PERLAKUAN STERILISASI EKSPLAN ANGGREK KUPING GAJAH (Bulbophyllum beccarii Rchb.f) DALAM KULTUR IN VITRO IWAN GUNAWAN

Transkripsi

1 PERLAKUAN STERILISASI EKSPLAN ANGGREK KUPING GAJAH (Bulbophyllum beccarii Rchb.f) DALAM KULTUR IN VITRO IWAN GUNAWAN DEPARTEMEN KONSERVASI SUMBERDAYA HUTAN DAN EKOWISATA FAKULTAS KEHUTANAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007

2 RINGKASAN IWAN GUNAWAN. Perlakuan Sterilisasi Eksplan Anggrek Kuping Gajah (Bulbophyllum beccarii Rchb.f) dalam Kultur In vitro. Dibimbing oleh EDHI SANDRA dan AGUS HIKMAT. Kerusakan hutan di Indonesia yang sampai saat ini masih banyak terjadi, akan mengancam kelestarian anggrek alam yang ada. Apabila hal ini terus dibiarkan, maka tidak mustahil anggrek alam Indonesia lambat laun akan punah. Salah satu alternatif untuk melestarikan keanekaragaman anggrek alam adalah melakukan perbanyakan melalui kultur jaringan. Dengan kultur jaringan, dapat melakukan berbagai hal yang berkaitan dengan pelestarian anggrek yang tidak dapat dilakukan secara konvensional. Tahap awal dalam keberhasilan kegiatan kultur jaringan adalah sterilisasi eksplan. Apabila kegiatan sterilisasi ini tidak berhasil, maka kegiatan selanjutnya tidak bermanfaat. Kesulitan pelaksanaan sterilisasi terjadi apabila eksplan berasal dari lapang, eksplan terbatas, dan tidak ada informasi dari penelitian yang pernah dilakukan (tanaman baru). Eksplan yang berasal dari lapang banyak mengandung kotoran atau mikroorganisme-mikroorganisme yang membuat tanaman sangat rentan kontaminasi baik eksternal (permukaan) maupun internal (bagian dalam jaringan). Untuk tanaman baru perlu dilakukan ekplorasi dengan perlakuan khusus seefektif dan seefisen mungkin, apalagi eksplan yang digunakan terbatas jumlahnya. Oleh karena itu, penelitian ini merupakan tahap awal untuk mencoba melestarikan spesies anggrek kuping gajah (Bulbophyllum beccarii Rchb.f) yang terancam punah dan sudah masuk dalam CITES Apendiks II melalui perlakuan sterilisasi eksplan dalam kultur in vitro. Perlakuan sterilisasi eksplan ada dua macam, yaitu secara mekanik dan secara kimia. Perlakuan sterilisasi yang digunakan dalam penelitian ini yaitu secara kimia. Bahan kimia yang digunakan meliputi fungisida, bakterisida, bayclin, HgCl 2, antibiotik, dan alkohol. Banyaknya faktor penyebab tingkat kontaminasi, menyulitkan penentuan suatu prosedur standar sterilisasi yang berlaku untuk semua tanaman. Percobaan dilakukan sebanyak 11 kali perlakuan dengan jumlah ulangan 30 per perlakuan kecuali pada perlakuan ke-11 jumlah ulangan sebanyak 70. Dari ke sebelas perlakuan sterilisasi tersebut, maka puncak kontaminasi paling lama yaitu 30 HSI, kontaminasi bakteri paling sedikit yaitu sebanyak 3%, dan jumlah browning paling sedikit yaitu 0% pada perlakuan sterilisasi menggunakan fungisida dan bakterisida 5 g/l selama 30 menit, bayclin 10% selama 10 menit, dan alkohol 70% selama 5 menit (FBByA 1). Untuk kontaminasi jamur paling sedikit yaitu sebanyak 10%, sumber kontaminasi pada eksplan paling sedikit yaitu sebanyak 17%, dan sumber kontaminasi pada media paling sedikit yaitu 0% pada perlakuan sterilisasi menggunakan HgCl % selama 1 menit, bayclin 10% selama 7 menit, dan bayclin 10% selama 2 menit (HByBy 3). Sedangkan pada perlakuan sterilisasi eksplan menggunakan HgCl % selama 1 menit, bayclin 10% selama 7 menit, dan bayclin 10% selama 5 menit dengan pembilasan yang berkali-kali dan media yang mengandung ZPT (HByBy 4), sebanyak 41% eksplan masih hidup. Kata kunci : anggrek kuping gajah, Apendiks II, kultur jaringan, sterilisasi.

3 PERNYATAAN Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Perlakuan Sterilisasi Eksplan Anggrek Kuping Gajah (Bulbophyllum beccarii Rchb.f) dalam Kultur In vitro adalah benar-benar hasil karya saya sendiri dengan bimbingan dosen pembimbing dan belum pernah digunakan sebagai karya ilmiah pada perguruan tinggi atau lembaga manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Bogor, Maret 2007 Iwan Gunawan NIM E

4 Judul Skripsi Nama NIM : Perlakuan Sterilisasi Eksplan Anggrek Kuping Gajah (Bulbophyllum beccarii Rchb.f) dalam Kultur In vitro : Iwan Gunawan : E Menyetujui : Komisi Pembimbing Ketua, Anggota, Ir. Edhi Sandra, MSi Dr. Ir. Agus Hikmat, MSc.F NIP NIP Mengetahui : Dekan Fakultas Kehutanan IPB Prof. Dr. Ir. Cecep Kusmana, MS NIP Tanggal Lulus : 16 Maret 2007

5 i KATA PENGANTAR Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang senantiasa memberikan rahmat dan hidayah-nya kepada kita semua. Hanya dengan ijin dan ridha-nya penulis dapat menyelesaikan skripsi ini yang dilaksanakan selama enam bulan dari September 2006 sampai Februari 2007 dengan judul Perlakuan Sterilisasi Eksplan Anggrek Kuping Gajah (Bulbophyllum Beccarii Rchb.f) dalam Kultur In vitro. Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kehutanan pada Departemen Konservasi Sumberdaya Hutan dan Ekowisata, Fakultas Kehutanan, Institut Pertanian Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih yang setulusnya kepada Bapak Ir. Edhi Sandra, MSi. dan Bapak Dr. Ir. Agus Hikmat, MSc.F. selaku pembimbing, Bapak Dr. Ir. Hardjanto, MS. sebagai penguji wakil Departemen Manajemen Hutan dan Bapak Prof. Dr. Ir. Kurnia Sofyan sebagai penguji wakil Departemen Hasil Hutan. Selain itu, penghargaan penulis disampaikan pula kepada staf dan pegawai Laboratorium Konservasi Tumbuhan, Departemen Konservasi Sumberdaya Hutan dan Ekowisata, Fakultas Kehutanan, IPB yang telah membantu selama pelaksanaan penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada bapak, ibu, kakak, dan seluruh keluarga, keluarga besar Paserasa Seroja Putih, serta saudara- saudaraku KSH 39 atas segala do a dan dukungannya. Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Untuk itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun agar bisa lebih baik lagi di masa yang yang akan datang. Semoga skripsi ini bermanfaat. Bogor, Maret 2007 Penulis

6 ii RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor, Jawa Barat pada tanggal 27 Juli 1982 sebagai anak ke tiga dari tiga bersaudara pasangan Burhanudin dan Ooy. Pada tahun 2002 penulis lulus dari SMU Rimba Madya Bogor dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih program Departemen Konservasi Sumberdaya Hutan dan Ekowisata, Fakultas Kehutanan. Selama menuntut ilmu di IPB, penulis aktif disejumlah organisasi kemahasiswaan yakni sebagai ketua UKM IPB Paserasa Seroja Putih tahun dan masih aktif sebagai anggota keluarga besar, anggota UKM IPB Lingkung Seni Sunda Gentra Kaheman , anggota Kelompok Pemerhati Flora (KPF) Forestra tahun 2003 s.d 2005 yang tergabung dalam Himpunan Mahasiswa Konservasi Sumberdaya Hutan dan Ekowisata (HIMAKOVA). Pada tahun 2004 penulis bergabung dalam Tim Ekspedisi Studi Konservasi Lingkungan (SURILI 2004) di Taman Nasional Bukit Barisan Selatan, Lampung, dan di tahun yang sama melaksanakan kegiatan magang mandiri di Taman Nasional Ujung Kulon, Banten. Pada tahun 2005 penulis bergabung dalam Tim Ekspedisi Studi Konservasi Lingkungan (SURILI 2005) di Taman Nasional Betung Kerihun, Kalimantan Barat. Pada tahun penulis dipercaya sebagai asisten dosen mata kuliah Konservasi Tumbuhan Obat dan Konservasi Tumbuhan Langka serta aktif dalam kegiatan pelatihan kultur jaringan di Unit Kultur Jaringan Lab. Konservasi Tumbuhan, DKSHE. Selain itu, di tahun 2005 penulis juga melakukan Praktek Pengenalan dan Pengelolaan Hutan (P3H) di KPH Ciamis, CA Leuweung Sancang, dan CA/TWA Kawah Kamojang BKSDA Jabar II. Pada tahun 2006 penulis melakukan Praktek Kerja Lapang Profesi (PKLP) di Taman Nasional Way Kambas, Lampung. Sebagai syarat untuk memperoleh gelar sarjana Kehutanan, penulis melakukan penelitian dengan judul Perlakuan Sterilisasi Eksplan Anggrek Kuping Gajah (Bulbophyllum beccarii Rchb.f) dalam Kultur In vitro dibawah bimbingan Ir. Edhi Sandra, Msi. dan Dr. Ir. Agus Hikmat, MSc.F.

7 iii DAFTAR ISI Halaman KATA PENGANTAR.... i DAFTAR TABEL.... v DAFTAR GAMBAR.... vi DAFTAR LAMPIRAN... vii BAB I PENDAHULUAN Latar Belakang Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian... 3 BAB II TINJAUAN PUSTAKA Anggrek Kuping Gajah (Bulbophyllum beccarii Rchb.f ) Taksonomi Morfologi Habitat dan Ekologi Penyebaran Kultur Jaringan Pengertian Kultur Jaringan Kultur Jaringan Anggrek Media Kultur Lingkungan Tumbuh dalam Kultur Jaringan Zat Pengatur Tumbuh Kultur Jaringan sebagai Pelengkap Penyimpanan Plasma Nutfah Manfaat Kultur Jaringan Eksplan Sterilisasi Eksplan BAB III METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian Bahan dan Alat Penelitian Bahan... 16

8 iv Alat-Alat Jenis Data Data Sekunder Data Primer Pelaksanaan Penelitian Sterilisasi Pembuatan Media Penanaman Pengamatan Analisa Data BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh Perlakuan Sterilisasi Eksplan Pembentukan Kalus Tingkat Kontaminasi Masalah dalam Kultur Jaringan dan Pengendaliannya BAB V KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 47

9 v DAFTAR TABEL No Halaman 1. Eksplan tanpa perlakuan sterilisasi di laminar air flow cabinet (Kontrol) Perlakuan sterilisasi eksplan menggunakan fungisida dan bakterisida 5 g/l selama 30 menit, bayclin 10% selama 10 menit, dan alkohol 70% selama 5 menit (FBByA 1) Perlakuan sterilisasi eksplan menggunakan fungisida dan bakterisida 5 g/l selama 30 menit, bayclin 10% selama 7 menit, dan alkohol 70% selama 1 menit (FBByA 2) Perlakuan sterilisasi eksplan menggunakan antibiotik 5 g/l selama 4 jam dan alkohol 70% selama 7 menit (AnAl) Perlakuan sterilisasi eksplan menggunakan bayclin 25%, 20%, dan 10% masing-masing selama 7 menit (3By 1) Perlakuan sterilisasi eksplan menggunakan bayclin 25%, 20%, dan 5% masing-masing selama 7 menit (3By 2) Perlakuan sterilisasi eksplan menggunakan HgCl % selama 10 menit (HgCl) Perlakuan sterilisasi eksplan menggunakan HgCl % selama 5 menit, bayclin 10% selama 10 menit, dan bayclin 10% selama 5 menit (HByBy 1) Perlakuan sterilisasi eksplan menggunakan HgCl % selama 5 menit, bayclin 10% selama 7 menit, dan bayclin 10% selama 5 menit (HByBy 2) Perlakuan sterilisasi eksplan menggunakan HgCl % selama 1 menit, bayclin 10% selama 7 menit, dan bayclin 10% selama 2 menit (HByBy 3) Perlakuan sterilisasi eksplan menggunakan HgCl % selama 1 menit, bayclin 10% selama 7 menit, dan bayclin 10% selama 5 menit (HByBy 4)... 35

10 vi DAFTAR GAMBAR No Halaman 1. Anggrek kuping gajah (Bulbophyllum beccarii Rchb.f) Bagian-bagian anggrek kuping gajah (Bulbophyllum beccarii Rchb.f) Eksplan mati karena bahan sterilan Grafik tingkat kontaminasi jamur Grafik tingkat kontaminasi bakteri a. Jamur hitam b. Jamur putih c. Jamur merah d. Bakteri Kecendrungan resiko kontaminasi Grafik tingkat sumber kontaminasi pada media Grafik tingkat sumber kontaminasi pada eksplan Kontaminan yang menyerang bagian dalam jaringan daun Browning (pencoklatan)... 42

11 vii DAFTAR LAMPIRAN No Halaman 1. Nama-nama bahan kimia untuk sterilisasi permukaan eksplan beserta kisaran konsentrasi dan lama perendamannya Pembuatan larutan stock MS (Murashige dan Skoog) Skema pembuatan media MS volume satu liter Tingkat kontaminasi pada seluruh perlakuan sterilisasi permukaan eksplan Perlakuan sterilisasi eksplan menggunakan HgCl % selama 5 menit, bayclin 10% selama 7 menit, dan bayclin 10% selama 5 menit (HByBy 2) Perlakuan sterilisasi eksplan menggunakan HgCl % selama 1 menit, bayclin 10% selama 7 menit, dan bayclin 10% selama 2 menit (HByBy 3) Perlakuan sterilisasi eksplan menggunakan HgCl % selama 1 menit, bayclin 10% selama 7 menit, dan bayclin 10% selama 5 menit (HByBy 4)... 55

12 I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Keluarga anggrek mempunyai lebih banyak spesiesnya daripada keluarga tumbuhan bunga-bungaan lainnya. Para ahli tumbuh-tumbuhan berkeyakinan anggrek mempunyai kurang lebih spesies dari 750 genus yang berbeda yang tersebar di seluruh dunia, dan sekitar 5000 spesies terdapat di hampir semua pulau di Indonesia. Kalimantan, Papua, Sumatera, dan Jawa termasuk pulau-pulau yang terkenal di dunia karena kekayaan anggreknya (Darmono 2003; Rudhy 2006). Kalimantan memiliki kawasan hutan sangat luas dan berpotensi sebagai tempat tersebarnya plasma nutfah. Salah satu potensi plasma nutfah yang tidak ternilai harganya adalah anggrek. Berbagai spesies anggrek dapat tumbuh dan berkembang dengan baik di hamparan belantara khatulistiwa ini. Diperkirakan hutan Kalimantan menyimpan spesies anggrek. Khususnya yang tumbuh di Kalimantan Barat diantaranya dari genus Dimorphorchis, Paphiopedillum, Phalaenopsis, Dendrobium, Ceologyne, Eria, Grammatophyllum, Aerides dan spesies Bulbophyllum beccarii Rchb.f. (Equator Online Development Team 2002). Genus Dendrobium dan Phalaenopsis merupakan anggrek komersial yang menguasai pasar anggrek lebih dari 80 % (Setiawan 2005). Di antara spesies-spesies anggrek yang ada, anggota Bulbophyllum merupakan genus yang paling besar (Hawkes 1965). Namun, di Kalimantan Barat spesies B. beccarii atau nama lokalnya anggrek kuping gajah merupakan salah satu anggrek alam yang sekarang terancam punah dan spesies ini sudah masuk dalam CITES Apendiks II (Soehartono dan Mardiastuti 2003). Kekayaan spesies anggrek yang dimiliki ini merupakan potensi yang sangat berharga bagi keanekaragaman sumber daya genetik anggrek di Indonesia. Namun sangat disayangkan, keanekaragaman anggrek tersebut terancam kelestariannya karena maraknya penebangan hutan dan konversi hutan. Penyebab lain adalah banyaknya pencurian terselubung oleh orang asing terhadap anggrekanggrek asli alam dengan dalih kerjasama dan sumbangan dana penelitian. Sementara itu, hanya sebagian kecil pihak yang mampu melakukan

13 2 pengembangan dan pemanfaatan spesies anggrek alam. Apabila hal ini terus dibiarkan, maka tidak mustahil spesies anggrek alam Indonesia lambat laun akan punah. Salah satu alternatif untuk melestarikan keanekaragaman anggrek alam adalah melakukan perbanyakan melalui kultur jaringan. Dengan kultur jaringan, dapat melakukan berbagai hal yang berkaitan dengan pelestarian anggrek yang tidak dapat dilakukan secara konvensional. Dengan kultur jaringan juga dapat dilakukan perbanyakan anggrek dengan jumlah banyak dan dalam waktu yang relatif singkat. Selain itu, bisa dihasilkan anggrek yang memiliki sifat sama dengan induknya dan pertumbuhannya relatif seragam (Sandra 2003). Dalam pelaksanaan kegiatan kultur jaringan tumbuhan, banyak sekali masalah-masalah yang muncul sebagai pengganggu dan bahkan menjadi penyebab tidak tercapainya tujuan kegiatan kultur yang dilakukan. Salah satu gangguan yang sering terjadi dalam kegiatan kultur adalah berasal dari bahan tumbuhan. Misalnya, tumbuhan berasal dari alam/lapang, kondisi tumbuhan yang terserang penyakit, dan bahan yang tersedia terbatas. Tumbuhan yang berasal dari lapang sudah pasti mengandung debu, kotoran, dan berbagai kontaminan hidup pada permukaannya dan bahkan bisa pada bagian dalam jaringan. Kontaminan yang berasal dari lingkungan tersebut bisa mengakibatkan tumbuhan terserang penyakit. Kondisi tumbuhan yang terserang penyakit atau terkontaminasi mikroorganisme baik eksternal (permukaan) maupun internal (bagian dalam jaringan), tidak mudah untuk dilakukan pengkulturan. Kesulitan perbanyakan tumbuhan yang terkontaminasi mikroorganisme dengan kultur jaringan, yaitu bagaimana mematikan atau menghilangkan mikroorganisme dengan bahan sterilian tanpa mematikan tumbuhan (eksplan) (Darmono 2003; Santoso dan Nursandi 2002). Menurut Gunawan (1987) bahan-bahan sterilisasi yang biasa digunakan umumnya bersifat toksik terhadap jaringan. Permasalahan lain yang sering terjadi pada kegiatan kultur jaringan adalah peristiwa browning (pencoklatan). Menurut Sandra (2003), setiap tumbuhan akan mengeluarkan larutan fenol yang akan bereaksi dengan udara (oksigen) sehingga menghasilkan larutan berwarna coklat yang disebut quinon. Larutan yang berwarna coklat tersebut jika terakumulasi pada media akan meracuni eksplan.

14 3 Di Indonesia perbanyakan anggrek kuping gajah belum pernah dilakukan, khususnya dengan teknik kultur jaringan. Sehingga, berbagai informasi mengenai perbanyakan anggrek dengan kultur jaringan ini belum ada. Oleh karena itu, penelitian ini merupakan penelitian awal dalam upaya memperbanyak anggrek kuping gajah melalui kultur jaringan. Menurut Wetherell (1982), tahap awal yang harus dilakukan dalam kegiatan kultur jaringan adalah sterilisasi eksplan. Sterilisasi ini dilakukan untuk mensucihamakan dan membebaskan eksplan dari mikroorganisme, sehingga bisa ditumbuhkan dalam media kultur dengan kondisi yang aseptik. Menurut Sandra dan Medi (2002), sterilisasi merupakan permasalahan utama yang menentukan keberhasilan kultur jaringan, terutama sterilisasi eksplan yang berasal dari luar atau lapang. Jika sterilisasi gagal maka kegiatan selanjutnya tidak bermanfaat. 1) 1.2 Tujuan Penelitian Tujuan yang ingin dicapai dari penelitian ini adalah mengetahui pengaruh dari beberapa perlakuan sterilisasi terhadap eksplan anggrek kuping gajah dalam kultur in vitro. 1.3 Manfaat Penelitian Dengan dilakukannya penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi awal mengenai sterilisasi eksplan yang sesuai, sehingga ke depan bisa dilakukan penelitian kultur jaringan dengan tujuan pengembangan ke arah pemuliaan dan perbanyakan. Setelah perbanyakan berhasil dilakukan maka diharapkan dapat merubah/menghapus status anggrek kuping gajah dari CITES Apendiks II atau Genting (Endangered) menjadi CITES Non Apendiks. 1) Sandra, E. dan L. Medi. Garis Besar Bahan Kuliah Pelatihan Kultur Jaringan. Unit Kultur Jaringan Laboratorium Konservasi Tumbuhan Jurusan Konservasi Sumberdaya Hutan Fakultas Kehutanan IPB, Bogor, 2002, hal 16.

15 II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Anggrek Kuping Gajah (Bulbophyllum beccarii Rchb.f) Taksonomi Taksonomi dari anggrek kuping gajah (Bulbophyllum beccarii Rchb.f) menurut Tjitrosoepomo (1988) adalah sebagai berikut : Kingdom Divisio Klas Ordo Famili Genus Spesies : Plantae : Magnoliophyta : Liliopsida : Asparagales : Orchidaceae : Bulbophyllum : Bulbophyllum beccarii Gambar 1 Anggrek kuping gajah (Bulbophyllum beccarii Rchb.f) Sumber : The Wikimedia Foundation Inc Morfologi Anggrek kuping gajah merupakan tumbuhan pemanjat sempurna dan termasuk jenis efipit. Diameter umbi batang semu (rhizome) mencapai cm, gemuk, memanjat dengan bentuk melingkar (spiral) di pohon. Akar banyak sepanjang rhizome dengan diameter 1-3 mm. Umbi semu (pseudobulbs) panjangnya cm secara terpisah. Daun panjangnya bisa mencapai x cm. Tangkai bunga panjangnya x 7-14 cm dengan dihiasi banyak bunga yang rapat. Bunga 2 x 1.5 cm dengan bau yang kurang sedap, berwarna ungu kehitam-hitaman. Bakal buah panjangnya 2-3 cm. Kelopak tengah panjangnya 1.2 x cm. Kelopak sisi kiri panjangnya x cm triangular-ovate. Tajuk bunga panjangnya x cm. Bibir bunga cm, 0.3 lebar pada dasar. Tiang mercu bunga mm, pollen berjumlah empat (Handoyono dan Prasetya 2006; Hawkes 1965; Wood 1997). Untuk bagian-bagian anggrek dapat dilihat pada Gambar 2.

16 5 Gambar 2 Bagian-bagian anggrek kuping gajah (Bulbophyllum beccarii Rchb.f) Keterangan gambar : A. Akar G. Bibir bunga (lip) B. Daun H. Bakal buah (pedicel with ovary) C. Bunga I. Tiang mercu bunga (column) D. Kelopak tengah (dorsal sepal) J. Tudung kepala sari (anther-cap) E. Kelopak sisi kiri (lateral sepal) K. Polen (pollinia) F. Tajuk bunga (petal) Habitat dan Ekologi Anggrek kuping gajah tumbuh di hutan tanah podsol bersama genus Dacrydium, Rhododendron, Tristania, dan lain-lain; hutan rawa tanah gambut bersama spesies Shorea albida, hutan dataran rendah Dipterocarpaceae dengan ketinggian 600 m dpl, serta di hutan kerangas (Chan et. al. 1994; Hawkes 1965; Wood 1997) Penyebaran Anggrek kuping gajah tersebar di Brunei, Borneo (Kalbar) merupakan spesies endemik, Sabah (di daerah Nabawan bagian atas sungai Kinabatangan), dan Sarawak (Taman Nasional Bako, distrik Betong, hutan Saribas) (Chan et. al. 1994; Handoyono dan Prasetya 2006; Hawkes 1965; Wood 1997).

17 6 2.2 Kultur Jaringan Pengertian Kultur Jaringan Kultur jaringan (tissue culture) adalah suatu teknik mengisolasi bagianbagian tanaman (sel, sekelompok sel, jaringan, organ, protoplasma, tepung sari, ovari dan sebagainya), ditumbuhkan secara tersendiri, dipacu untuk memperbanyak diri, akhirnya diregenerasikan kembali menjadi tanaman lengkap yang mempunyai sifat sama seperti induknya dalam suatu lingkungan yang aseptik (bebas hama dan penyakit). Selanjutnya Teknik ini juga disebut kultur in vitro (in vitro culture) yang artinya kultur di dalam wadah gelas (Nugroho dan Sugito 2002; Wattimena et al. 1992). Menurut Albert et al. (1994) pakar biokimia dan pakar biologi berpendapat bahwa in vitro mengacu pada reaksi-reaksi biokimia yang berlangsung di luar sel hidup. Sedangkan in vivo mengacu ke reaksi-reaksi yang berlangsung dalam sebuah sel hidup. Menurut Wetherell (1982) bahwa sel atau jaringan tanaman pada dasarnya dapat ditanam secara terpisah dalam suatu kultur (in vitro). Sel dan jaringan yang ditanam dengan cara ini, memiliki kemampuan untuk regenerasi bagian-bagian yang diperlukan dalam upayanya untuk bisa tumbuh dengan normal, membentuk kembali menjadi tumbuhan yang utuh. Dengan kata lain bahwa di dalam masingmasing sel tumbuhan mengandung informasi genetik dan atau sarana fisiologis tertentu yang mampu membentuk tanaman lengkap bila ditempatkan pada lingkungan yang sesuai. Kemampuan inilah yang kemudian dikenal sebagai totipotensi. Kultur jaringan terdiri atas beberapa tahap kegiatan. Profesor Murashige dari Universitas California membagi kultur in vitro dalam tiga tahap. Tahap I yang juga di sebut sebagai tahap persiapan eksplan, di mana eksplan disucihamakan dan dibebaskan dari mikroorganisme, selanjutnya ditumbuhkan dalam media kultur dengan kondisi yang aseptik. Tahap II yaitu tahap penggandaan propagul dengan cara meningkatkan jumlah cabang asiler ataupun pembentukan tunastunas baru. Tahap III adalah tahap pendewasaan lebih lanjut dari calon tanaman dengan merangsang pembentukan akar dan pertumbuhan (aklimatisasi). Tahap III ini juga disebut sebagai tahap penyesuaian atau tahap pra tanam (Wetherell 1982). Tahapan-tahapan ini kemudian disempurnakan oleh Deberg dan Maena (1981)

18 7 dalam Wattimena et al.(1992) menjadi 5 tahap, yaitu: 1) Seleksi tanaman induk, 2) Pemantapan kultur aseptik, 3) Produksi propagul, 4) Persiapan planlet sebelum diaklimatisasi, dan 5) Aklimatisasi planlet. Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis tanaman dalam kultur jaringan dapat digolongkan menjadi 4 golongan utama, yaitu: 1. Genotipe dari sumber bahan tanaman yang digunakan 2. Media, mencakup tentang komponen penyusun media dan juga zat pengatur tumbuh tanaman yang digunakan 3. Lingkungan tumbuh tanaman yaitu keadaan fisik tempat kultur ditumbuhkan 4. Fisiologi jaringan tanaman sebagai eksplan. Kempat faktor tersebut dapat berinteraksi satu dengan yang lainnya (Wattimena et al. 1992) Kultur Jaringan Anggrek Penelitian kultur jaringan anggrek yang pertama kali dipublikasikan adalah hasil percobaan George Morel pada tahun 1960 yang dilakukan untuk mendapatkan tanaman Cymbidium bebas virus (Bergman 1972 dalam Wattimena et al.1986). Sejak dipublikasikannya percobaan tersebut, pemakain kultur jaringan untuk perbanyakan vegetatif anggrek semakin pesat perkembangannya (Wattimena et al.1986). Pada tahun 1964, sebuah perusahaan anggrek di Perancis berhasil memproduksi klon-klon anggrek secara komersial. Perusahaan tersebut juga menggunakan istilah mericlon bagi tanaman anggrek hasil perbanyakan lewat kultur jaringan seperti yang disarankan oleh Gordon Dilon sebelumnya (Bertsch 1967 dalam Wattimena et al.1986) Media Kultur Keberhasilan dalam teknologi serta penggunaan metode in vitro terutama disebabkan pengetahuan yang lebih baik tentang kebutuhan hara sel dan jaringan yang dikulturkan. Hara terdiri dari komponen yang utama dan komponen tambahan. Komponen utama meliputi garam mineral, sumber karbon (gula),

19 8 vitamin dan pengatur tumbuh. Komponen lain seperti senyawa nitrogen organik, berbagai asam organik, metabolit dan ekstrak tambahan tidak mutlak, tetapi dapat menguntungkan ketahanan sel dan perbanyakannya (Wetter dan Constabel 1991). Media hara dapat berbentuk padat, semi padat dan cair (Wattimena et al. 1992). Komposisi formulasi dari suatu media, harus mengandung nutrien esensial makro dan mikro serta sumber tenaga. Zat-zat tersebut bisa dicampur sendiri dari bahan dasarnya atau diperoleh sudah dalam bentuk campuran. Biasanya ditambah zat pengatur tumbuh, seperti hormon-hormon dan penyangga misalnya agar. Banyak formulasi media yang ada, masing-masing berbeda dalam hal kuantitas maupun kualitas komponennya. Dari sekian banyak formulasi yang ada, beberapa buah diantaranya telah sering dipakai. Antara lain seperti yang telah dikemukakan oleh Toshio Murashige dan dipublikasikan oleh Murashige dan Skoog pada tahun 1962 (Wetherell 1982). Media yang dipakai dalam kultur jaringan telah banyak dikembangkan oleh beberapa peneliti. Di dalam media tersebut biasanya terkandung senyawasenyawa kimia yang diperlukan oleh jaringan tanaman (Drew 1980 dalam Wattimena et al.1986). Senyawa-senyawa kimia yang terkandung dalam media disusun dalam perimbangan tertentu. Perimbangan yang tepat dari senyawa penyusun tersebut perlu dan menentukan tipe pertumbuhan yang akan terbentuk dari eksplan yang ditanam (Drew 1980; Murashige 1977a dalam Wattimena et al.1986). Setiap media kultur mempunyai kespesifikan yang tertentu. Media Murashige dan Skoog (MS) merupakan media kultur yang umum digunakan para ahli karena dapat dipakai untuk mengulturkan berbagai macam tanaman, termasuk anggrek. Sementara itu, media Vacin dan Went (VW) merupakan media kultur yang khusus dipergunakan untuk anggrek (Sandra 2003). Keistimewaan medium MS adalah kandungan nitrat, kalium, dan amoniumnya yang tinggi (Wetter dan Constabel 1991). Dewasa ini beberapa media kultur jaringan dapat dibeli dalam bentuk bubuk yang telah dipersiapkan. Tergantung dari jenisnya, media kultur jaringan ada yang hanya mengandung garam mikro serta vitamin, ada juga yang lengkap sampai hormon dan gula (Nugroho dan Sugito 2002).

20 Lingkungan Tumbuh dalam Kultur Jaringan Ada tiga hal yang perlu diperhatikan dalam lingkungan tumbuh kultur jaringan yaitu cahaya, temperatur, dan keadaan udara ruang kultur. Dari penelitian yang ada dapat menunjukkan bahwa pada umumnya cahaya dapat memperbaiki pertumbuhan. Dengan adanya cahaya dapat dihasilkan tanaman yang hijau dan berdaun normal (Murashige 1977b dalam Wattimena et al.1986). Intensitas cahaya yang rendah dapat mempertinggi embriogenesis dan organogenesis. Pembentukan kalus maksimum sering terjadi di tempat yang lebih gelap (Hendaryono dan Wijayani 1994). Menurut Wetherell (1982) bahwa sebagai sinar tiruan yang banyak disukai dalam penumbuhan tanaman adalah lampulampu fluorensi. Hal ini disebabkan lampu-lampu jenis itu selain mampu memancarkan sinar yang lebih merata, juga mempunyai kemampuan mengubah energi listrik menjadi energi cahaya yang tiga kali lebih besar daripada lampu biasa. Kekuatan penyinaran lampu fluorensi antara foot candle ( lux). Bila dipakai lampu fluorensi putih standar digunakan lampu yang berkekuatan 40 watt, dengan jarak cm dari rak kultur. Waktu penyinaran yang paling baik berlangsungnya foto periode selama 16 jam. Temperatur ruang kultur terdiri dari suhu dan kelembaban relatif. Suhu ruang kultur biasanya dijaga berkisar antara C. Pada beberapa tanaman, temperatur ruangan berpengaruh pada proses morfogenesis yang terjadi dari jaringan yang ditanam (Wattimena et al.1986). Suatu kondisi dimana suhu yang dibuat berbeda untuk periode (masa) gelap dan periode terang, dengan membuat suhu pada periode gelap lebih rendah dari periode terang berpengaruh baik bagi beberapa spesies (Wetherell 1982). Suatu wadah kultur yang tertutup rapat akan jenuh oleh uap air. Bila kelembaban ruangan udara rendah, penguapan air dari media kultur akan terlalu besar. Dalam hal ini kelembaban ruang kultur perlu dinaikan, tetapi kelembaban ruang kultur yang tinggi akan menyebabkan terjadinya terjadinya pertumbuhan mikroba diluar wadah kultur dan alat-alat (Wetherell 1982). Kelembaban relatif (RH) lingkungan biasanya mendekati 100%. RH sekeliling kultur mempengaruhi pola pengembangan. Jadi, pengaturan RH pada keadaan tertentu memerlukan suatu bentuk diferensiasi khusus (Hendaryono dan Wijayani 1994).

21 10 Keadaan udara ruang kultur berpengaruh terhadap perkembangan kultur jaringan yang dilakukan. Gas-gas yang dikeluarkan oleh jaringan tanaman misalnya etilen, akan terkumpul dalam botol kultur dan dapat menghambat pertumbuhan jaringan. Sedangkan keadaan udara ruang kultur di luar botol jika tidak bersih dapat menyebabkan terjadinya kontaminasi pada kultur yang disimpan (Wattimena et al.1986). Menurut Wetherell (1982) bahwa udara dalam ruang kultur perlu dijaga supaya tetap bersih dan bebas dari debu. Terutama karena adanya pertukaran udara dalam wadah kultur dengan udara dalam ruang kultur. Supaya dapat terjadi pertukaran udara yang bebas dari debu, maka diperlukan terjadinya aliran udara yang bertekanan dari dalam ke luar. Tanaman in vitro sangat peka terhadap polusi, gas-gas, dan lain-lain. Maka perlu juga diperhatikan bahwa tanaman harus terhindar dari pengaruh asap, gas yang berasal dari cat, etilen, belerang oksida, ozon, dan polutan lain yang dapat mengganggu pertumbuhan. 2.3 Zat Pengatur Tumbuh Menurut Hendaryono dan Wijayani (1994), zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senyawa organik bukan hara, yang dalam jumlah sedikit dapt mendukung, menghambat dan dapat merubah proses fisiologi tumbuhan. Zat pengatur tumbuh dalam tanaman terdiri dari lima kelompok yaitu auksin, giberelin, sitokinin, etilen, dan inhibitor dengan ciri khas serta pengaruh yang berlainan terhadap proses fisiologis. Zat pengatur tumbuh angat diperlukan sebagai komponen media bagi pertumbuhan dan diferensiasi. Tanpa penambahan zat pengatur tumbuh dalam media, pertumbuhan sangat terhambat bahkan mungkin tidak tumbuh sama sekali. Pembentukan kalus dan organ-organ ditentukan oleh penggunaan yang tepat dari zat pengatur tumbuh tersebut. Menurut Wattimena et al.(1992) dan BPPK DEPHUT (1994) zat pengatur tumbuh auksin mempunyai peran mendorong perpanjangan sel, pembelahan sel, diferensiasi jaringan xilem dan floem, pembentukan akar, pembungaan pada Bromeliaceae, pembentukan buah partenokarpi, pembentukan bunga betina pada tanaman diocious, dominan apikal, respon tropisme, serta menghambat pengguguran daun, bunga dan buah.

22 11 Menurut Weherell (1982) peran auksin dalam kultur jaringan yang pertama adalah merangsang pertumbuhan pucuk-pucuk baru, dan yang kedua adalah merangsang pembentukan akar. Zat pengatur tumbuh auksin seperti 2.4- Dikloro fenoksiasetat (2.4-D) dan Naftalen Asam Asetat (NAA) merupakan jenis zat pengatur tumbuh yang stabil dibandingkan dengan Indol Asam Asetat (IAA). 2.4 Kultur Jaringan sebagai Pelengkap Penyimpanan Plasma Nutfah Langkah pertama menuju konservasi in vitro adalah penyimpanan plasma nutfah (Benson 1999). Menurut Suryowinoto (1996), plasma nutfah adalah tanaman yang dahulu pernah dapat memenuhi kebutuhan manusia, tanaman yang sekarang ada dan diperlukan untuk memenuhi kebutuhan manusia, dan tumbuhtumbuhan yang diperkirakan nantinya akan berguna untuk memenuhi kebutuhan manusia. Dipusat-pusat penyimpanan plasma nutfah disimpan biji-biji, bagian vegetatif seperti akar rimpang, umbi atau bagian lain, disimpan selama berbulanbulan atau bertahun-tahun, tergantung macam tanamannya untuk nantinya dapat ditumbuhkan kembali seperti sediakala. Setelah bioteknologi maju pesat terutama dalam kultur in vitro, maka mulai muncul pemikiran untuk memakai hasil kultur jaringan untuk bahan plasma nutfah yang dipreservasi. Untuk cryopreservation dapat dipakai hasil-hasil kultur jaringan, antara lain plantula, kalus, protocorm like bodies (plb), embryoid, hasil kultur sel, protoplas, meristem ujung yang bebas infeksi virus. 2.5 Manfaat Kultur Jaringan Menurut Darmono (2003); Hendaryono dan Wijayani (1994); serta Sandra dan Medi (2002) manfaat yang bisa didapatkan dari kultur jaringan adalah sebagai berikut : 1. Bibit dapat diperbanyak dalam jumlah besar dan relatif cepat. 2. Bibit unggul, cepat berbuah serta tahan hama dan penyakit. 3. Seragam atau sama dengan induknya, tetapi dapat juga menimbulkan keberagaman. 4. Efisiensi tempat dan waktu. 5. Tidak tergantung musim, dapat diperbanyak secara kontinyu. 6. Untuk skala besar biaya lebih murah. 7. Cocok untuk tanaman yang sulit beregenerasi.

23 12 8. Menghasilkan tanaman bebas virus. 9. Menghasilkan bahan bioaktif/metabolit sekunder tanpa menanam di luar atau di lapang. 10. Kultur jaringan sesuai dengan program pemuliaan konvensional seperti penyelamatan embrio. 11. Produksi bahan-bahan sekunder dapat melalui kultur sel, jaringan, dan organ, misalnya produksi papain dari pepaya. 12. Proses tukar-menukar plasma nutfah menjadi lebih mudah. 13. Plasma nutfah bisa disimpan dalam bentuk sel-sel yang kompeten dalam regenerasi. 1) 2.6 Eksplan Eksplan adalah potongan/bagian jaringan yang diisolasi dari tanaman yang digunakan untuk inisiasi suatu kultur in vitro (Sandra dan Karyaningsih 2000). 2) Menurut Hendaryono dan Wijayani (1994) bahwa ekplan yang dipilih harus merupakan bagian-bagian tanaman yang mempunyai sel aktif membelah (sel meristem), karena pada bagian-bagian sel ini mengandung hormon tanaman yang baik untuk membantu pertumbuhan. Pengambilan eksplan dari jaringan dewasa (in deferensiasi) dalam waktu lama tidak akan terbentuk kalus, sebab kemampuan untuk membentuk jaringan tidak ada. Meskipun dari tanaman dewasa ini terjadi penambahan volume, tetapi tidak terjadi penambahan sel sebab tidak mengalami pembelahan sel. Sedangkan pada jaringan meristem akan terjadi penambahan sel. Pada prinsipnya eksplan dapat diambil dari semua bagian tanaman baik dari jaringan akar, batang, dan daun. Biasanya sebagai bahan eksplan dipilih bagian-bagian jaringan yang belum banyak mengalami perubahan bentuk dan kekhususan fungsi atau dipilih bagian-bagian yang bersifat meristematik (Majnu 1975 dalam Wattimena et al.1986). Pemakain tunas pucuk, tunas samping, tunas bunga, daun bunga, daun, cabang muda, akar, umbi, bagian-bagian embrio, anther, dan beberapa bagian lainnya sering dilakukan dalam kultur jaringan beberapa tanaman tertentu (Haramaki dan Heuser 1980 dalam dalam Wattimena et al.1986). Ukuran eksplan yang dipakai bervariasi tergantung tujuan pembiakannya. Eksplan ukuran besar lebih mudah terkontaminasi, sedangkan yang kecil lebih sedikit kemungkinannya terkena kontaminasi. Namun, eksplan 2) Sandra, E. dan I. Karyaningsih Panduan Teknis Pelatihan Kultur Jaringan. Unit Kultur Jaringan Laboratorium Konservasi Tumbuhan Jurusan Konservasi Sumberdaya hutan Fakultas Kehutanan IPB, Bogor, 2000, hal 1.

24 13 yang kecil mempunyai persentase kematian jaringan yang tinggi dibandingkan eksplan yang lebih besar. Menurut Sandra (2003) bahwa secara teori setiap bagian anggrek bisa digunakan sebagai eksplan sepanjang bagian tanaman tersebut masih hidup. Perbedaannya adalah tingkat kesulitannya. Bagian-bagian tanaman anggrek yang bisa dijadikan eksplan seperti biji anggrek, tunas pucuk, meristem pucuk dan lateral, meristem akar, jaringan muda anggrek (daun muda, tangkai bunga muda, atau bunga muda), jaringan dewasa anggrek, dan jaringan tua anggrek. Bagian yang sering digunakan sebagai eksplan adalah bagian meristem atau bagian anggrek yang masih muda. 2.7 Sterilisasi Eksplan Menurut Sandra dan Karyaningsih (2000), sterilisasi adalah proses untuk mematikan atau menonaktifkan spora dan mikroorganisme sampai ke tingkat yang tidak memungkinkan lagi berkembang biak atau menjadi sumber kontaminan selama proses perkembangan berlangsung. 2) Menurut Hendaryono dan Wijayani (1994) sterilisasi eksplan dapat dilaksanakan dengan dua cara, yaitu secara mekanik dan secara kimia. Sterilisasi eksplan secara mekanik digunakan untuk eksplan yang keras (misalnya tebu, biji salak, dan sebagainya) atau berdaging (misalnya wortel, umbi, dan sebagainya), yaitu dengan membakar eksplan tersebut di atas lampu spiritus sebanyak tiga kali. Sedangkan sterilisasi eksplan secara kimia digunakan untuk eksplan yang lunak (jaringan muda) seperti daun, tangkai daun, anther, dan sebagainya. Bahan-bahan kimia yang sering digunakan untuk sterilisasi permukaan eksplan antara lain: 1. Sodium hipoklorit Nama dagangnya adalah clorox dan bayclin. Konsentrasi untuk sterilisasi tergantung dari kelunakan eksplan, dapat 5%-20% dan waktunya antara 5-10 menit. 2. Mercuri klorit Nama dagangnya adalah sublimat 0.05%. Penggunaan bahan kimia ini harus hati-hati karena bersifat racun. Cara perlakuan sterilisasinya sama dengan clorox, hanya waktunya lebih pendek karena sublimat bersifat keras.

25 14 3. Alkohol 70% Alkohol lebih banyak diperdagangkan dalam bentuk alkohol 95%. Jamur biasanya mati dengan alkohol 70%, sedangkan dengan alkohol 95% masih tetap hidup. Dari ketiga bahan kimia tersebut, perlakuan sterilisasinya biasanya dilakukan di dalam laminar air flow cabinet. Untuk perlakuan sterilisasi di luar laminar air flow cabinet biasanya menggunakan fungisida dan bakterisida. Fungisida adalah bahan yang mengandung senyawa kimia beracun dan bisa digunakan untuk memberantas dan mencegah fungi/cendawan/jamur. Fungisida yang digunakan untuk sterilisasi merupakan fungisida sistemik. Fungisida sistemik adalah senyawa kimia yang bila diaplikasikan pada tanaman akan bertranslokasi ke bagian lain. Merek dagang fungisida sistemik yang bisa digunakan antara lain benlet, previcur N, derosal 500 EC. Bakterisida adalah bahan yang mengandung senyawa kimia beracun dan bisa digunakan untuk memberantas dan mencegah bakteri. Merek dagang bakterisida sistemik yang bisa digunakan antara lain streptomycine (Wudianto 2002). Deterjen (rinso) digunakan untuk mencuci eksplan sekaligus menghilangkan mikroba-mikroba yang menempel pada permukaan eksplan. Pencucian biasanya menggunakan deterjen secukupnya selama 3-7 menit. Pencucian yang terlalu lama atau buih deterjen yang terlalu kental dapat merusak jaringan (Hendaryono dan Wijayani 1994). Menurut Sandra (2003), prinsip dasar sterilisasi eksplan adalah mensterilkan eksplan dari berbagai mikroorganisme, tetapi eksplannya tidak ikut mati. Setiap tanaman memerlukan perlakuan khusus sehingga sebelum mengulturkan tanaman baru perlu melakukan percobaan sterilisasi. Sebagai patokan, konsentrasi bahan dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi eksplan sebagai berikut : 1. Sterilisasi Ringan Eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 20% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 15% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 10% selama 10

26 15 menit, lalu bilas dengan air steril tiga kali. 2. Sterilisasi Sedang Eksplan direndam dalam HgCl mg/l selama 7 menit, lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 15% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 10% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril tiga kali. 3. Sterilisasi Keras Eksplan direndam dalam HgCl mg/l selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam alkohol 90% selama 15 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 20% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril tiga kali. Menurut Gunawan (1987) ada sekitar sepuluh jenis bahan yang digunakan dalam sterilisasi permukaan, yaitu kalsium hipoklorit, natrium hipoklorit, hidrogen peroksida, gas klorin, perak nitrat, merkuri klorid, betadin, fungisida, antibiotik, dan alkohol. Untuk bahan-bahan kimia sterilan lebih lengkapnya bisa dilihat di lampiran 1. Masalah yang sering mengganggu dalam pekerjaan in vitro adalah membuat dan menjaga kondisi aseptik, baik kondisi lingkungan maupun kondisi eksplannya. Oleh karena itu bila memindah-tanamkan bagian tanaman dari satu wadah ke wadah yang lain, jangan menyentuh permukaan bagian dalam dari wadah dengan tangan atau bagian alat yang tidak steril (Wetherell 1982). Menurut Gunawan (1987), setiap bahan tanaman mempunyai tingkat kontaminasi permukaan yang berbeda, tergantung dari : 1. Jenis tanamannya. 2. Bagian tanaman yang dipergunakan. 3. Morfologi permukaan (misalnya berbulu atau tidak). 4. Lingkungan tumbuhnya (Green house atau lapang). 5. Musim waktu mengambil (musim hujan atau kemarau). 6. Umur tanaman (seedling atau tanaman dewasa). 7. Kondisi tanamannya (sehat atau sakit).

27 III. METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Unit Kultur Jaringan Laboratorium Konservasi Tumbuhan, Departemen Konservasi Sumberdaya Hutan dan Ekowisata, Fakultas Kehutanan, Institut Pertanian Bogor. Pengambilan data primer dilakukan selama enam bulan dari bulan September 2006 sampai Februari Bahan dan Alat Penelitian Bahan a. Bahan Media Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media MS lengkap (Murashige dan Skoog) dan 1/2MS yang telah dimodifikasi dengan penambahan vitamin, asam amino dan sukrosa. Media 1/2MS adalah media MS yang jumlah konsentrasi penggunaanya setengah dari jumlah konsentrasi yang sebenarnya, kecuali jumlah agar dan gula (sukrosa) dalam satu liter. b. Bahan Eksplan Bahan eksplan yang digunakan adalah daun tumbuhan anggrek kuping gajah (Bulbophyllum beccarii Rchb.f) dari tanaman koleksi pribadi Bapak Ir. Edhi Sandra, MSi. c. Bahan Sterilisasi Bahan sterilisasi yang digunakan adalah alkohol 70%, HgCl 2 0,01%, bayclin 25%, 15%, 10%, 5%, bakterisida, fungisida, antibiotik, betadin, dan air steril Alat-alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi botol kultur, alumunium foil, petridish, pembakar spiritus, pisau, scalpel, pinset, gelas piala, erlenmayer, pipet, Ph meter, autoklaf, neraca analitik, stirer, laminar air flow cabinet, oven, plastik, sprayer, karet, dan ruang kultur.

28 Jenis Data Data Sekunder Data sekunder dalam penelitian ini didapatkan melalui studi pustaka dari berbagai literatur. Data sekunder tersebut meliputi data sosok anggrek kuping gajah, kultur jaringan, bahan sterilisasi, dan zat pengatur tumbuh Data Primer Data primer dalam penelitian ini yaitu pengaruh perlakuan sterilisasi terhadap eksplan dan pertumbuhan eksplan. 3.4 Pelaksanaan Penelitian Sterilisasi a. Sterilisasi Lingkungan Kerja (Alat Penabur) Sebelum digunakan, laminar air flow cabinet harus disterilkan dengan menggunakan hand sprayer berisi alkohol 70%. Setelah laminar air flow cabinet disemprot, kemudian dibiarkan terlebih dahulu ± 10 menit, baru kemudian boleh digunakan. b. Sterilisasi Alat-alat dan Media Kultur Alat-alat dissecting-set dan glass ware yang akan digunakan untuk kultur jaringan, setelah dicuci dan dikeringkan kemudian dibungkus dengan kertas koran dan disterilisasi di dalam autoklaf dengan suhu C, tekanan psi, lama sterilisasi menit. Botol-botol eksplan yang sudah berisi media kemudian disterilisasi. Sterilisasi media lebih sedikit waktunya, yaitu menit tetapi suhu dan tekanannya sama. c. Sterilisasi Air Air steril berasal dari air ledeng, tetapi harus diendapkan kotorannya terlebih dahulu. Kemudian air tersebut dimasukkan kedalam botol kultur kosong sesuai kebutuhan dan ditutup. Setelah itu diautoklaf dengan suhu C, tekanan psi, lama sterilisasi menit. d. Sterilisasi eksplan Perlakuan sterilisasi eksplan yang digunakan terdiri dari 11 macam. Sebelum dilakukan perlakuan sterilisasi, bahan eksplan dicuci bersih dengan air

29 18 ledeng. Kemudian dibersihkan dengan deterjen (rinso) sambil digosok menggunakan spon, lalu dicuci lagi dengan air ledeng. Setelah itu daun dibilas lagi dengan air steril satu kali. Pencucian ini dilakukan diluar laminar air flow cabinet. Selanjutnya, dilakukan sterilisasi pada eksplan menggunakan bahan sterilan di dalam laminar air flow cabinet dengan macam perlakuan sebagai berikut: 1. Pada perlakuan ini eksplan yang sudah dicuci kemudian langsung dilakukan proses penanaman. Hal ini dilakukan sebagai kontrol atau perbandingan hasil dengan perlakuan sterilsasi menggunakam bahan kimia sterilan. 2. Daun direndam dalam larutan bakterisida + fungisida 500 mg/l selama 30 menit, lalu dibilas dengan air steril satu kali. Kemudian daun direndam dalam larutan bayclin 10% selama 10 menit, lalu dibilas dengan air steril satu kali. Terakhir, daun direndam dalam larutan alkohol 70% selama 5 menit, lalu dibilas dengan air steril empat kali. 3. Daun direndam dalam larutan bakterisida + fungisida 500 mg/l selama 30 menit, lalu dibilas dengan air steril satu kali. Kemudian daun direndam dalam larutan bayclin 10% selama 7 menit, lalu dibilas dengan air steril satu kali. Terakhir, daun direndam dalam larutan alkohol 70% selama 1 menit, lalu dibilas dengan air steril empat kali 4. Daun direndam dalam larutan antibiotik sebanyak 500 mg/l selama 4 jam, lalu dibilas dengan air steril satu kali. Kemudian daun direndam dalam larutan alkohol 70% selama 7 menit, lalu dibilas dengan air steril empat kali. 5. Daun direndam dalam larutan bayclin 25% selama 7 menit, lalu dibilas dengan air steril satu kali. Kemudian daun direndam dalam larutan bayclin 20% selama 7 menit, lalu dibilas dengan air steril satu kali. Terakhir, daun direndam dalam larutan bayclin 10% selama 7 menit, lalu dibilas air steril empat kali. 6. Daun direndam dalam larutan bayclin 25% selama 7 menit, lalu dibilas dengan air steril satu kali. Kemudian daun direndam dalam larutan bayclin 20% selama 7 menit, lalu dibilas dengan air steril satu kali. Terakhir, daun

30 19 direndam dalam larutan bayclin 5% selama 7 menit, lalu dibilas air steril empat kali. 7. Daun direndam dalam larutan HgCl % selama 10 menit, lalu dibilas dengan air steril empat kali. 8. Daun direndam dalam larutan HgCl % selama 5 menit, lalu dibilas dengan air steril satu kali. Kemudian daun direndam dalam larutan bayclin 10% selama 10 menit, lalu dibilas dengan air steril satu kali. Terakhir, daun direndam dalam larutan bayclin 10% selama 5 menit, lalu dibilas air steril empat kali. 9. Daun direndam dalam larutan HgCl % selama 5 menit, lalu dibilas dengan air steril satu kali. Kemudian daun direndam dalam larutan bayclin 10% selama 7 menit, lalu dibilas dengan air steril satu kali. Terakhir, daun direndam dalam larutan bayclin 10% selama 5 menit, lalu dibilas air steril empat kali. 10. Daun direndam dalam larutan HgCl % selama 1 menit, lalu dibilas dengan air steril satu kali. Kemudian daun direndam dalam larutan bayclin 10% selama 7 menit, lalu dibilas dengan air steril satu kali. Terakhir, daun direndam dalam larutan bayclin 10% selama 2 menit, lalu dibilas air steril empat kali. 11. Daun direndam dalam larutan HgCl % selama 1 menit, lalu dibilas dengan air steril tiga kali. Kemudian daun direndam dalam larutan bayclin 10% selama 7 menit, lalu dibilas dengan air steril tiga kali. Terakhir, daun direndam dalam larutan bayclin 10% selama 5 menit, lalu dibilas air steril tiga kali. Dari ke sebelas perlakuan sterilisasi tersebut, beberapa perlakuan sterilisasi dilakukan dalam waktu yang tidak serentak atau terpisah. Hal ini berkaitan dengan proses penanaman yang tidak mungkin dilakukan semuanya dalam satu waktu Pembuatan Media Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media MS lengkap dan 1/2MS (Murashige dan Skoog) dengan ZPT dan tanpa ZPT. Langkah awal adalah dengan pembuatan larutan induk (stok) yang terdiri dari larutan induk makro,

31 20 larutan induk mikro, larutan vitamin dan larutan induk Fe-EDTA (lampiran 2). Pembuatan larutan induk (stok) bertujuan untuk efisiensi waktu dan kemudahan pekerjan. Adapun tahapan dalam pembuatan media MS lengkap dalam satu liter air adalah sebagai berikut : 1. Menyiapkan air 500 ml dalam gelas piala volume 1000 ml. 2. Menambahkan larutan stock yang sudah disiapkan ke dalam gelas piala. Terdiri dari larutan A sebanyak 20 ml, larutan B sebanyak 20 ml, larutan C sebanyak 5 ml, larutan D sebanyak 5 ml, larutan E sebanyak 5 ml, larutan F sebanyak 5 ml, vitamin sebanyak 5 ml, dan Myo-inositol sebanyak 10 ml. Sedangkan untuk media 1/2MS, terdiri dari larutan A sebanyak 10 ml, larutan B sebanyak 10 ml, larutan C sebanyak 2.5 ml, larutan D sebanyak 2.5 ml, larutan E sebanyak 2.5 ml, larutan F sebanyak 2.5 ml, vitamin sebanyak 2.5 ml, dan Myo-inositol sebanyak 5 ml. Media 1/2MS hanya berbeda dalam jumlah larutan stock yang dimasukan. 3. Menimbang dan memasukkan 30 gram gula pasir. 4. Menambahkan volume larutan mendekati 1000 ml. Kemudian mengukur ph pada kisaran , bila terlalu asam ditambah NaOH dan bila terlalu basa ditambah HCl. 5. Menimbang dan memasukankan agar-agar sebanyak 7 gram, lalu dipanaskan sambil diaduk dengan stirer. 6. Menuangkan media ke dalam botol sebanyak ± 20 ml, kemudian tutup dengan tutup botol plastik. 7. Tahapan terakhir adalah mensterilkan media dalam autoklaf dengan suhu C, tekanan psi selama 20 menit. Lalu, media didinginkan dan disimpan dalam ruangan inkubasi. Media baru bisa dipakai minimal setelah 3 hari untuk mengetahui ada tidaknya kontaminansi. Skema pembuatan media MS dapat dilihat di lampiran Untuk media yang menggunakan zat pengatur tumbuh sebelum dituangkan ke dalam botol, media ditambahkan 2.4-D sebanyak 2 mg/l dan NAA sebanyak 0.5 mg/l.