PENGARUH WAKTU DAN SUHU PENYIMPANAN TERHADAP DAYA TAHAN ANTIGEN VIRUS NEWCASTLE DISEASE PRODUKSI BALAI BESAR PENELITIAN VETERINER

Transkripsi

1 PENGARUH WAKTU DAN SUHU PENYIMPANAN TERHADAP DAYA TAHAN ANTIGEN VIRUS NEWCASTLE DISEASE PRODUKSI BALAI BESAR PENELITIAN VETERINER (The Effect of Duration and Temperature of Storage on Survival of Newcastle Disease Virus Antigen Producted by Research Center for Veterinary Science) MOHAMMAD INDRO CAHYONO Balai Besar Penelitian Veteriner, Jl. R.E. Martadinata No. 30, Bogor ABSTRACT Availability of antigen for diagnostic assay is a basic need for almost every diagnostic laboratory. Indonesian Research Center for Veterinary Science (Balai Besar Penelitian Veteriner) have produced dried ND (Newcastle Disease ) antigen to perform the serologic assay for Newcastle Disease diagnostics. These antigens were preserved with 2 methods: the classical Freeze drying and Xerovac method. The dried antigens were liquefied by adding PBS (Phosphat Buffer Saline) and stored at different conditions: at room temperature, refrigerator (4 C), and freezer (-20 C). The experiment data showed that liquefied dried ND antigens stored at 4 C and -20 C temperature for 1, 7, and 14 days did not degrade the antigens titre and still have the same titre like the first stock (7 log 2). The liquefied Xerovac dried ND antigens stored at room temperature (ND-B1) are degraded by 2 log at day 7, and 1 log at day 14. The liquefied Freeze dried ND antigens stored at room temperature (ND-D1) are degraded by 1 log at day 7, and 2 log at day 14. Key Words: ND Antigen, Freeze Dry, Xerovac, Storage ABSTRAK Tersedianya antigen bagi uji diagnostik merupakan kebutuhan mendasar yang harus dimiliki oleh setiap laboratorium pengujian. Balai Besar Penelitian Veteriner, Bogor telah memproduksi antigen ND (Newcastle Disease) kering bagi keperluan diagnostik uji serologis penyakit ND. Antigen ND ini dikeringkan menggunakan 2 metode yaitu Freeze dry dan Xerovac. Produk antigen ND kering ini kemudian diencerkan dengan cairan PBS dan disimpan pada suhu ruang, suhu refrigerator (4 C), dan suhu freezer (-20 C ). Data hasil penelitian menunjukkan bahwa antigen ND kering yang telah diencerkan dan disimpan pada suhu 4 C dan -20 C serta disimpan pada hari 1, 7, dan 14 tidak mengalami penurunan kandungan titer antigen dan sama seperti kandungan titer antigen sebelum dikeringkan yaitu sebesar 7 log 2 (2 7 ). Sementara antigen ND yang dikeringkan dengan metode Xerovac dengan perlakuan sama disimpan pada suhu ruang mengalami penurunan sebesar 2 log pada hari 7, dan 1 log pada hari 14. antigen ND yang dikeringkan dengan metode Xerovac dengan perlakuan sama disimpan pada suhu ruang mengalami penurunan sebesar 1 log pada hari 7, dan 2 log pada hari 14. Kata Kunci: Antigen ND, Kering Beku, Xerovac, Titer Antigen, Penyimpanan PENDAHULUAN Newcastle Disease adalah penyakit pada unggas yang diakibatkan oleh infeksi virus Paramyxoviridae dengan genus Avulavirus. Penyakit ND (Newcastle Disease) menyebabkan kerugian yang sangat besar bagi peternak komersil dan peternak ayam kampung skala kecil (GRIMES, 2002 ). Penyakit ND yang telah meluas di hampir seluruh wilayah di Indonesia, menyebabkan kebutuhan akan uji diagnostik penyakit ND ini menjadi sangat penting. Penyakit ND dapat di deteksi keberadaan virusnya melalui uji PCR (Polymerase Chain Reaction), dan uji serologis untuk mendeteksi 786

2 antigen NDV melalui uji HA (Hemmaglutination). Uji serologis untuk mendeteksi antibodi ND adalah dengan uji HI (Hemmaglutination Inhibition), dan ELISA (Enzyme Link Immuno Sorbent Assay). Uji diagnostik yang paling banyak dilakukan di dunia adalah uji HA dan HI, dimana uji ini mampu mendeteksi respon antibodi terhadap glikoprotein virus ND (perkiraan proteksi terhadap penyakit ND) (World Organization for animal Health, 2009). Sebagian besar virus termasuk NDV (Newcastle Disease Virus) mengandung antigenik glikoprotein pada permukaan virus, yang berperan dalam interaksi antigen antibodi (ANA. et al., 2001). Uji serologis HA dan HI ini didasarkan pada prinsip kemampuan Hemaglutinasi sel darah merah dari virus ND (GRIMES, 2002), dimana keberadaan antibodi spesifik ND dalam serum sampel dideteksi lewat ikatan antigen antibodi dengan cara mencampur serum dengan antigen ND. Antigen ND merupakan komponen utama dalam pelaksanaan uji HA dan HI pada laboratorium diagnostik. Dalam menjawab kebutuhan akan antigen ND ini, Balai Besar Penelitian Veteriner melalui Unit Pelayanan Diagnostik memproduksi antigen NDV berlandaskan pada SK Mentan RI No: 456/Kpts/TN260/9/2000. Permasalahan yang muncul kemudian adalah virus ND adalah virus yang rentan terhadap suhu. Vaksin yang mengandung virus ND akan mengalami penurunan setelah disimpan pada suhu ruang, bahkan jika vaksin tersebut terekspos oleh sinar matahari secara langsung atau tersimpan pada suhu tinggi (di atas 37 C) selama beberapa jam akan mengalami kerusakan dan tidak dapat digunakan lagi (GRIMES, 2002). Laboratorium Virologi, di Balai Besar penelitian Veteriner telah memproduksi antigen ND kering yang bersifat thermostabil. Pengeringan antigen ND ini dilakukan dengan menggunakan 2 metode yaitu metode klasik Freeze dry (kering beku) dan metode Xerovac. Xerovac adalah metode pengeringan vaksin yang dikembangkan oleh E.E. Worrall pada tahun 1997 untuk mengawetkan virus rinderpest di Ethiopia, Afrika dalam rangka menanggulangi wabah (CBPP) Contagious Bovine Pleuro Pneumonia (LUBROTH et al., 2007). Pada tahun 2007 metode Xerovac ini telah diadaptasikan di Indonesia untuk mengeringkan virus Gumboro hidup dan mampu bertahan selama 6 bulan pasca pengeringan (CAHYONO, 2007). Penelitian bertujuan untuk mengetahui daya tahan antigen ND kering produk Balai Besar Penelitian Veteriner yang telah dikeringkan dengan metode Freeze dry dan Xerovac dalam berbagai macam kondisi penyimpanan selama kurun waktu 1,7, dan 14 hari. MATERI DAN METODE Penelitian ini dilaksanakan pada kurun Juni Juli 2010 di Laboratorium Virologi, Balai Besar Penelitian Veteriner, Bogor. Virus Virus yang digunakan dalam proses pembuatan antigen ini adalah virus Newcastle Disease (ND) strain RIVS2. ND RIVS2 adalah virus ND asimtomatik yang diseleksi dari virus ND galur V4 asal Australia serta digunakan dalam pengendalian penyakit ND pada ayam (SURYANA, 2007). Propagasi virus Propagasi virus ND dilakukan pada telur SPF (Spesific Pathogen Free ) berembryo yang berumur 9 hari sebanyak 0,1 cc per telur. Telur telur SPF berembryo yang telah diinokulasi ini kemudian di inkubasi menggunakan inkubator Brinsea Octagon 40 pada suhu 37 C selama 4 hari. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk memeriksa embryo dalam telur SPF yang telah diinokulasi dengan cara meneropong (Candling) dalam ruang gelap. Panen virus Telur SPF berembrio yang telah diinkubasi dikoleksi cairan alantoisnya. Selanjutnya dilakukan uji cepat (Rapid test) sebagai konfirmasi keberadaan virus ND dengan cara melihat proses aglutinasi yang ditimbulkan oleh virus ND yang berikatan dengan sel darah merah. Cairan alantois tersebut kemudian dikumpulkan dan disentrifus dengan kecepatan 2500 RPM selama 15 menit menggunakan mesin sentrifus Beckman TJ-6 Centrifuge. 787

3 Inaktivasi virus Proses inaktivasi dilakukan dengan cara menambahkan 0,1 % formalin ke dalam cairan alantois berisi virus ND. Sebelum dan setelah proses inaktivasi dilakukan uji hemaglutinasi dengan cara melakukan titrasi pada cairan allantois untuk memastikan tidak adanya perubahan titer virus pasca inaktivasi. Dilakukan juga uji keamanan (Safety test) dengan cara menginokulasikan virus ND yang telah diinaktivasi ke dalam telur SPF berembryo dan mengamati apakah masih terdapat kematian pada embryo akibat infeksi virus. Pembuatan formula TR-18 dan persiapan pengeringan Hasil inokulasi virus ND inaktif yang masih berwujud cair dicampur dengan larutan trehalosa dihidrat hingga mencapai konsentrasi akhir 2,5%, ditambahkan juga kanamycin 500 µg/ml sebagai anti bakterial. Hasil akhir pencampuran ini disebut cairan formula TR-18 yang siap dikeringkan kemudian 1 ml kedalam vial gelas steril 5 ml. Vial gelas steril yang telah diisi tersebut kemudian ditutup menggunakan Butyl rubber stopper steril dalam keadaan setengah terbuka. Semua vial yang telah terisi ditempatkan pada rak khusus dan siap untuk dikeringkan. Proses pengeringan Proses pengeringan antigen ND dikerjakan menggunakan mesin freeze dryer Labconco tipe Freezone 6 Liters Bench Top Freeze Dry Systems Serial no , dan mesin vakum merk BOC Edward Dump Type Model A Pump Serial No Selanjutnya proses pengeringan dilaksanakan memakai 2 metode yaitu metode klasik Freeze dry dan metode Xerovac. Pengeringan dengan metode Freeze dry Semua antigen cair dalam vial yang akan dikeringkan dibekukan terlebih dahulu dalam freezer bersuhu -20 C selama 24 jam. Antigen kemudian dikeringkan dengan menggunakan metode Freeze dry sesuai dengan Vaccine manual dari FAO (Food and Agricultural Organization) (MARINER, 1997). Pengeringan dengan metode Xerovac Proses pengeringan dengan metode Xerovac ini terdiri dari dua fase yaitu pengeringan fase pertama (Primary drying) dengan dehidrasi bertingkat dan dilanjutkan pengeringan fase kedua (Secondary drying), metode pengeringan dilakukan sesuai dengan metode Xerovac yang telah dikembangkan oleh E.E. Worrall (WORRAL et al., 2001). Pengujian produk akhir Produk akhir dari proses pengeringan ini berupa antigen ND kering dalam vial gelas steril ukuran 5 ml. Pengujian dan perbandingan titer antigen ND sebelum dan setelah proses pengeringan dilakukan menggunakan metode HA (Hemaglutinasi). Uji hemaglutinasi ini dilakukan di ruang isolasi virus unggas (ruang 21), Laboratorium Virologi, Balai Besar Penelitian Veteriner sesuai dengan metode pengujian titer virus ND pada manual OIE (WORLD ORGANIZATION OF ANIMAL HEALTH, 2009). Produk yang akan diuji diberi kode sebagai berikut: 1. ND-A: Antigen ND sebelum dikeringkan (stock awal) 2. ND-B: Antigen ND pascapengeringan menggunakan metode Xerovac 3. ND-C: Antigen ND pascapengeringan dan telah dibekukan selama 24 jam 4. ND-D: Antigen ND pascapembekuan dan dikeringkan menggunakan metode Freeze dry Pengujian daya tahan produk antigen Produk antigen yang telah diencerkan dengan cairan PBS diberi kode dan disimpan kembali pada 3 kondisi yang berbeda untuk menguji daya tahan antigen pada berbagai kondisi penyimpanan. 788

4 Kode antigen tersebut adalah sebagai berikut: 1. ND-B1: Antigen ND Xerovac yang telah diencerkan dan disimpan pada suhu ruang 2. ND-B2: Antigen ND Xerovac yang telah diencerkan dan disimpan pada suhu 4ºC 3. ND-B3: Antigen ND Xerovac yang telah diencerkan dan disimpan pada suhu -20ºC 4. ND-D1: Antigen ND Freeze dry yang telah diencerkan dan disimpan pada suhu ruang 5. ND-D2: Antigen ND Freeze dry yang telah diencerkan dan disimpan pada suhu 4ºC 6. ND-D3: Antigen ND Freeze dry yang telah diencerkan dan disimpan pada suhu - 20ºC Seluruh antigen yang disimpan pada berbagai kondisi tersebut kemudian diuji kembali kandungan titer antigeniknya dengan memakai uji HA ( Hemaglutinasi ) pada 1 hari, 7 hari, dan 14 hari pascapengenceran dengan menggunakan 2 kali pengulangan. HASIL DAN PEMBAHASAN Dari pengujian pertama mengenai produk akhir proses pengeringan dengan metode Freeze dry dan Xerovac menggunakan uji HA diperoleh hasil seperti pada Tabel 1. Data yang ditunjukkan pada Tabel 1 mengenai hasil titer terhadap keseluruhan produk antigen ND menunjukkan bahwa antigen ND awal memiliki titer sebesar 7 log 2 (2 7 ) sejak pencampuran cairan alantois berisi virus ND inaktif dengan formula TR-17a. Setelah antigen ND melewati proses pengeringan baik menggunakan metode Xerovac (ND-B) maupun metode klasik Freeze dry (ND-D) titer antigen masih tetap sama dengan stock awal sebesar 7 log 2 (2 7 ) dan tidak mengalami penurunan, demikian juga saat antigen mengalami proses pembekuan selama 24 jam (ND-C). Penerapan pembuatan formulasi TR-18 dengan menambahkan trehalosa dihidrat mampu menstabilkan dan melindungi antigen ND dari kristalisasi saat proses pengeringan dimulai. Trehalosa adalah glukosa disakarida yang efektif untuk melindungi protein sepanjang periode pembekuan dan pengeringan pada proses Lyophilization dan mencegah kerusakan yang mampu merubah membran sel pada saat pendinginan. Sepanjang proses Lyophilization, trehalosa akan membentuk semacam lapisan kaca padat yang mampu melindungi sel, enzim, dan protein lain dari kerusakan yang diakibatkan oleh pembentukan es (PABLO, 2001). Trehalosa dihidrat akan melindungi organisme-organisme hidup dari berbagai macam tekanan seperti kekeringan, pembekuan, dan tekanan osmotik dengan cara menstabilkan membran dan komponenkomponen makromolekuler saat berada pada kondisi lingkungan ekstrim (HIGASHIYAMA, 2002). Proses Freeze drying sebagai metode preservasi material biologik memiliki banyak keuntungan, tetapi proses pembekuan dan pengeringan merupakan faktor stress utama bagi material biologik yang akan dipreservasi. Proses pembekuan cairan akan menyebabkan terjadinya kristalisasi yang mampu merusak material cair (WORRAL et al., 2001 ). Dalam lingkungan yang mengalami dehidrasi, trehalosa akan mengering membentuk gelas transparan dan hasil akhir dari proses vitrifikasi Tabel 1. Titer antigen ND sebelum dan setelah proses pengeringan Kode produk antigen Titer antigen dalam log2 (HAU) ND-A 7 7 ND-B 7 7 ND-C 7 7 ND-D 7 7 ND-A: Antigen ND sebelum dikeringkan (stock awal) ND-B: Antigen ND pascapengeringan menggunakan metode Xerovac ND-C: Antigen ND pascapengeringan dan telah dibekukan selama 24 jam ND-D: Antigen ND pascapembekuan dan dikeringkan menggunakan metode Freeze dry (perubahan material dari cair menjadi kristal/gelas) ini akan mencegah hilangnya cairan sehingga mampu mempertahankan selsel dari tekanan yang ditimbulkan (LEVINE et al., 1992 ). Pada percobaan selanjutnya, dicoba untuk mensimulasikan kondisi penyimpanan antigen yang mungkin dilakukan di laboratorium 789

5 diagnostik. Antigen ND produk dari Balai Besar Penelitian Veteriner adalah antigen yang telah dikeringkan, untuk mengencerkan antigen ini ditambahkan cairan PBS sebanyak 1 ml per vial produk antigen kering. Antigen ND kering ini cukup untuk pemakaian > 100 uji diagnostik ND. Untuk menentukan kondisi penyimpanan yang paling sesuai bagi antigen ND kering yang telah diencerkan, maka dibuat 3 perlakuan penyimpanan, yaitu pada suhu ruang, suhu refrigerator (4 C), dan pada suhu freezer (-20 C). Serta untuk menentukan efektifitas metode pengeringan kami melakukan 2 metode pengeringan yaitu metode Freeze dry dan Xerovac. Untuk melihat daya tahan antigen kami melakukan pengujian untuk seluruh panel pada hari 1, 7, dan 14. Hasil pengujian terhadap seluruh indikator tampak pada Tabel 2. Dari Tabel dan ND-D1 memiliki titer antigenik sebesar 7 log 2 2 diperoleh data bahwa antigen ND-B1 (2 7 ) sebelum melewati proses pengeringan. Setelah antigen ND-B1 dikeringkan menggunakan metode Xerovac dan diencerkan dengan cairan PBS dan disimpan selama 1 hari titer antigen masih menunjukkan angka 7 log 2 (2 7 ) serta belum mengalami perubahan. Antigen ND-D1 yang dikeringkan menggunakan metode Freeze dry dan diencerkan dengan cairan PBS setelah disimpan selama 1 hari titer antigen juga masih menunjukkan angka 7 log 2 dan belum mengalami perubahan. Antigen ND-B1 dan ND-D1 kemudian disimpan pada suhu ruang untuk diuji kembali titer antigennya pada hari 7 dan 14. Pengujian titer untuk antigen ND-B1 yang dikeringkan dengan metode Xerovac pada hari 7 dan 14 secara berturut-turut menunjukkan adanya perubahan titer antigen menjadi 5 log 2 (2 5 ) dan 4 log 2 (2 4 ). Jika dibandingkan dengan titer awal antigen ND-B1 mengalami penurunan sebesar 2 log dari 7 log 2 (2 7 ) menjadi 5 log 2 (2 5 ) pada hari ke 7, dan penurunan sebesar 1 log dari 5 log 2 (2 5 ) menjadi 4 log 2 (2 4 ) pada hari 14. Pengujian titer untuk antigen ND-D1 yang dikeringkan dengan metode Freeze dry pada hari 7 dan 14 secara berturut-turut menunjukkan adanya perubahan titer antigen menjadi 6 log 2 (2 6 ) dan 4 log 2 (2 4 ). Jika dibandingkan dengan titer awal antigen ND-B1 mengalami penurunan sebesar 1 log dari 7 log2 (2 7 ) menjadi 6 log 2 (2 6 ) pada hari ke 7, dan penurunan sebesar 1 log dari 5 log 2 (2 5 ) menjadi 4 log 2 (2 4 ) pada hari 14. Tabel 2. Titer antigen ND kering pascapengenceran pada hari 1, 7, dan 14 Kode produk antigen Titer antigen sebelum proses pengeringan dalam log 2 Titer antigen kering pascapengenceran dalam log 2 (HAU) (HAU) Hari 1 Hari 7 Hari 14 ND-B ND-B ND-B ND-D ND-D ND-D Antigen ND Xerovac yang telah diencerkan dan disimpan pada suhu ruang ND-B2: Antigen ND Xerovac yang telah diencerkan dan disimpan pada suhu 4 C ND-B3: Antigen ND Xerovac yang telah diencerkan dan disimpan pada suhu -20 C ND-D1: Antigen ND Freeze dry yang telah diencerkan dan disimpan pada suhu ruang ND-D2: Antigen ND Freeze dry yang telah diencerkan dan disimpan pada suhu 4 C ND-D3: Antigen ND Freeze dry yang telah diencerkan dan disimpan pada suhu -20 C 790

6 Dari Tabel 2 diperoleh data bahwa antigen ND yang disimpan pada suhu 4 C (suhu refrigerator) masih memiliki titer antigen yang stabil dan tidak mengalami penurunan baik pada antigen sebelum melewati proses pengeringan, maupun antigen kering pasca Xerovac (ND-B2 ) dan antigen kering pasca Freeze dry (ND-D2) yang telah diencerkan menggunakan cairan PBS. Antigen yang disimpan pada suhu 4 C tetap bersifat stabil dengan titer 7 log 2 (2 7 ) saat diuji kembali pada hari 7 dan 14 menggunakan uji HA. Tabel 2 juga menunjukan tidak terjadinya penurunan titer pada antigen kering pasca Xerovac (ND-B3) dan antigen kering pasca Freeze dry (ND-D3) yang telah diencerkan menggunakan cairan PBS dan disimpan kembali pada suhu -20 C (suhu freezer). Antigen ND-B3 dan ND-D3 pasca pengenceran yang telah diuji titernya lewat uji HA segera dimasukkan ke dalam freezer untuk dibekukan, pada hari 7 antigen tersebut dicairkan untuk kemudian diuji kembali titernya menggunakan uji HA. Perlakuan serupa juga dilakukan untuk antigen ND-B3 dan ND-D3 pada hari 14. Antigen ND-B3 dan ND-D3 tetap menunjukkan titer yang stabil sebesar 7 log 2 (2 7 ) baik sebelum dikeringkan maupun setelah diencerkan dengan cairan PBS pada hari 1, 7, dan 14. Dari Tabel 2 diperoleh data bahwa produk antigen ND kering yang telah diencerkan dengan cairan PBS masih bersifat stabil dan memiliki titer yang sama seperti antigen stock awal yaitu sebesar 7 log 2 (2 7 ) saat antigen tersebut disimpan pada suhu 4 C dan -20 C pada hari 1, 7, da 14. Titer antigen juga bersifat stabil baik saat antigen dikeringkan memakai metode Freeze dry maupun metode Xerovac. Pada Tabel 2 antigen ND kering yang telah diencerkan dengan cairan PBS mengalami degradasi pada penyimpanan dengan suhu ruang. Pada hari 1 penyimpanan tidak terjadi penurunan titer antigen. Pada penyimpanan hari 7 di suhu ruang, titer antigen mengalami penurunan baik pada antigen ND yang dikeringkan memakai metode Freeze dry maupu metode Xerovac. Pada antigen ND yang dikeringkan dengan metode Xerovac (ND-B1) terjadi penurunan sebesar 2 log dan penurunan sebesar 1 log pada hari 14. Sementara pada antigen ND yang dikeringkan dengan metode Freeze dry (ND-D1) penurunan pada hari 7 penurunan terjadi sebesar 1 log, dan pada hari 14 juga terjadi penurunan sebesar 2 log. Penurunan titer antigen yang lebih besar pada ND-B1 dibandingkan dengan ND-D1 diakibatkan karena struktur cairan antigen lebih labil, hal ini terjadi karena saat proses dehidrasi awal dimulai (Primary drying ) pada metode Xerovac, cairan antigen belum berada dalam kondisi beku sehingga proses penarikan udara awal akan mengaduk cairan antigen dalam vial. Sementara pada proses pengeringan dengan metode Freeze drying, cairan antigen berada dalam keadaan beku saat proses dehidrasi awal terjadi sehingga komponenkomponen cairan relatif lebih stabil (WORRALL et al., 2001). KESIMPULAN Pengeringan antigen ND (Newcastle Disease) yang ditambah dengan formulasi TR- 18 baik dengan metode Freeze dry maupun metode Xerovac mampu menghasilkan produk antigen kering yang bersifat stabil dan tidak mengalami penurunan titer karena formulasi TR-18 mampu melindungi antigen dari degradasi akibat penurunan suhu dan proses pengeringan. Produk antigen hasil pengeringan yang diencerkan menggunakan cairan PBS, dan disimpan pada suhu 4 C (refrigerator) dan pada suhu -20 C (freezer) mampu mempertahankan stabilitas antigen dan tidak mengalami degradasi selama 14 hari (2 minggu). Pada antigen ND kering yang diencerkan dengan cairan PBS dan disimpan pada suhu ruang selama 2 minggu mengalami penurunan titer antigen sebesar 3 log baik pada antigen ND yang dikeringkan menggunakan metode Freeze dry maupun Xerovac. UCAPAN TERIMA KASIH Terima kasih yang sebesar-besarnya penulis tujukan kepada Dr. drh. Lies Parede, MSc, Ph.D; atas bimbingan, Kusnaedi, Agus Winarsongko dan Jeffrey Mariger atas bimbingannya dan kerjasamanya dalam menyelesaikan penelitian ini. 791

7 DAFTAR PUSTAKA ANA SAGRERA, C., J.M. COBALEDA, G.D.E. BUITRAGO, A.G. SASTRE and E. VILLAR Glycoconjugate J. 18: CAHYONO, M.I Adaptasi Metode Xerovac untuk Preservasi Virus Gumboro Hidup di Indonesia (Unpublished). CAMILO, C., S. SEN, M. THANGAVELU, S. PINDER and B. ROSER Extraordinary Stability of Enzymes Dried in Trehalose: Simplified Molecular Biology. Nature Biotechnol. 10, GRIMES, S.E A Basic Laboratory Manual for the Small Scale Production and Testing of 1 2 Newcastle Disease Vaccine. FAO Regional Office for Asia and the Pacific. HIGASHIYAMA, T Novel functions and applications of trehalose. Pure Appl. Chem. 74 (7): LUBROTH, J.M.M. RWEYEMAMMU, G. VILJOEN, A. DIALLO, B. DUNGU and W. AMANFU Veterinary Vaccines and Their Use in Developing Country. Rev. Sci. Technol. 26(1): MARINER The Use of Lyophilization in the Manufacture of Vaccines. Vaccine Manual, The Production and Quality Control of Veterinary Vaccines for Use in Developing Countries. Food and Agricultural Organization of the United Nations, Rome. PABLO, J From Modelling to Commercialization: Improving the Freeze Drying Proccess. Department of Chemical and Biological Engineering. University of Wisconsin, Madison. SURYANA, A Dukungan Teknologi Penyediaan Produk Pangan Peternakan Bermutu, Halal, dan Aman. (4 April 2010) WORLD ORGANIZATION for ANIMAL HEALTH Newcastle Disease: Aetiology, Diagnosis, Prevention, and Control References, OIE Technical Disease Cards. OIE Scientific and Technical Department, Thailand WORRAL, E., J.K. LITAMOI, B. SECK and A. AYTLET Xerovac: An ultrarapid method for the dehydration and preservation of live attenuated rinderpest and peste des petit ruminants vaccine, Vaccine 19(7 8):