RINGKASAN PENDAHULUAN

Transkripsi

1 TEKNIK UJI HEMAGLUTINATION INHIBITION UNTUK MENGUKUR TINGKAT KEKEBALAN TERHADAP NEWCASTLE DISEASE DAN EGG DROP SYNDROME, 76 KUSMAEDI Balai Penelitian Veteriner, Jalan R.E. Martadinata 30 Bogor, RINGKASAN Salah satu cara untuk mengukur tingkat kekebalan (serologi) yang digunakan di Virologi, Balai Penelitian Veteriner dalam mendukung unit diagnostik dan, penelitian ialah dengan metode HI (Hemaglutination Inhibition) terhadap sera Newcastle Disease (ND) dan Egg Drop Syndrome'76 (EDS). Sampel berupa darah yang sudah membeku atau serum yang dikirim oleh petani petemak atau penelitian, diproses, dipindahkan kedalam plat-mikro 50 pl/sampel/satu uji. Pengerjaan uji HI membutuhkan waktu (dapat diselesaikan) ± 3 jam untuk pengerjaan 100 sampel. Prinsip dan cara kerja uji HI untuk ND dan EDS dijabarkan dalam tulisan ini. Kata kunci : Hemaglutination Inhibition (HI), Newcastle Disease (ND), Egg Drop Syndrome (EDS) PENDAHULUAN Penyakit Tetelo atau Newcastle Disease (ND) yang disebabkan oleh virus Newcastle Disease (NDV) pertamakali ditemukan oleh Doyle pada tahun 1927 di Newcastle, Inggris (DOYLE, 1927). Di Indonesia, virus ND ditemukan oleh Kraneveld pada bulan maret 1926 (KRANEVELD, 1926). Penyakit ND adalah penyakit akut yang menyerang ayam serta unggas lainnya, ada 3 patotype ND yaitu type syaraf (otak), pernapasan dan pencernaan. Virus yang ada di Indonesia yaitu type pencernaan yang ganas, merupakan virus yang paling ganas di dunia dengan angka morbiditas serta mortalitas bisa mencapai 100% (KALIANNAN et al., 1975 ; MANTONE et al., 1976). Untuk menanggulangi hal tersebut diatas, vaksinasi merupakan program yang sangat tepat dilakukan oleh petani petemak (BENEDEK DAN TOTH, 1950). Selain penyakit ND pada unggas, penyakit EDS (Egg Drop Syndrome'76) yang disebabkan oleh virus grup I Adeno (BOUGH at al, 1982 ) merupakan penyakit yang menyebabkan kerugian ekonomi, karena pencrunan produksi pada ayam petelur. Pencegahan terhadap penyakit EDS dilakukan dengan vaksinasi, terutama pada ayam dara (pullet) menjelang produksi. Ada beberapa cara untuk mengetahui tingkat kekebalan atau titer Ab terhadap penyakit ND dan EDS. Salah satu cara untuk 224

2 mengukur tingkat kekebalan secara serologi dan juga keberhasilan dari pemakaian dan evaluasi program vaksinasi, dikerjakan secara uji Hemaglutination Inhibition (HI). Pada prinsipnya metode HI ini merupakan reaksi ikatan Ab yang terkandung dalam serum yang diperiksa dengan jumlah antigen ND yang digunakan sebanyak 4 HAU (hemaglutination unit). Reaksi kandungan Ab yang terkecil diencerkan (log 2) dan mampu menghambat aglutinasi Butir Darah Merah ayam (BDM) 0.5% sesudah beberapa waktu inkubasi dinyatakan sebagai titer kandungan Ab pada sampel yang diperiksa. Uji HI dapat dikedakan dengan cara konvensional atau dengan menggunakan mesin otomatis, seperti Calcano autotitre MK IV atau Titertek machines (BREADS DAN WILKES, 1973). Penggunaan alat otomatis, banyak memberikan manfaat, dikarenakan sampel yang dikerjakan akan lebih banyak dan hasil lebih baik, serta menghindari kesalahan, dikarenakan tenaga yang mengerjakan mengalami kelelahan. Pengedaan uji HI di Virologi Balitvet membutuhkan waktu (dapat diselesaikan) ± 3 jam untuk pengerjaan 100 sampel termasuk pemakaaan hasil. Prinsip dan cara kerja uji HI untuk ND dan EDS dijabarkan dalam tulisan ini. TEKNIK PENGUJIAN Materi Serum Serum berasal dari petani peternak yang masuk ke Unit Diagnostik Balitvet dari berbagai lokasi atau serum-serum penelitian di Balai Penelitian Veteriner. Pada daerah pembuluh darah ayam yang akan diambil darahnya, terlebih dahulu harus diusap kapas beralkohol 70% untuk menghindari kontaminasi dan membasahi bulu-bulu yang menghalangi area vena. Pada ayam dewasa darah biasanya diambil dari vena sayap (axylaris) atau vena leher (jugularis), dengan menggunakan spuit 3 cc, ukuran jarum 23G. Dan untuk ayam kecil umur 1 hari atau DOC (kutuk) diambil dari intra cardial menggunakan spuit l cc dengan ukuran jarum 27G. Dalam pengambilan darah tersebut harus disisakan ruang kosong pada spuit, untuk memungkinkan serum terpisah dari darah. Setelah darah tersebut beku, lalu disimpan disuhu ruangan atau di kulkas 4 C semalam, setelah serum keluar kemudian dipisahkan dan disimpan di 100[1, selanjutnya diinaktivasi pada suhu 56 C selama 30 menit. Disamping itu disisakan juga serum standar positip yang telah diketahui titernya dan serum standar negatip yang tidak mengdunng Ab terhadap ND dan EDS. Butir Darah Merah Ayam (BDM) 0,5% BDM diambil dari ayam yang tidak mengandung Ab terhadap ND maupun virus lain. Untuk mencegah penggumpalan darah, maka perlu penambahan antikoagulan (anti pembeku darah) larutan Alsever. Biasanya 225

3 darah diambil dari vena axylaris (lihat gambar 1) atau jugularis dengan perbandingan darah yang akan diambil sama banyak dengan larutan Alsever di dalam spuit tersebut yaitu 1 :1, setelah didapat lalu digoyang perlahan-lahan agar darah tersebut tidak beku. Darah bercampur larutan Alsever tersebut dipindahkan kedalam tabung sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 1500 rotasi per menit (rpm) selama 10 menit, setelah itu supernatan dan butir-butir darah putih dibuang, lalu endapan ditambahkan PBS (bebas Ca + Mg, ph 7,2) sebanyak 10 kali volume BDM dan diaduk secara perlahan sampai merata, lalu disentrifuge lagi 1500 rpm selamal0 menit. Pencucian ini dilarukan paling sedikit 3 kali dan pada pemutaran yang terakhir supernatan dan butir-butir darah putih dibuang. Endapan BDM dilarutkan dengan PBS steril, schingga diperoleh konsentrasi kira-kira 20%. BDM yang disimpan sebagai stock dengan konsentrasi 10%, dihitung kadar Packed Cell Volume (PCV), dengan cars larutan BDM tadi dimasukkan kedalam pipa hematokrit, lalu disentrifus, dan akan terbaca kandungan BDM sebenarnya untuk menentukan pengenceran suspensi tersebut menjadi BDM 10%. Gambar 1. Pengambilan darah dari vena axylaris PBS - Ca+Mg Free (Phosphate Buffer Saline bebas Ca+Mg) _ larutan penyanggah PBS Bahan yang dibutuhkan NaCI 8,0 gram, KHZPO4 0,2 gram, Na2HP0 4 1,15 gram, KCl 0,2 gram, dilarutkan dengan air deionisasi sampai dengan

4 ml dan diukur ph 7,2 kemudian simpan di dalam botol tahan 250 cc/botol dan disteril secara autoclave basah pada suhu 121 C selama 15 menit. Larutan Alsever (antikoagulan) Bahan yang dibutuhkan Dektrose (C6HI206) 20,5 gram, Sodium citrat (C6H5 Na307-2H20) 8,0 gram, Citrit acid (C6Hg07-H20) 0,55 gram, Natrium Chlorida (NaCI) 4,20 gram, dilarutkan dengan air deionisasi sampai dengan 1000 ml dan diukur ph 6,1, kemudian disimpan didalam botol tahan 5 ml/botol dan di steril secara autoclave basah pada suhu 115 C selama 15 menit. Antigen ND atau EDS 4 HAU Stok Antigen (Ag) diperbanyak dengan cara virus disuntikkan pada telur tertunas Specific Pathogen Free (SPF) atau telur bebas penyakit patogen umur 9 sampai 11 hari melalui ruang allantois. Setelah disuntikkan, telur tersebut diinkubasi pada suhu 37 C dan harus diamati selama 4 hari, apabila kematian embrio telur kurang dari 24 jam, kemungkinan terjadi kontaminasi atau trauma telur tersebut dibuang. Dan bila kematian telur lebih dari 24 jam cairan allantois yang akan dipanen, harus di Rapid Test (Uji aglutinasi cepat) terlebih dahulu untuk mengetahui apakah allantois tersebut mengdanung virus ND/EDS. Virus ND atau EDS kemudian dipanen dari allantois telur yang positip di uji aglutinasi cepat dengan cara meneteskan virus ND atau EDS'76 50 ~tl pada porselin putih, tambahkan BDM 50% sebanyak 50 lt,l kemudian diaduk dan digoyang perlahan-lahan. Apabila terjadi penggumpalan, maka cairan allantois tersebut dinyatakan positip mengandung virus ND atau EDS. A D C D E F G H Keterangan : lajur A dan B = 27 HAU laiur C dan D = 2 2 HAU lajur E dan G = = 2 1 HAU lajur H = kontrol negatip " = BDM mengendap Gambar 2. Contoh penghitungan jumlah pelarut untuk membuat Ag 4 HAU Stok Ag virus ND/EDS 4 HAU disiapkan dengan prosedur uji HA, caranya sebagai berikut : pada semua lubang mikroplat dasar V, diisi dengan larutan penyanggah PBS bebas ion Ca+Mg sebanyak 25 Etl. Pada lubang pertama, tambahkan virus ND atau EDS stok sebanyak 25 pl, kemudian 227

5 Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 200/ diencerkan dengan menggunakan mikropipet, dengan cara menghisap dan menekannya secara perlahan, lalu dipindahkan kelubang selanjutnya sampai pada lubang 12 (pengenceran berdasarkan kelipatan 2). Ditambahkan PBS pada semua lubang yang berisi Ag yang telah diencerkan, tambahkan BDM 0,5% sebanyak lubang, selanjutnya digoyang dengan alat penggoyang plate (mikroshaker) selama 1 menit, lalu didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar sampai terlihat hasil. Hasil bisa dibaca apabila pada kontrol negatif (lubang tanpa Ag virus) BDM telah terikat mengendap dan pada kontrol positif (lubang berisi Ag virus) telah menunjukkan aglutinasi yang sempurna. Titer HA Ag ND dan EDS dinyatakan dalam log2. Misalnya aglutinasi yang sempurna pada lubang ke 7 (27) berarti titer Ag stok 128 HA, sedangkan standar Ag yang dipakai 4 HAU (lihat gambar 2), maka cara penghitungan yaitu 128 : 4 = 32 (atau 27 : 22 = 25), sehingga untuk membuat Ag 4 HAU yaitu 1 ml Ag stok ditambah 31 ml PBS steril sebagai pelarut atau pengencer. Alat Spuit 3 cc, spuit 10 cc, tabung sentrifus, sentrifus dengan kecepatan sampai dengan 3000 rpm, waterbath, mikrotip p.l, single mikropipet pl, multichannel pipet pd, mikroplat 96 lubang dasar V, trops, mikroshaker, kulkas 4 C, tabung kapiler hematokrit, karet penghisap (Bulb) pipet, pipet 10 ml, ember untuk penampungan barang yang sudah dipakai, semua peralatan sebaiknya di steril terlebih dahulu. Cara kerja metode HI Pada prinsipnya serum yang akan diuji diencerkan dengan menggunakan kelipatan 2(dua) yaitu 2, 4, 8, 16, 32, 64 sampai pengenceran 2048, kemudian serum yang sudah diencerkan tersebut diberi larutan Ag 4 HAU dan setelah didiamkan beberapa saat diberi BDM 0,5%, kemudian didiamkan lagi beberapa saat sampai terjadi adanya aglutinasi (pengendapan). Pada serum ayam yang mengandung kekebalan, akan terjadi aglutinasi dan sebaliknya bila tidak terjadi aglutinasi dinyatakan tidak mengandung kekebalan atau Ab. Isi semua lubang mikroplat dengan larutan penyanggah PBS bebas Ca+Mg 25pl, masukkan serum yang sudah diinaktifasi (serum yang akan diuji) pada lubang di baris ke 1A-F sebanyak 25 p.l, dan lubang 1G untuk kontrol serum negatif Ab dan 1H untuk kontrol serum positip Ab. Kemudian diaduk memakai mikropipet, dengan cara menghisap dan menekannya secara perlahan. Kemudian dipindahkan pada lubang ke 2 dan diaduk seperti diatas, demikian seterusnya sampai pada lubang terakhir baris ke 11. Sehingga diperoleh pengenceran serum kelipatan 2 (1092). Pada setiap lubang pengenceran ditambahkan 25 VI Ag ND atau EDS'76 4 HAU, selanjutnya digoyang selama 1 menit, lalu diamkan selama 30 menit pada suhu ruangan. Kemudian ditambahkan 50 VI BDM ayam 0,5% pada semua lubang, digoyang selama 1 menit, dan diamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Pembacaan dilakukan setelah lubang kontrol positip (menggunakan standar serum positip yang telah 228

6 Temu Teknis FungsionalNon Peneliti 2001 diketahui titernya) atau lubang kontrol negatip yang berisi PBS dan BDM ayam, telah mengendap lihat Gambar 3). A B C - D E F G H ~ - Keterangan : lajur A lajur B lajur C lajur D lajur E lajur F lajur G lajur H 2 s 2' 2 iu 2 1() 2 w 2 i kontrol serum positip Ab ND = 2' kontrol serum negatip Ab ND Gambar 3. Contoh cara penentuan nilai HI HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil pengerjaan uji HI yang dilakukan di Virologi, Balitvet disajikan pada Tabel 1 dan 2. Hasil ini ditabulasi dari sampel yang diperiksa mulai Januari sampai dengan Mei Hasil ini menunjukkan bahwa uji HI masih sangat dibutuhkan oleh peternak untuk mengevaluasi program vaksinasi mereka maupun hanya untuk melihat titer kekebalan terhadap ND dan EDS'76. Asal serum yang diperiksa dari berbagai lokasi peternakan di Jawa Barat (lihat Tabel 1 dan 2), tetapi kebanyakan poultry farm/distributor vaksin yang mengirimkan serum yang diperiksa sebagai service atau kompensasi puma jual vaksin. Jumlah serum yang dikirim oleh peternak ke Virologi, terkadang tidak semua dapat diperiksa, dikarenakan serum tersebut hemolisis. Menurut ALLAN (1978), pembacaan hasil secara garis besar bisa sebagai berikut : pada uji tantang ND, ayam yang mengandung Ab <22 mengakibatkan kematian 100%. Titer Ab antara 22-2 angka kematian mencapai 10%, titer Ab angka kematian 0%. Titer Ab angka kematian 0%, tetapi pada ayam petelur menyebabkan penurunan produksi. Titer Ab 2 9-2" angka kematian 0%, produksi telur tidak turun dan angka kesembuhan mencapai titer Ab Titer Ab ayam akan bebas dari wabah ND dan tidak akan ada penurunan produksi telur lebih dari 6 bulan. Ada beberapa cara lain yang dipakai pada uji serologi misalnya Agar Gel Presipitasi (AGP), Enzime linked Immuno Absorbent Assay (ELISA), maupun Serum Netralisasi Test (SNT) seringkah dipakai sebagai pembdaning 229

7 dengan uji HI. Uji HI digunakan hanya pada virus-virus yang mempunyai sisi Ag yang dapat berikatan dengan BDM yaitu ND, EDS'76 dan 113. Oleh sebab itu cara uji HI dimodifikasi terlebih dahulu misalnya sisi Ag atau Ab dimodifikasi terlebih dahulu sehingga dapat terjadi reaksi aglutinasi, misalnya pada virus Infectious Bronchitis (IB). Pada prinsipnya metode HI ini merupakan reaksi ikatan Ab yang terkdanung dalam serum yang diperiksa dengan jumlah Ag ND atau EDS'76 yang digunakan sebanyak 4 HAU. Reaksi kandungan Ab yang terkecil diencerkan (log z ) dan mampu menghambat aglutinasi BDM ayam 0,5 sesudah beberapa waktu inkubasi, dinyatakan sebagai titer Ab pada sampel yang diperiksa. Pemakaian Ag yang tidak dimurnikan masih dipakai oleh banyak laboratorium, namun penggunaan Ag yang sudah dikonsentrasi dengan polyethylenglycol (PEG), mutu Ag lebih baik dan relatif stabil (BEARD et al.1975). Adanya virus ND dapat dideteksi dengan uji Hemaglutinasi dan Hemaglutinasi Inhibisi (ALLAN et al., 1978). Pengebalan terhadap penyakit ND tidak cukup hanya dilakukan satu kali dan kemudian dilupakan, karena titer kekebalan akan menurun bila ayam tidak di-booster (vaksin ulang) (RONOHARJO, 1995). Tabel 1. Jumlah sampel sera yang diuji HI terhadap ND dan EDS'76 (Januari Mei 2001) Bulan Pengirim ND EDS Januari Pebruari Maret April Mei Total Tabel2. Contoh hasil serologi sampel lapangan yang diperiksa terhadap ND dan EDS Petemakm Jabar Jmis ayam Umur Status vaksinai E Titer (log 2). Botabek Broiler I hr Bolabek Broiler 19 hr 2 X Bota e Broier 2I"r 2X I I 3 I T I 2-- T l- I. I Bol' e Brut er III M00000MMM 000 Botabek Layer ~~ ~000 Bota e Layer Bot e Layer 40mg SX ,8 230

8 Temu Teknis Fungsional Non Penelid 2001 KESIMPULAN Uji Haemaglutination Inhibition (HI) merupakan uji deteksi Ab yang diperlukan oleh petani peternak, karena memiliki beberapa keunggulan yaitu biaya relatif murah, waktu pengerjaan uji lebih cepat (± 3 jam untuk 100 sampel), dengan peralatan lebih sederhana, dapat menggambarkan titer kekebalan flok ayam, dibandingkan dengan uji serologi lainnya seperti : Elisa, AGP dan SN Test yang memerlukan biaya lebih mahal dan waktu lebih lama. Pelaksanaan hasil pengamatan program vaksinasi dilapangan harus dilakukan karena akan sangat membantu petani peternak untuk mengantisipasi wabah penyakit ND dan EDS'76 pada ayam petelur. UCAPAN TERIMAKASIH Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Ibu Drh. Lies P., MSc. PhD., atas bantuan dan saran dalam penulisan makalah ini. DAFTAR BACAAN ALLAN. W.H., J.H. LANCASTER AND B. TOTH Newcastle Disease Vaccines. Their Production DAN Use. FAO of the United Nations, Rome. BENEDEK, L. AND B. TOTH Control of Newcastle disease with compulsory vaccination. Mag. Allator. Lapja.,5 : BOUGHT, R.E. ; M.S. COLLINS, AND D. SPACKMAN Isolahon hemaglutinating adeno virus from commercial ducks. Vet. Rec 110 ; DOYLE, T.M A hitherto unrecorded disease of fowls due to a filterpassing virus. J. comp. Path.,40: KALIANNAN, K., SEAWRIGHT, G.L. AND DERBYSHIRE, J.B Adequacy of comercial Lentogenic vaccines against Canadian strains of viscerotrofic Newcastle disease virus Canad. J. comp. Med., 39(2): KRANEVELD, F.C A Poultry disease in the Dutch East Indies.Ned. Ind. B1. Diergeneesk.,38 : MARTONE, F., P. P. BONADUCE, E. BIONDI AND P. STRIGLIONI. Imunological reseach into Newcastle disease. 2. Resistence of fowls immunized with attenuated La Sota vaccine to newly isolated strains. Clinica Veterinaria, 99(10):

9 Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 200/ RONOHARDJO, P Pengendalian Newcastle Disease pada ayam buras (Makalah dipresentasikan pada pertemuan teknis PPS se DKI Jakarta, 4 Januari 1995).