Validasi Metode Analisis Kolesterol dalam Telur dengan HPLC-ELSD. (Method Validation of Cholesterol Analysis in Egg Using HPLC-ELSD)

Transkripsi

1

2 Vol. 18 (): Jurnailimu Pertanian Indonesia (JIPI). Desember 01 ISSN 08-1 Validasi Metode Analisis Kolesterol dalam Telur dengan HPLC-ELSD (Method Validation of Cholesterol Analysis in Egg Using HPLC-ELSD) Hanifah Nuryani Lioe*, Tika Setianingrum, Ririn Anggraeni ABSTRAK Metode analisis dalam telur menggunakan instrumen kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) yang dilengkapi dengan detektor evaporative light scattering (ELSD) divalidasi dalam penelitian ini. Kolom silika dan campuran tunggal fase gerak yang terdiri atas 90% heksana dan 10% isopropanol dipakai untuk menentukan dengan HPLC. Kolesterol terdeteksi pada waktu retensi 1, menit memakai stan dar dan kondisi HPLC-ELSD: suhu evaporasl C, tekanan udara, bar, dan laju alir fase gerak mumin. Linearitas metode analisis menggunakan matriks sampol telur dicapai pada konsentrasi - jjg/g sampel, dengan >O,990. Limit deteksi instrumen dan limit kuantifikasi berturut-turut diperoleh pada konsentrasi larutan 1,0 dan, jjg/ml. Hasil ujl rekoveri dengan metode penambahan standar dalam matriks sampel telur pada konsentrasi rendah ( jjg/g), sedang ( jjg/g), dan tinggl ( jjg/g) masing-masing adalah 1,1, 108,, dan,1 %, dengan nilai presisl masing-masing,,,9, dan 10,11 %. Limit deteksi metode diketahui pada konsentrasi,0 jjg/g. Reprodusibilitas intralab untuk menganalaisis sebuah sampel telur adalah 0,0%. Metode analisis dalam telur ini dinyatakan valid apabila digunakan untuk analisis pada konsentrasi rendah dan sedang dalam sampel. Kata kunci: HPLC-ELSD,, telur, validasi metode ABSTRACT A method using high-performance liquid chomatography (HPLC) coupled with an evaporative light-scattering detector (ELSD) for the determination of cholesterol in egg was validated. A silica column and a binary mixture of hexane and isopropanol (90:10) as a mobile phase were used to separate cholesterol. Cholesterol was detected at 1. min using cholesterol standard and HPLC-ELSD condition : evaporation temperature C, air pressure. bars, and flow rate of mobile phase mumin. A method linearity for the cholesterol analysis in egg as a sample matrix was obtained at a range of to jjg/g sample, with R > Instrument detection limit and limit of quantitation were determined at 1.0 and. jjg/ml, respectively. Recovery test results by spiking cholesterol standard in egg sample at low, medium, and high concentrations (, and jjg/g ) were 1.1, 108., and.1 %, respectively. Their corresponding repeatability values were.,.9, and %. Method detection limit and intralab reproducibility (to analyze a sample) were observed at.0 jjg/g and 0.0%. The method is valid for cholesterol analysis in egg at low and medium concentrations. Keywords : cholesterol analysis, egg, HPLC-ELSD, method validation PENDAHULUAN Kolesterol merupakan jenis steroid yang paling dikenal dengan atom karbon. Kolesterol hanya ditemukan pad a pangan yang berasal dari hewan. Berikut adalah beberapa contoh kandungan dalam produk pangan berdasarkan hasil penelitian USDA (011). Kandungan dalam produk daging dan olahannya adalah -010 mg/100 g, untuk produk telur dan olahannya mencapai - mg/100 g, untuk prod uk ikan dan olahannya mencapai - mg/100 g, dan produk ayam dan olahannya mencapai -8 mg/100 g. Menurut anjuran yang dikeluarkan oleh USDA (011), produk pangan yang mengandung lebih dari 00,00 mg/100 9 sebaiknya dihindari, terutama pengaruhnya Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan. Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Kampus IPB Darmaga. Bogor 180. Penulis korespondensi: hanilioe@hotmail.com terhadap risiko penyakit jantung koroner (Ference et a/. 01). Kolesterol pun dapat membentuk produk hasil oksidasi dalam pangan olahan selama proses pemanasan, contohnya pad a pengolahan pasta yang mengandung telur. Kecukupan asupan yang dibutuhkan oleh tubuh dapat diperoleh dari bahan pangan yang dikonsumsi sehari-hari. Informasi mengenai kadar dari berbagai bah an pangan yang dikonsumsi setiap harinya sangat penting untuk diketahu i mengingat setiap jenis bahan pangan memiliki kandungan yang berbedabeda. Kadar di dalam bahan pangan dapat diukur dengan berbagai metode, akan tetapi tahap yang paling kritis dalam metode anal isis adalah tahap persiapan sam pel. Analisis diawali dengan proses ekstraksi; proses ini dipengaruhi oleh ban yak hal. Salah satu hal penting yang menentukan dalam proses ekstraksi adalah matriks bahan pangan (Min & Steenson 1998). Matriks bahan pang an adalah jaringan makanan tempat zat gizi terperangkap.

3 ISSN 08-1 JIPI, Vol. 18 (): Proses persiapan sam pel berupa hidrolisis oleh asam dapat digunakan untuk menghilangkan interaksi yang menghambat ekstraksi komponen target. Menurut Min dan Streenson (1998), hidrolisis oleh asam dapat memecah ikatan kovalen dan ikatan ionik pada sam pel sehingga ikatan antara senyawa target dan komponen matriks sampel dapat terlepas. Hal ini menyebabkan senyawa target mudah diekstraksi. Berdasarkan penelitian Osman dan Chin (00), dapat dideteksi dan ditentukan kuantitasnya dengan menggunakan beberapa metode seperti spektrofotometer UV-VIS, kromatografi gas (GC), dan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dengan detektor UV. Dengan metode spektrofotometer UVVIS dapat dideteksi hingga konsentrasi 1 g/ml, dengan menggunakan GC terdeteksi hingga,00 g/ml, dan dengan menggunakan HPLC-UV terdeteksi hingga 0,08 g/ml. HPLC yang dipadu dengan detektor evaporative light scattering detector (ELSD) masih jarang digunakan untuk analisis, akan tetapi menurut Letter (199), HPLC-ELSD dapat digunakan untuk mengklasifikasikan fosfolipid (, fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin, fosfatidikolin, dan spingomielin) pada konsentrasi g/l. Metode analisis yang tidak baku dan yang dikembangkan suatu laboratorium, serta metode baku yang digunakan di luar lingkup yang dimaksudkan memerlukan proses validasi metode (Hadi 00). Validasi metode adalah suatu proses untuk mengkonfirmasi bahwa prosedur analisis yang dilakukan untuk pengujian tertentu sesuai dengan tujuan yang diharapkan (Huber 001). Tujuan penelitian ini adalah memvalidasi analisis dalam bahan pangan dengan matriks sam pel telur dengan menggunakan metode deteksi HPLC-ELSD. Validasi metode analisis terdiri atas uji presisi instrumen, spesifisitas, linearitas metode, limit deteksi instrumen (LDI) dan limit kuantifikasi, rekoveri, keterulangan, metode deteksi limit (method detection limit, MDL), dan intralab reprodusibilitas. Validasi metode dilakukan dengan menggunakan matriks. METODE PENELITIAN Sam pel yang digunakan adalah telur ayam broiler (Gal/us sp.) yang diperoleh dari pasar lokal di sekitar Bogor. Jumlah sampel yang dibeli adalah satu kotak (10 butir). Preparasi sam pel diawali dengan pencampuran 10 butir telur dalam sebuah wadah, kemudian dikocok hingga tercampur rata. Sam pel yang telah tercampur rata kemudian di masukkan ke dalam 1 kantung plastik kecil dan disimpan dalam lemari pembeku dengan suhu -18 C hingga dilakukan validasi analisis. Bahan pereaksi dan pelarut yang digunakan adalah metanol, KOH, heksan, gas N z teknis, gas Nz HP (high purity), HCI, -propanol (isopropanol), standar kemurnian 9% (Sigma Chemical 19 Inc, USA), air bebas ion, Na ZS0 anhidrous, dan kertas saring. Alat yang digunakan pad a penelitian ini timbangan analitik, waterbath, seperangkat alat gelas dan HPLC LC A (Shimadzu, Jepang) yang dilengkapi kolom normal phase silika LiChrosorb Si 0 (10/lm) ( cm x i.d., cm) (Merck, Jerman), dan detektor ELSD Sedex (Sedere, Prancis). Validasi metode analisis yang dilakukan meliputi uji pres lsi instrumen, spesifisitas, pengukuran linearitas metode, limit deteksi instrumen (IDL), limit kuantifikasi (LOa), ketepatan (akurasi), dan ketelitian (presisi) dari hasil uji rekoveri pada konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi, penentuan limit deteksi metode (method detection limit, MDL) dan intrareprodusibilitas menurut EURACHEM (1998) dan FDA (01). Uji Presisi Instrumen Uji ini dilakukan dengan cara menginjeksikan larutan standar (konsentrasi g/ml) sebanyak ulangan ke instrumen HPLC, kemudian dihitung nilai standar deviasi (SD)-nya dan standar deviasi relatif (RSD)-nya dari waktu retensi dan luas puncak yang terdeteksi. Batas keberterimaan menurut JECFA (00) adalah RSD $,00%. Spesifisitas Spesifisitas diamati dari hasil injeksi larutan standar, larutan sam pel telur dengan dan. tanpa tambahan standar. Linearitas Metode Linearitas metode ditentukan dengan menginjeksikan larutan sampel telur ( 9 sam pel) yang ditambahkan standar pada konsentrasi yang berbeda (00,, 10,, 0, dan 100 g/ml). Pengujian dilakukan kali pada setiap konsentrasi standar. Linearitas diukur dengan nilai Fi dari kurva hubungan antara luas puncak (sebagai sumbu y) dan konsentrasinya (g/g) (sebagai sumbu x). Linearitas yang baik adalah lebih dari 0,990. Limit Deteksi Instrumen dan Limit Kuantifikasi Limit deteksi instrumen (IDL) dan limit kuantifikasi (LOa) ditentukan dengan cara menginjeksikan larutan standar pada konsentrasi terendah yang dapat dideteksi oleh HPLC-ELSD. Injeksi ini dilakukan sebanyak kali sehingga diperoleh hasil konsentrasi yang terukur. Standar deviasi dari konsentrasi ini dihitung, kemudian nilai IDL ditentukan dari rumus x SD, sedangkan LOa dari 10 x SD. Akurasi dan Presisi Akurasi dan presisi ditentukan dari uji rekoveri. Uji ini dilakukan dengan menggunakan sam pel spike pada konsentrasi berbeda. Konsentrasi spiking yang diuji adalah konsentrasi rendah ( g/g), konsentrasi sedang ( g/g), dan konsentrasi tinggi, yaitu konsentrasi tertinggi yang dapat

4 r 180 ISSN 08-1 ditemui dalam telur ( I-Ig/g). Spiking dieoba sebanyak kali untuk setiap tingkat konsentrasi. Rekoveri dihitung dengan menggunakan rumus berikut: Rekoveri % = konsentrasi yang ditemukan - konsentrasi sam pel tanpa spiking X 100% konsentrasi spiking Presisi atau keterulangan dapat diketahui dari hasil pengukuran sampel spike pad a konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi. Mula-mula rata-rata dan hasil uji sampel spike pad a konsentrasi tertentu dihitung, kemudian R ditentukan. R merupakan presisi atau keterulangan. limit Deteksi Metode Limit deteksi metode (MOL) ditentukan dari kurva hubungan linear antara (sumbu y) dari hasil uji rekoveri dengan konsentrasi standar yang bersangkutan (sumbu x). Nilai interpolasi pada x sama dengan nol dinyatakan sebagai D. Nilai MOL dihitung sebagai kali nilai D. Reprodusibilitas Intra lab. Reprodusibilitas intermediet menggunakan operator, 1 laboratorium tetapi pada waktu yang berbeda atau disebut juga reprodusibilitas intralab. Ini dilakukan dengan menggunakan 1 sam pel matriks yang dianalisis sebanyak ulangan dalam waktu yang sama. Rerata dari pengukuran dalam waktu yang berbeda dan standar deviasi dari rata-rata tersebut dihitung, selanjutnya intralab reprodusibilitas ditentukan dari R perhitungan tersebut. Prosedur Analisis Kolesterol Prosedur analisis yang dilakukan diawali dengan menyiapkan larutan standar, menyiapkan sam pel pad a matriks telur untuk memperoleh larutan sam pel, dan menentukan kandungan dengan menggunakan HPLC-EL. Persiapan larutan standar Sejumlah dan 1 mg standar powder masing-masing dilarutkan dalam ml fase gerak HPLC (heksan :isopropanol = 90: 10) yang terpisah. Larutan standar stok Inl mempun yai konsentrasi 1000 dan I-Ig/mL. Selanjutnya serial pengeneeran larutan stok menggunakan fase gerak sebagai pelarut dibuat untuk memperoleh larutan dengan konsentrasi 10,,, 100, 1,, 00, 0,, 10,, dan 0 I-Ig/mL. Penyiapan larutan sam pel telur (AOAC 9.. dalam Sullivan dan Carpenter 199) Sekitar 9 sam pel telur (sam pel telur telah dihomogenkan) ditimbang dalam tabung reaksi bertutup, selanjutnya ditambahkan 10 ml larutan HCI ( :1) lalu divorteks hingga tereampur. Untuk uji linearitas metode dengan sam pel spiking, sebelum ditambahkan HCI, sam pel diberi tambahan standar sebanyak 1 ml dari setiap konsentras i di JIPI, Vol. 18 (): atas. Tahap ini dilanjutkan dengan mengembusan gas N selama 0 detik lalu ditutup dengan segera untuk menghindari oksidasi. Kemudian eampuran dipanaskan pada penangas air mendidih selama 0 men it, sambil dikoeok setiap menit. Setelah selesai, isi dalam tabung reaksi tersebut didinginkan dengan eara ujung tabung dikenakan air mengalir. lsi tabung dipindahkan ke dalam labu pemisah ( ml), tabung reaksi dibilas dengan x 10 ml air bebas ion, lalu air bilasan tersebut digabungkan ke dalam labu pemisah. Kolesterol dalam sam pel yang terdapat dalam tabung diekstraksi dengan heksana x 10 ml sambil dikoeok. Fraksi heksana diambil lalu heksana yang terkandung diuapkan dengan gas N. Setelah kering, padatan yang diperoleh ditambahkan 10 ml KOH % dalam metanol lalu dipanaskan 80 C selama 0 menit. Komponen kemudian diekstraksi dengan heksana x 10 ml dalam labu pemisah dan fraksi heksana disaring dengan menggunakan kertas saring yang diberi tambahan NaS0 anhidrat 1- g. Heksana yang terkandung dalam fraksi itu diuapkan dengan gas N. Setelah kering, padatan dilarutkan dengan fase gerak pada volume tertentu (1,0 ml) seeara tepat. Kemudian larutan tersebut dieneerkan sebanyak 10 kali tingkat pengeneeran. Larutan sam pel ini siap diinjeksikan ke HPLC. Penentuan dengan HPLC-ELSD Analisis. dengan HPLC-EL merupakan hasil pengembangan di laboratorium LOITP milik Oepartemen IImu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor dengan kondisi isokratik menggunakan: Fase gerak : Heksan: -propanol (90:10) Kolom : silika ( em x i.d., em, ukuran partikel 8 I-Im) Laju alir : mllmenit Suhu : C Oetektor : EL (Sedex ) dengan tekanan gas Nsebesar, bar, Gain. Volume injeksi : 0 I-IL Sam pel diinjeksikan seeara terpisah dari injeksi standar dengan menggunakan kondisi HPLC di atas, kemudian luas respons dieatat. Kurva standar yang merupakan hubungan linear antara area dan konsentrasi standar dibuat. Selanjutnya luas puneak dari kromatogram sam pel dibaea dan dihubungkan dengan kurva standar untuk memperoleh konsentrasi standar dari kurva (J.lg/mL). Konsentrasi dalam sampel dihitung dengan rumus: 1-19 / = /9 sampel Konsentrasi dari kurva g ml x volume larutan sampel ml x Fp berat sam pel 9 Keterangan :. Fp = faktor pengeneeran dari larutan sam pel akhlr apabila dilakukan pengeneeran sebelum larutan diinjeksikan ke HPLC.

5 ISSN 08-1 JIPI, Vol. 18 (): HASIL DAN PEMBAHASAN dengan baik. Uji Presisi Instrumen HPLC Hasil uji presisi instrumen HPLC dengan menggunakan larutan standar I-Ig/mL dapat dilihat pada Tabel 1. Dari tabel tersebut dapat diketahui bahwa presisi luas puncak maupun waktu retensi dari puncak masing-masing sebesar, dan 0,9%. Waktu retensi puncak ratarata 1, menit. Apabila merujuk JECFA (00), batas keberterimaan presisi instrumen adalah,0%, maka hasil presisi waktu retensi dapat diterima, sedangkan presisi luas puncak sedikit lebih tinggi daripada batas tersebut. Uji Spesifisitas Uji spesifisitas dilakukan dengan membandingkan puncak yang diperoleh dari hasil injeksi larutan standar, injeksi larutan hasil persiapan sampel telur saja, dan injeksi larutan hasil persiapan sam pel telur yang diberi tambahan standar. Hasilnya ditunjukkan pad a Gambar 1-. Dalam gam bar, terdeteksi pad a waktu retensi 1,1-1, menit. Dalam Gambar terlihat bahwa sampel telur mempunyai puncak yang sama dengan standar dalam Gambar 1. Tinggi puncak tersebut meningkat apabila ke dalam sam pel yang sama ditambahkan standar (Gam bar ). Dengan demikian, dapat terdeteksi dalam matriks sam pel telur Linearitas Metode Pengujian linearitas motede analisis kolestero l menggunakan instrumen HPLC - ELSD dan matriks sam pel telur menunjukkan linearitas yang baik, yaitu peningkatan respons instrumen yang proporsional dengan peningkatan konsentrasi dalam sam pel telur. Ini berarti semakin tinggi konsentrasi standar yang ditambahkan semakin tinggi dan luas puncak yang diperoleh, meskipun tahap persiapan sampel yang dilakukan cukup panjang dan menentukan keakuratan hasil sesuai dengan hasil review. Konsentrasi standar yang ditambahkan pad a pengukuran linearitas ini - I-Ig/g sam pel. Hasil pengukuran linearitas metode dapat dilihat pada Gambar. Kurva liniearitas metode yang diperoleh mempunyai nilai R sebesar 0,99. Nilai ini masuk dalam batas keberterimaan W 0,990 (EMA 199). Dengan mengetahui nilai R tersebut, disimpulkan bahwa metode analisis menggunakan HPLC-ELSD ini memiliki linearitas yang baik. Hasil uji linearitas metode yang dilakukan menggunakan HPLC-ELSD ini menunjukkan nilai R yang lebih baik apabila dibandingkan dengan hasil yang diperoleh oleh Osman dan Chin (00) menggunakan HPLC-UVNis. Penelitian mereka membandingkan metode ekstraksi Bohac yang mempunyai nilai 0,99, metode Beyer & Jensen Tabel 1 Hasil uji kesesuaian sistem analisis menggunakan instrumen HPLC-EL Konsentrasi standar (flg/ml) R(%) Waktu retensi (menit) ,01 0,9 Luas puneak (mv.s) ,1, {;O,1,j " ;, '... "- '... - "". ' "--" ; Ti r.:t t I:<.1:',. j Gambar 1 Hasil injeksi larutan standar (konsentrasi 101 flg/ml) menggunakan instrumen HPLC-EL dengan kolom silika ( em x i.d., em, ukuran partikel 8 flm). ti! m: l Gambar Hasil injeksi larutan sampel tanpa tambahan standar menggunakan instrumen HPLC-EL dengan kolom silika ( em x i.d., em, ukuran partikel 8 flm).

6 18 ISSN 08-1 JIPI, Vol. 18 () : tiqooo > y =,0x - 10 R = 0, ro 0 -., is :.' -] -i 1 j I y =,8x - 11 W = 0,99 i 1 i /:y;." O. c»l , o Konsentrasi standar (ljg/ml) ir-o:'1. \ Gambar Hasil injeksi larutan sam pel yang ditambahi standar (konsentrasi pg/ml) menggunakan instrumen HPLC-ELSD dengan kolom silika ( em x i.d., em, ukuran partikel 8IJ m) Konsentrasi standar (J.1g/g) Gambar Kurva linearitas metode analisis dengan tambahan standar ke dalam sam pel menggunakan HPLC-ELSD dengan kolom silika ( em x i. d., em, ukuran partikel 8 IJm). dengan nilai RL 0,990, dan metode Queensland Health Science Institute mencapai nilai k- 0,91. Ketiga metode diuji menggunakan instrumen HPLCUVNIS detector sebanyak 8 kali ulangan. Fakta ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Avalli dan Contarini (00), yang menyatakan bahwa HPLCELSD dapat menghasilkan re:spons yang linear untuk mengukur fosfolipid di dalam produk susu. Limit Deteksi Instrumen Limit deteksi instrumen (LDI) adalah batas konsentrasi terendah yang dapat dideteksi oleh instrumen. Pengujian ini pertama-tama dilakukan dengan menginjeksikan larutan standar dari konsentrasi 10,1-101 I-Ig/mL. Hasil dari pengukuran ini kemudian diplotkan ke dalam sebuah kurva hubungan antara konsentrasi standar dan luas puncaknya. Hasil pengujian ditunjukkan pad a Gambar. Kurva memiliki persamaan y =,0x - 10 dengan k- = 0,998. Diketahui bahwa konsentrasi 10,1 dan, pg/ml, tidak dapat dideteksi oleh HPLC-ELSD. Kolesterol dapat dideteksi mulai pad a konsentrasi,- 101 pg/ml. Dapat disimpulkan bahwa konsentrasi terendah yang dapat Gambar Kurva standar analisis 10,1-101,00 pg/ml tanpa menggunakan matriks telur ayam. Larutan standar pada berbagai konsentrasi diinjeksikan ke dalam HPLC-ELSD seeara terpisah. dideteksi oleh HPLC-ELSD adalah, Ilg/mL. Pengujian LDI dilanjutkan dengan kali penginjeksian standar pada konsentrasi I-Ig/mL yang hasilnya dapat dilihat pad a Tabel. LDI dari hasil penelitian ini adalah 1,0 I-Ig/mL. Limit Kuantitasi (LOQhitung) merupakan batas terendah konsentrasi yang dapat dilaporkan, di bawah konsentrasi ini disebut sebagai 'tidak terdeteksi' (Harmita 00). Nilai LOQhitung dapat diperoleh dari nilai LDI, yaitu sebesar 10/ kal i LDI, sehingga diperoleh nilai LOQhitung sebesar, I-Ig/mL. Nilai ini bila dibandingkan dengan penelitian Osman dan Chin (00) jauh lebih baik (Tabel ). Rekoveri dan Keterulangan Rekoveri dilakukan pada konsentrasi spiking yang berbeda, yaitu rendah ( I-Ig/g sampel), sedang ( I-Ig/g sam pel), dan tinggi ( I-Ig/g sam pel). Hasil uji rekoveri pada anal isis ditampilkan pad a Tabel,, dan. Nilai rekoveri ini diperoleh dengan menggunakan persamaan dari kurva linearitas sampel spiking dengan standar; persamaan yang diperoleh adalah y =,8x - 11 dengan nilai R sebesar 0,99. Rekoveri menunjukkan keakuratan hasil analisis yang diperoleh adalah 1,1% untuk konsentrasi spiking rendah. Nilai ini tidak sesuai dengan keberterimaan menurut FDA (01), yaitu %. Rekoveri pada konsentrasi spiking sedang memperoleh keakuratan sebesar 108,% dan telah sesuai dengan FDA (01), yaitu 90-10%. Uji rekoveri konsentrasi spiking tinggi hanya memperoleh keakuratan sebesar,1 %; nilai ini berada di bawah FDA (01), yaitu 9-10%. Perbedaan hasil ini menunjukkan bahwa pengukuran analisis dengan menggunakan HPLC-ELSD hanya dapa dilakukan untuk sam pel yang memiliki konsentrasl rendah sampai sedang. Keterulangan (ripitabilitas) ditunjukkan denga hasil RSD analisis, yaitu,% untuk konsentrasl spiking rendah. Nilai ini telah sesuai dengan FDA (01), yaitu maksimal dala m kisaran 8-11 %.

7 ISSN 08-1 JIPI, Vol. 18 (): Tabel Hasil pengukuran larutan standar konsentrasi g/ml untuk penentuan limit deteksi instrumen Konsentrasi Kolesterol Standar (g/ml) Konsentrasi Kolesterol yang T erbaca (g/ml) Ket : 0, R(%) 0, LOI (J.l9/mL) 1,0 LOa" hitung (J.l9/mL), R(%) Tabel Perbandingan hasil uji LOI dan LOa penulis dengan Osman dan Chin (00) Instrumen Penulis HPLC-EL Osman dan Chin (00) LOI LOOhitung (g/ml) (g/ml) 1,0 Spektrofotometer HPLC-UV GC (g/g) 1 1 0,08,00 0,0 Jumlah standar yang terbaca 1 Rekoveri (%) (g/g),,,8 1,8 11,8,90 8,9 11,8, Tabel Hasil uji rekoveri analisis dalam sampel telur pada konsentrasi spike rendah ( g/g sampel) menggunakan instrumen HPLC-EL dengan kolom silika Kolesterol yang ditambahkan 1,11, R(%),1, Jumlah standar yang terbaca (g/g) Rekoveri (%),,8,8 0,1 109,1 100,, 88, 8,0 110,0 11,1 111,.0 11,,9 10,0 10, Tabel Hasil uji rekoveri analisis dalam sam pel telur pada konsentrasi spike tinggi ( g/g sampel) menggunakan instrumen HPLC-EL dengan kolom silika LOI = Limit deteksi instrumen LOa = Limit of quantification Peneliti Kolesterol yang ditambahkan (g/g) 9. Tabel Hasil uji rekoveri analisis dalam sampel telur pad a konsentrasi spike sedang ( g/g sampel) menggunakan instrumen HPLC-EL dengan kolom silika 11,1 1, 1,90 11, Keterulangan pada konsentrasi spiking sedang mempunyai nilai RSD sebesar,9% dan telah sesuai dengan FDA (01). Uji ripitabilitas konsentrasi spiking tinggi hanya memperoleh nilai RSD sebesar ditambahkan Jumlah standar yang (g/g) terbaca (g/g) 19, 19,0 11, 11,8 181,8 11,98 1,9 Kolesterol yang R(%) 1.00 Rekoveri (%),8, 8,,9, 1,9, ,8 10,11 10,11 %, dan nilai ini masih berada dalam kisaran FDA (01). Dalam penelitian Osman dan Chin (00), uji rekoveri hanya dilakukan pada 1 konsentrasi spiking, yaitu pada konsentrasi 00 g/ml standar. Dengan nilai konsentrasi yang terbaik dicapai pada metode Bohac dengan instrumen HPLC UV-VIS yang mencapai nilai rekoveri 9,% dengan RSD,%. Hal ini menunjukkan bahwa metode HPLC-ELSD yang telah dilakukan oleh peneliti memiliki nilai rekoveri yang lebih baik, sebagaimana ditunjukkan dengan nilai RSD yang lebih rendah daripada metode yang dilakukan oleh Osman dan Chin (00). Limit Oeteksi Metode (MOL) Uji MDL merupakan kelanjutan dari uji rekoveri dengan memplotkan nilai standar deviasi (SD) pada setiap konsentrasi spiking ke dalam sebuah kurva hubungan antara konsentrasi standar yang

8 18 ISSN 08-1 ; 1 : 100 : 80 c 0 L.. c 111 en UCAPAN TERIMA KASIH y = 0,0x + 0,8 R = O. o Penulis mengucapkan terima kasih kepada laboratorium terakreditasi LDITP, Departemen IImu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertan ian Bogor yang telah memberi dana penelitian dan dukungan sarana. Ucapan terima kasih juga disampaikan penulis kepada teknisi Ririn dan Taufik yang telah membantu dalam penggunaan instrumen HPLC-ELSD. Konsentrasi Kolesterol yang Oitambahkan (jjg/g) Gambar Kurva uji limit deteksi metode (MOL) dalam analisis menggunakan instrumen HPLC-EL dengan matriks sampel telur. Tabel Hasil uji reprodusibilitas intralab analisis pad a telur dengan HPLC-EL dan kolom silica Bulan ke- Ket: JIPI, Vol. 18 (): Hasil analisis Rata-rata hasil analisi {Hg/gt {Hg/g},,8, R Thitung 0,0 0,09-- 1,09 = rata-rata dari ulangan analisis = tidak berbeda nyata ditambahkan dan nilai yang diperoleh. Hasil uji MOL pada konsentrasi yang berbeda dapat dilihat pada Gambar. Dari hasil persamaan y = 0,0x + 0,1 dengan nilai sama dengan 1, diperoleh intersepsi SDo (x = 0), yaitu 0,1 I-1g/g. Nilai MOL dihitung sebesar kali SDo ialah,0 I-1g/g; nilai ini lebih rendah daripada LOOhitung (, I-1g/mL). Hal ini menunjukkan bahwa metode yang digunakan memiliki tingkat sensitivitas yang baik karena dapat mendeteksi dalam maktriks hingga konsentrasi,0 I-1g/g. Reprodusibilitas Intralab Hasil uji reprodusibilitas intralab dapat dilihat pada Tabel. Reprodusibilitas Intralab diketahui dari nilai RSD yang dihasilkan, yaitu 0,0%, nilai ini telah memenuhi batas keberterimaan menurut FDA (01), yaitu tidak lebih dari 8%. Hasil ini menunjukkan bahwa metode yang telah dilakukan memiliki nilai keterulangan yang baik pad a selang waktu tertentu. Setelah diuji T, diketahui bahwa antar kedua ulangan terse but tidak berbeda nyata. DAFTAR PUSTAKA Avalli A, Contarini G. 00. Determination of phospholipids in dairy products by SPE/HPLC/ELSD. J. Chromatogr A. 101 (1-0): [EMA] The European Agency for the Evaluation of Medical Products ICH. Topic 0B. Validation of Analytical Procedures: Methodology. [Internet] [diunduh 010 Nov ]. Tersedia pada: pport/pdfsu pport/0a.pdf. [EURACHEM] Working Group Purpose of Analytical Methods Guide to Methods Validation and [Internet] [diunduh 010 Nov ]. php/publications/guides/mv. The Fitness for -A Laboratory related Topics. Tersedia pada: FDA. 01. Guidelines for the Validation of Chemical Methods for the FDA Foods Program. [Internet] [diunduh 01 Jan 0]. Tersedia pada: fda.gov/download s/scienceresearch/fi eldscience/ucm980.pdf. Ference SA, Yoo W, Alesh I, Mahajan N, Mirowska KK, Mewada A, Kahn J, Afonso L, Williams KA, Flack JM. 01. Effect of long-term exposure to lower low-density lipoprotein cholesterol beginning early in life on the risk of coronary heart desease: A Mendelian randomization analysis. Journal of the of Cardiology. 0(): American College 1-9. Hadi A. 00. Pemahaman dan Penerapan IIIEG 10:00. Jakarta (10): Gramedia Pustaka Utama. \ Harmita. 00. Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan perhitungannya. Maj 1/ Kefarm. 1(): KESIMPULAN Hasil validasi metode analisis menggunakan HPLC-ELSD dengan matriks sampel telur adalah valid untuk konsentrasi uji S I-1g/g sampel. Metode tersebut dapat digunakan untuk anal isis rutin di laboratorium pengujian. Huber L Validation of Analytical Methods. [Internet] [diunduh 010 Okt 8]. Tersedia pada: [JECFA] Joint Expert Committee on Food Additives. 00. Combined Compendium of Food Additive Specifications Volume. Analytical Methods, Test Procedures and Laboratory Solutions Used By And Referenced in The Food Additive Specifications. '"

9 SSN 08-1 JIPI, Vol. 18 (): Rome (IT): Food and Agriculture Organization of The United Nations..etter WS A Rapid Method for Phospholipid Class Separation by HPLC using an Evaporative Light-Scattering Detector. J Liquid Chromatogr. 1(): -. in DB, Steenson DF Crude fat analysis. Dalam : Food Analysis. Ed. Ke-. SS. Nielsen (ed). Maryland (US): Aspen Publ. )sman H, Chin YK. 00. Comparative sensitivities of cholesterol analysis using GC, HPLC and spectrophotometric methods. The Malay J Anal Sci. 10(): Sullivan DM, Carpenter DE Methods of analysis for nutrition labeling. Chapter 11, AOAC Official Method 9., Cholesterol in Multicomponent Foods, him USDA Cholesterol High Avoid. [Internet] [Diunduh 011 Feb 10]. Tersedia pada: http: high_avoid. php.