukuran sampel spike pada konsentrasi kolesterol rendah, sedan, dan tini. Mula-mula rata-rata dan SD hasil uji sampel spike pada konsentrasi tertentu dihitun, kemudian RSD ditentukan. RSD merupakan presisi atau keterulanan. Limit Deteksi Metode Limit deteksi metode (MDL) ditentukan dari kurva hubunan linear antara SD (sumbu y) dari hasil uji rekoveri denan konsentrasi standar kolesterol yan bersankutan (sumbu x). Nilai interpolasi pada x sama denan nol dinyatakan sebaai SD 0. Nilai MDL dihitun sebaai 3 kali nilai SD 0. Reprodusibilitas Intralab Reprodusibilitas intermediet menunakan 1 operator, 1 laboratorium tetapi pada waktu yan berbeda atau disebut jua reprodusibilitas intralab. Ini dilakukan denan menunakan 1 sampel matriks yan dianalisis sebanyak 3 ulanan dalam waktu yan sama. Rerata dari penukuran dalam waktu yan berbeda dan standar deviasi dari rata-rata tersebut dihitun, selanjutnya intralab reprodusibilitas ditentukan dari RSD perhitunan tersebut. Prosedur Analisis Kolesterol Prosedur analisis yan dilakukan diawali denan menyiapkan larutan standar kolesterol, menyiapkan sampel pada matriks telur untuk memperoleh larutan sampel, dan menentukan kandunan kolesterol denan menunakan HPLC-ELSD. Persiapan larutan standar kolesterol Sejumlah 50 dan 150 m standar kolesterol powder masin-masin dilarutkan dalam 50 ml fase erak HPLC (heksan:isopropanol = 90:10) yan terpisah. Larutan standar stok ini mempunyai konsentrasi 1000 dan 3000 µ/ml. Selanjutnya serial penenceran larutan stok menunakan fase erak sebaai pelarut dibuat untuk memperoleh larutan denan konsentrasi 10, 25, 50, 100, 150, 250, 300, 500, 750, 1500, 3000, dan 7500 µ/ml. Penyiapan larutan sampel telur (AOAC dalam Sullivan dan Carpenter 1993) Sekitar 3 sampel telur (sampel telur telah dihomoenkan) ditimban dalam tabun reaksi bertutup, selanjutnya ditambahkan 10 ml larutan HCl (4:1) lalu divorteks hina tercampur. Untuk uji linearitas metode denan sampel spikin, sebelum ditambahkan HCl, sampel diberi tambahan kolesterol standar sebanyak 1 ml dari setiap konsentrasi di atas. Tahap ini dilanjutkan denan menembusan as N 2 selama 30 detik lalu ditutup denan seera untuk menhindari oksidasi kolesterol. Kemudian campuran dipanaskan pada penanas air mendidih selama 30 menit, sambil dikocok setiap 5 menit. Setelah selesai, isi dalam tabun reaksi tersebut didininkan denan cara ujun tabun dikenakan air menalir. Isi tabun dipindahkan ke dalam labu pemisah (250 ml), tabun reaksi dibilas denan 2 x 10 ml air bebas ion, lalu air bilasan tersebut diabunkan ke dalam labu pemisah. Kolesterol dalam sampel yan terdapat dalam tabun diekstraksi denan heksana 3 x 10 ml sambil dikocok. Fraksi heksana diambil lalu heksana yan terkandun diuapkan denan as N 2. Setelah kerin, padatan yan diperoleh ditambahkan 10 ml KOH 2% dalam metanol lalu dipanaskan 80 ºC selama 30 menit. Komponen kolesterol kemudian diekstraksi denan heksana 3 x 10 ml dalam labu pemisah dan fraksi heksana disarin denan menunakan kertas sarin yan diberi tambahan Na 2 SO 4 anhidrat 1 2. Heksana yan terkandun dalam fraksi itu diuapkan denan as N 2. Setelah kerin, padatan dilarutkan denan fase erak pada volume tertentu (1,0 ml) secara tepat. Kemudian larutan tersebut diencerkan sebanyak 10 kali tinkat penenceran. Larutan sampel ini siap diinjeksikan ke HPLC. Penentuan kolesterol denan HPLC-ELSD Analisis denan HPLC-ELSD merupakan hasil penembanan di laboratorium LDITP milik Departemen Ilmu dan Teknoloi Panan, Fakultas Teknoloi Pertanian, Institut Pertanian Boor denan kondisi isokratik menunakan: Fase erak : Heksan: 2-propanol (90:10) Kolom : silika (25 cm x i.d. 4,6 cm, ukuran partikel 8 µm) Laju alir : 2 ml/menit Suhu : 50 ºC Detektor Volume injeksi : 20 µl : ELSD (Sedex 55) denan tekanan as N 2 sebesar 2,2 bar, Gain 7. Sampel diinjeksikan secara terpisah dari injeksi standar denan menunakan kondisi HPLC di atas, kemudian luas respons dicatat. Kurva standar yan merupakan hubunan linear antara area dan konsentrasi kolesterol standar dibuat. Selanjutnya luas puncak kolesterol dari kromatoram sampel dibaca dan dihubunkan denan kurva standar untuk memperoleh konsentrasi kolesterol standar dari kurva (µ/ml). Konsentrasi kolesterol dalam sampel dihitun denan rumus: m ml m m m ml Keteranan: Fp = faktor penenceran dari larutan sampel akhir apabila dilakukan penenceran sebelum larutan diinjeksikan ke HPLC.

4 ISSN JIPI, Vol. 18 (3): HASIL DAN PEMBAHASAN Uji Presisi Instrumen HPLC Hasil uji presisi instrumen HPLC denan menunakan larutan kolesterol standar 50 µ/ml dapat dilihat pada Tabel 1. Dari tabel tersebut dapat diketahui bahwa presisi luas puncak maupun waktu retensi dari puncak kolesterol masin-masin sebesar 2,23 dan 0,59%. Waktu retensi puncak kolesterol ratarata 1,52 menit. Apabila merujuk JECFA (2006), batas keberterimaan presisi instrumen adalah 2,0%, maka hasil presisi waktu retensi dapat diterima, sedankan presisi luas puncak sedikit lebih tini daripada batas tersebut. Uji Spesifisitas Uji spesifisitas dilakukan denan membandinkan puncak kolesterol yan diperoleh dari hasil injeksi larutan standar kolesterol, injeksi larutan hasil persiapan sampel telur saja, dan injeksi larutan hasil persiapan sampel telur yan diberi tambahan standar kolesterol. Hasilnya ditunjukkan pada Gambar 1 3. Dalam ambar, kolesterol terdeteksi pada waktu retensi 1,51 1,53 menit. Dalam Gambar 2 terlihat bahwa sampel telur mempunyai puncak kolesterol yan sama denan standar kolesterol dalam Gambar 1. Tini puncak kolesterol tersebut meninkat apabila ke dalam sampel yan sama ditambahkan standar kolesterol (Gambar 3). Denan demikian, kolesterol dapat terdeteksi dalam matriks sampel telur denan baik. Linearitas Metode Penujian linearitas motede analisis kolesterol menunakan instrumen HPLC ELSD dan matriks sampel telur menunjukkan linearitas yan baik, yaitu peninkatan respons instrumen yan proporsional denan peninkatan konsentrasi kolesterol dalam sampel telur. Ini berarti semakin tini konsentrasi kolesterol standar yan ditambahkan semakin tini dan luas puncak kolesterol yan diperoleh, meskipun tahap persiapan sampel yan dilakukan cukup panjan dan menentukan keakuratan hasil sesuai denan hasil review. Konsentrasi kolesterol standar yan ditambahkan pada penukuran linearitas ini µ/ sampel. Hasil penukuran linearitas metode dapat dilihat pada Gambar 4. Kurva liniearitas metode yan diperoleh mempunyai nilai R² sebesar 0,997. Nilai ini masuk m m ² 0,990 (EMA 1995). Denan menetahui nilai R² tersebut, disimpulkan bahwa metode analisis kolesterol menunakan HPLC-ELSD ini memiliki linearitas yan baik. Hasil uji linearitas metode yan dilakukan menunakan HPLC-ELSD ini menunjukkan nilai R 2 yan lebih baik apabila dibandinkan denan hasil yan diperoleh oleh Osman dan Chin (2006) menunakan HPLC-UV/Vis. Penelitian mereka membandinkan metode ekstraksi Bohac yan mempunyai nilai R 2 0,993, metode Beyer & Jensen Tabel 1 Hasil uji kesesuaian sistem analisis kolesterol menunakan instrumen HPLC-ELSD Ulanan (μ/ml) Luas puncak (mv.s) Waktu retensi (menit) Rata-Rata SD 1,14 0,01 RSD (%) 2,23 0,59 Gambar 1 Hasil injeksi larutan standar kolesterol (konsentrasi 1014 µ/ml) menunakan instrumen HPLC-ELSD denan kolom silika (25 cm x i.d. 4,6 cm, ukuran partikel 8 µm). Gambar 2 Hasil injeksi larutan sampel tanpa tambahan kolesterol standar menunakan instrumen HPLC-ELSD denan kolom silika (25 cm x i.d. 4,6 cm, ukuran partikel 8 µm).

5 Luas Area (mv.s) Luas Area (mv.s) 182 ISSN JIPI, Vol. 18 (3): y = 3,20x 107 R² = 0, Konsentrasi kolesterol standar (µ/ml) Gambar 3 Hasil injeksi larutan sampel yan ditambahi kolesterol standar (konsentrasi 507 µ/ml) menunakan instrumen HPLC-ELSD denan kolom silika (25 cm x i.d. 4,6 cm, ukuran partikel 8 µm) y = 35,58x 3141 R² = 0, Konsentrasi kolesterol standar (µ/) Gambar 4 Kurva linearitas metode analisis kolesterol denan tambahan standar ke dalam sampel menunakan HPLC-ELSD denan kolom silika (25 cm x i.d. 4,6 cm, ukuran partikel 8 µm). denan nilai R 2 0,990, dan metode Queensland Health Science Institute mencapai nilai R 2 0,941. Ketia metode diuji menunakan instrumen HPLC- UV/VIS detector sebanyak 8 kali ulanan. Fakta ini sejalan denan penelitian yan dilakukan oleh Avalli dan Contarini (2005), yan menyatakan bahwa HPLC- ELSD dapat menhasilkan respons yan linear untuk menukur fosfolipid di dalam produk susu. Limit Deteksi Instrumen Limit deteksi instrumen (LDI) adalah batas konsentrasi terendah yan dapat dideteksi oleh instrumen. Penujian ini pertama-tama dilakukan denan meninjeksikan larutan kolesterol standar dari konsentrasi 10, μ/ml. H ini kemudian diplotkan ke dalam sebuah kurva hubunan antara konsentrasi kolesterol standar dan luas puncaknya. Hasil penujian ditunjukkan pada Gambar 5. Kurva memiliki persamaan y = 3,20x 107 denan R 2 = 0,998. Diketahui bahwa konsentrasi 10,14 dan 25,35 μ/ml, tidak dapat dideteksi oleh HPLC-ELSD. Kolesterol dapat dideteksi mulai pada konsentrasi 50, μ/ml. Dapat disimpulkan bahwa konsentrasi kolesterol terendah yan dapat Gambar 5 Kurva standar analisis kolesterol 10, ,00 μ/ml tanpa menunakan matriks telur ayam. Larutan standar kolesterol pada berbaai konsentrasi diinjeksikan ke dalam HPLC-ELSD secara terpisah. dideteksi oleh HPLC-ELSD adalah 50,7 μ/ml. Penujian LDI dilanjutkan denan 7 kali peninjeksian standar kolesterol pada konsentrasi 50 μ/ml hasilnya dapat dilihat pada Tabel 2. LDI dari hasil penelitian ini adalah 1,07 µ/ml. Limit Kuantitasi (LOQ hitun ) merupakan batas terendah konsentrasi kolesterol yan dapat dilaporkan, di bawah konsentrasi ini disebut sebaai (H m 2004). N LOQ hitun dapat diperoleh dari nilai LDI, yaitu sebesar 10/3 kali LDI, sehina diperoleh nilai LOQ hitun sebesar 3,57 µ/ml. Nilai ini bila dibandinkan denan penelitian Osman dan Chin (2006) jauh lebih baik (Tabel 3). Rekoveri dan Keterulanan Rekoveri dilakukan pada 3 konsentrasi spikin yan berbeda, yaitu rendah (50 µ/ sampel), sedan (250 µ/ sampel), dan tini (3000 µ/ sampel). Hasil uji rekoveri pada analisis kolesterol ditampilkan pada Tabel 4, 5, dan 6. Nilai rekoveri ini diperoleh denan menunakan persamaan dari kurva linearitas sampel spikin denan kolesterol standar; persamaan yan diperoleh adalah y = 35,58x 3141 denan nilai R² sebesar 0,997. Rekoveri menunjukkan keakuratan hasil analisis yan diperoleh adalah 122,13% untuk konsentrasi spikin rendah. Nilai ini tidak sesuai denan keberterimaan menurut FDA (2012), yaitu %. Rekoveri pada konsentrasi spikin sedan memperoleh keakuratan sebesar 108,23% dan telah sesuai denan FDA (2012), yaitu %. Uji rekoveri konsentrasi spikin tini hanya memperoleh keakuratan sebesar 44,71%; nilai ini berada di bawah FDA (2012), yaitu %. Perbedaan hasil ini menunjukkan bahwa penukuran analisis kolesterol denan menunakan HPLC-ELSD hanya dapat dilakukan untuk sampel yan memiliki konsentrasi rendah sampai sedan. Keterulanan (ripitabilitas) ditunjukkan denan hasil RSD analisis, yaitu 5,26% untuk konsentrasi spikin rendah. Nilai ini telah sesuai denan FDA (2012), m m m 8 11.

6 ISSN JIPI, Vol. 18 (3): Tabel 2 Hasil penukuran larutan standar kolesterol konsentrasi 50 μ/ml penentuan limit deteksi instrumen Ulanan Ket : Konsentrasi Kolesterol S (μ/ml) Konsentrasi Kolesterol T c (μ/ml) Rata-Rata SD 0,36 RSD (%) 0,72 LDI (µ/ml) 1,07 LOQ** hitun (µ/ml) 3,57 * LDI = Limit deteksi instrumen ** LOQ = Limit of quantification Tabel 3 Perbandinan hasil uji LDI dan LOQ penulis denan Osman dan Chin (2006) LDI LOQ Peneliti Instrumen hitun (µ/ml) (µ/ml) Penulis HPLC-ELSD 1,07 3,57 Osman dan Chin (2006) Spektrofotometer HPLC-UV 0,08 0,60 GC 4,00 13 Tabel 4 Hasil uji rekoveri analisis kolesterol dalam sampel telur pada konsentrasi spike rendah (50 µ/ sampel) menunakan instrumen HPLC-ELSD denan kolom silika Ulanan Kolesterol yan ditambahkan (μ/) Jumlah kolesterol standar yan c (μ/) Rekoveri (%) ,53 115, ,11 122, ,86 125, ,34 126, ,84 115, ,90 131, ,39 116,87 Rata-Rata SD 3,21 RSD (%) 5,26 Keterulanan pada konsentrasi spikin sedan mempunyai nilai RSD sebesar 4,29% dan telah sesuai denan FDA (2012). Uji ripitabilitas konsentrasi spikin tini hanya memperoleh nilai RSD sebesar Tabel 5 Hasil uji rekoveri analisis kolesterol dalam sampel telur pada konsentrasi spike sedan (250 µ/ sampel) menunakan instrumen HPLC-ELSD denan kolom silika Ulanan Kolesterol yan ditambahkan (μ/) Jumlah kolesterol standar yan c (μ/) Rekoveri (%) ,77 109, ,28 100, ,85 104, ,61 107, ,42 110, ,37 114, ,07 111,77 Rata-Rata SD 11,72 RSD (%) 4,29 Tabel 6 Hasil uji rekoveri analisis kolesterol dalam sampel telur pada konsentrasi spike tini (3000 µ/ sampel) menunakan instrumen HPLC-ELSD denan kolom silika Ulanan Kolesterol yan ditambahkan (μ/) Jumlah kolesterol standar yan c (μ/) Rekoveri (%) ,52 52, ,04 46, ,45 38, ,82 44, ,48 46, ,98 41, ,92 42,06 Rata-Rata SD 134,84 RSD (%) 10,11 10,11%, dan nilai ini masih berada dalam kisaran FDA (2012). Dalam penelitian Osman dan Chin (2006), uji rekoveri hanya dilakukan pada 1 konsentrasi spikin, yaitu pada konsentrasi 300 µ/ml kolesterol standar. Denan nilai konsentrasi yan terbaik dicapai pada metode Bohac denan instrumen HPLC UV-VIS yan mencapai nilai rekoveri 96,67% denan RSD 7,50%. Hal ini menunjukkan bahwa metode HPLC-ELSD yan telah dilakukan oleh peneliti memiliki nilai rekoveri yan lebih baik, sebaaimana ditunjukkan denan nilai RSD yan lebih rendah daripada metode yan dilakukan oleh Osman dan Chin (2006). Limit Deteksi Metode (MDL) Uji MDL merupakan kelanjutan dari uji rekoveri denan memplotkan nilai standar deviasi (SD) pada setiap konsentrasi spikin ke dalam sebuah kurva hubunan antara konsentrasi standar kolesterol yan

7 Standar Deviasi (µ/) 184 ISSN JIPI, Vol. 18 (3): Gambar 6 Kurva uji limit deteksi metode (MDL) dalam analisis kolesterol menunakan instrumen HPLC-ELSD denan matriks sampel telur. Tabel 7 Hasil uji reprodusibilitas intralab analisis kolesterol pada telur denan HPLC-ELSD dan kolom silica Bulan ke Hasil analisis (μ/)* Rata-rata hasil analisi (μ/) 1 564,27 562,68 2,25 ditambahkan dan nilai SD yan diperoleh. Hasil uji MDL pada 3 konsentrasi yan berbeda dapat dilihat pada Gambar 6. Dari hasil persamaan y = 0,042x + 0,741 denan nilai R 2 sama denan 1, diperoleh intersepsi SD 0 (x = 0), yaitu 0,741 µ/. Nilai MDL dihitun sebesar 3 kali SD 0 ialah 2,30 µ/; nilai ini lebih rendah daripada LOQ hitun (3,57 µ/ml). Hal ini menunjukkan bahwa metode yan diunakan memiliki tinkat sensitivitas yan baik karena dapat mendeteksi kolesterol dalam maktriks hina konsentrasi 2,30 µ/. Reprodusibilitas Intralab Hasil uji reprodusibilitas intralab dapat dilihat pada Tabel 7. Reprodusibilitas Intralab diketahui dari nilai RSD yan dihasilkan, yaitu 0,04%, nilai ini telah memenuhi batas keberterimaan menurut FDA (2012), yaitu tidak lebih dari 8%. Hasil ini menunjukkan bahwa metode yan telah dilakukan memiliki nilai keterulanan yan baik pada selan waktu tertentu. Setelah diuji T, diketahui bahwa antar kedua ulanan tersebut tidak berbeda nyata. KESIMPULAN y = 0,044x + 0,768 R² = Konsentrasi Kolesterol yan Ditambahkan (µ/) SD RSD T hitun 2 561,09 Ket: * = rata-rata dari 3 ulanan analisis ** = tidak berbeda nyata 0,40 0,4079** Hasil validasi metode analisis kolesterol menunakan HPLC ELSD denan matriks sampel telur adalah valid untuk j 3000 µ/ sampel. Metode tersebut dapat diunakan untuk analisis rutin di laboratorium penujian. UCAPAN TERIMA KASIH Penulis menucapkan terima kasih kepada laboratorium terakreditasi LDITP, Departemen Ilmu dan Teknoloi Panan, Fakultas Teknoloi Pertanian, Institut Pertanian Boor yan telah memberi dana penelitian dan dukunan sarana. Ucapan terima kasih jua disampaikan penulis kepada teknisi Ririn dan Taufik yan telah membantu dalam penunaan instrumen HPLC-ELSD. DAFTAR PUSTAKA Avalli A, Contarini G Determination of phospholipids in dairy products by SPE/HPLC/ELSD. J. Chromator A. 1071(1 20): [EMA] The European Aency for the Evaluation of Medical Products ICH. Topic Q2B. Validation of Analytical Procedures: Methodoloy. [Internet] [diunduh 2010 Nov 2]. Tersedia pada: ch/support/pdfsupport/q2a.pdf. [EURACHEM] Workin Group The Fitness for Purpose of Analytical Methods A Laboratory Guide to Methods Validation and related Topics. [Internet] [diunduh 2010 Nov 2]. Tersedia pada: php/publications/uides/mv. FDA Guidelines for the Validation of Chemical Methods for the FDA Foods Proram. [Internet] [diunduh 2013 Jan 30]. Tersedia pada: eldscience/ucm pdf. Ference BA, Yoo W, Alesh I, Mahajan N, Mirowska KK, Mewada A, Kahn J, Afonso L, Williams KA, Flack JM Effect of lon-term exposure to lower low-density lipoprotein cholesterol beinnin early in life on the risk of coronary heart desease: A Mendelian randomization analysis. Journal of the American Collee of Cardioloy. 60(25): Hadi A Pemahaman dan Penerapan ISO/IEC 17025:2005. Jakarta (ID): Gramedia Pustaka Utama. Harmita Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan perhitunannya. Maj Il Kefarm. 1(3): Huber L Validation of Analytical Methods. [Internet] [diunduh 2010 Okt 8]. Tersedia pada: [JECFA] Joint Expert Committee on Food Additives Combined Compendium of Food Additive Specifications Volume 4. Analytical Methods, Test Procedures and Laboratory Solutions Used By And Referenced in The Food Additive Specifications.

8 ISSN JIPI, Vol. 18 (3): Rome (IT): Food and Ariculture Oranization of The United Nations. Letter WS A Rapid Method for Phospholipid Class Separation by HPLC usin an Evaporative Liht-Scatterin Detector. J Liquid Chromator. 15(2): Min DB, Steenson DF Crude fat analysis. Dalam: Food Analysis. Ed. Ke-3. SS. Nielsen (ed). Maryland (US): Aspen Publ. Osman H, Chin YK Comparative sensitivities of cholesterol analysis usin GC, HPLC and spectrophotometric methods. The Malay J Anal Sci. 10(2): Sullivan DM, Carpenter DE Methods of analysis for nutrition labelin. Chapter 11, AOAC Official Method , Cholesterol in Multicomponent Foods, hlm USDA Cholesterol Hih Avoid. [Internet] [Diunduh 2011 Feb 10]. Tersedia pada: http: php.