UJI ENDOTOKSIN. Marlia Singgih Wibowo. School of Pharmacy ITB

Transkripsi

1 UJI ENDOTOKSIN Marlia Singgih Wibowo School of Pharmacy ITB

2 Pendahuluan Produk alat kesehatan Kontaminasi bakteri Bakteri gram negatif Kualitas produk farmasi dari aspek mikrobiologi

3 Pendahuluan Produk farmasi parenteral Produk-produk farmasi parenteral harus steril karena pemberian langsung ke sistem sirkulasi pembuluh darah. Salah satu tahap : Sterilisasi Produk parenteral terkadang terkontaminasi oleh ENDOTOKSIN

4 Bagaimana produk parenteral dapat terkontaminasi endotoksin? Pada proses sterilisasi produk parenteral (menggunakan panas), bakteri gram negatif yang mungkin ada dalam produk, akan mati dan lisis terjadi, endotoksin akan terlepas dan tetap tinggal di dalam produk Sifatnya stabil terhadap panas (heat-stable)

5 Endotoksin dan Pirogen Endotoksin adalah toksin yang dihasilkan oleh bakteri gram negatif Pirogen adalah senyawa yang menyebabkan kenaikan suhu tubuh akibat penggunaan produk farmasi yang diberikan secara intravena Semua endotoksin bersifat pirogen, tetapi tidak semua senyawa pirogen itu merupakan endotoksin Endotoksin bakteri terdiri dari Lipopolisakarida (LPS), umumnya terikat pada protein dan fosfolipid. LPS ini menyusun membran luar bakteri gram negatif.

6 Struktur LPS Contoh : LPS dari Salmonella terdiri dari bagian Lipid A yang hidrofob yang terikat pada suatu daerah inti yang mengandung molekul KDO (2-keto-3- deoksioktonat)

7 Struktur LPS Salmonella Mannose-Abequose Rantai samping Rhamnose Galactose n Glucose-N-acetylglucosamine Galactose Glucose-Galactose Inti polisakarida Heptulose Heptulose-P-P-Ethanolamine KDO KDO-KDO-P-Ethanolamine P-GlcN-GlcN-P Lipid A

8 Efek endotoksin bagi tubuh demam aktivasi sistem sitokin rusaknya sel-sel endotelial permeabilitas pembuluh darah berubah sehingga menyebabkan turunnya tekanan darah dll.

9 Perkembangan regulasi tentang uji pirogen Bacterial endotoxin test (BET) merupakan salah satu uji yang penting terhadap produk parenteral dan alat kesehatan 1912 : uji pirogen dilakukan dengan metode kelinci (Rabbit test) Digunakan dalam USP XII pada tahun 1942 sampai 40 tahun kemudian 1980 : metode baru diterapkan yaitu Limulus amoebocyte lysate (LAL) test

10 LAL-test The Limulus amebocyte lysate (LAL) test adalah uji in vitro untuk deteksi dan analisis kuantitatif endotoksin bakteri. Metode analisis LAL yang dilakukan mencakup teknik gel-clot dan turbidimetri kinetik dan kromogenik (kolorimetri)

11 Mengapa LAL test? Limulus amebocyte lysate (LAL) test adalah metode alternatif terhadap rabbit pyrogen test yang difokuskan pada deteksi senyawa pirogen dalam produk, untuk menghindari penggunaan hewan/binatang dalam percobaan Metode lebih akurat

12 Limulus amebocyte lysate Lisat diperoleh dari amubosit kepiting landam kuda (Limulus polyphemus) Penggunaan LAL untuk deteksi endotoksin berawal dari pengamatan Bang (1956) bahwa infeksi bakteri gram negatif pada Limulus polyphemus menyebabkan koagulasi intravaskular yang parah. Th 1964, Levin and Bang kemudian menunjukkan bahwa penggumpalan itu merupakan hasil reaksi antara endotoksin dan protein yang dapat menggumpal dalam amubosit.

13 Solum (1970, 1973) dan Young (1972), melakukan pemurnian dan karaterisasi protein yang dapat bergumpal dari reaksi LAL dan menunjukkan bahwa reaksi dengan endotoksin merupakan reaksi enzimatik.

14 Limulus polyphemus (horseshoe crab)

15 Horseshoe crab African Wolf Spider

16 Cara memperoleh lysate Untuk memperoleh LAL, horseshoe crabs yang berukuran besar ditangkap, cek kesehatannya, lalu darahnya diambil dengan menggunakan jarum suntik. Darah kepiting ini lalu disentrifuga untuk memisahkan amoebocytes dari plasma cairnya. Amoebocyte lalu di freeze-dried dan diproses untuk digunakan. Harganya : One quart of LAL is worth $15,000! Tiga perusahaan USA : Associates of Cape Cod: Cambrex: Charles River Endosafe:

17 Metode LAL yang direkomendasi oleh FDA USA Metode Gel-Clot : prinsip bahwa LAL menggumpal dengan adanya endotoksin Metode kinetik turbidimetri : menggunakan kecepatan pembentukan gel untuk menentukan kandungan endotoksin Metode Kromogenik : menggunakan substrat kromogenik sintetik, dengan adanya LAL dan endotoksin, menghasilkan warna kuning dan secara linier ekuivalen dengan konsentrasi endotoksin yang ada

18 LAL Chromogenic endotoxin assay utilizes a modified Limulus Amoebocyte Lysate and a synthetic color-producing substrate to detect endotoxin presence. This assay is quantitative and the color intensity developed upon addition of the sample to the LAL supplied with the kit is proportional to the amount of endotoxin present in the sample and can be calculated from a standard curve. The kinetic chromogenic quantitative assay for bacterial endotoxin can be performed at the low assay range (0-5 EU/ml) or the higher range (5-50 EU/ml)

19 Metode kromogenik ada 2 : End point chromogenic Kinetic chromogenic Pemilihan metode tergantung pada penggunaan, volume uji, dan tipe produk

20 Prinsip LAL test Uji LAL memanfaatkan dasar respon imun dari kepiting landam kuda terhadap invasi bakteri gram negatif. Bahan-bahan yang terkandung dalam amubosit kepiting landam kuda terdiri dari berbagai protein, faktor, kofaktor dan ion-ion yang berinteraksi menyebabkan koagulasi Endotoksin Gram negatif mengkatalisis aktivasi proenzim dalam lisat amubosit Limulus. Kecepatan awal aktivasi ditentukan oleh konsentrasi endotoksin

21 Selanjutnya enzim yang diaktivasi (enzim koagulase) menghidrolisis ikatan spesifik dalam suatu protein penggumpal (koagulogen) yang juga terdapat pada lisat amubosit Limulus menghasilkan koagulin. Sekali terhidrolisis, koagulin yang dihasilkan bergabung dengan sendirinya dan membentuk suatu gumpalan/bekuan seperti gel

22 Skema reaksi enzimatik pada penggumpalan LAL Jalur alternatif ANTI FAKTOR G ENDOTOKSIN FAKTOR G FAKTOR G YG DIAKTIVASI FAKTOR C FAKTOR C YG DIAKTIVASI FAKTOR B FAKTOR B YG DIAKTIVASI PROCLOTTING ENZYME CLOTTING ENZYME KOAGULOGEN KOAGULIN (GEL)

23 Penetapan batas endotoksin 1983 : FDA menentukan batas endotoksin berdasarkan dosis maksimum sediaan obat untuk manusia atau kelinci dan penyesuaian batas endotoksin untuk semua obat (kecuali intratekal) dari 2,5 EU kg -1 sampai 5,0 EU kg -1 EU = Endotoxin Unit

24 Batas deteksi untuk beberapa produk diperoleh dari monografi USP atau EP. Kalau tidak dinyatakan dalam farmakope, batas endotoksin harus dihitung dari dosis maksimum manusia

25 CALCULATION and MEASUREMENT

26 Beberapa istilah lain untuk batas deteksi endotoksin EL: Endotoksin Limit MAEC (maximum allowable endotoxin concentration) ERL (endotoxin release limit) ELC (endotoxin limit concentration)

27 EL = K/M K = konstanta = 5 EU atau IU per kg berat badan, M = dosis maksimum untuk manusia per kg per jam. Umumnya dinyatakan sbb : Batas endotoksin untuk berat badan rata2 70 kg = 350 EU per jam (5 EU kg-1)

28 Batas endotoksin vs volume sediaan per jam Harus diperhatikan bahwa batas endotoksin dinyatakan per jam. Oleh karena itu konsentrasi yang dibolehkan untuk endotoksin per mililiter injeksi beragam tergantung pada volume pemberian dalam satu jam. Suatu dosis tunggal injeksi 1 ml secara teoritis mengandung 349 EU per ml dan masih diijinkan pada uji endotoksin bakteri, sedangkan infus dengan volume 1 L harus mengandung kurang dari 0,349 EU per ml

29 Perhitungan MVD dan MVC MVD = Maximum Valid Dilution (pengenceran maksimum) MVC = Minimum Valid Concentration (konsentrasi minimum) MVD dan MVC adalah perhitungan yang menunjukkan seberapa banyak pengenceran yang harus dilakukan untuk mengatasi kemungkinan interferensi, sebelum efek pengenceran melampaui kemampuan uji LAL yang digunakan untuk mendeteksi endotoksin dalam sediaan asli

30 Kapan digunakan istilah MVD? MVD biasanya digunakan untuk sediaan yang berbentuk cairan dimana pemberian dinyatakan dalam per mililiter, contoh: dosis tunggal injeksi 2 ml dan batas endotoksin dinyatakan dalam EU ml-1

31 Kapan digunakan istilah MVC? MVC biasanya digunakan untuk sediaan dengan batas endotoksin dinyatakan dengan EU mg-1 dan dosis dinyatakan dengan mg/ kg bb.

32 Penentuan MVD dan MVC tergantung pada sensitivitas lisat yang digunakan (λ). Semakin sensitif lisat atau metoda, semakin tinggi MVD atau semakin rendah MVC

33 Perhitungan MVC MVC = λ M λ = sensitifitas dari lisat yaitu nilai terkecil dari standar untuk pengujian kuantitatif K= konstanta = 0,5 EU kg-1 M= dosis maksimum manusia K

34 Perhitungan MVD MVD = C x K λ x M C = konsentrasi obat K = konstanta = 0,5 EU kg-1 M= dosis maksimum manusia

35 Contoh Potensi injeksi insulin 100 unit per ml, dosis maksimum 2 unit per kg dan sensitivitas lisat 0,125 unit/ml, maka MVD = 100x 5 = 1: ,125 x 2 Nilai MVD dapat diperoleh dari MVC MVD = potensi sediaan/mvc

36 LAL test untuk alat kesehatan Kadar endotoksin pada alat kesehatan diperoleh dengan prosedur ekstraksi, yaitu dengan cara merendam sejumlah alat pada cairan pengekstraksi biasanya pereaksi air LAL. Nilai batas 20 EU per alat dinyatakan dalam addendum USP 1997, jadi batas maksimum konsentrasi endotoksin yang diijinkan dalam cairan hasil ekstraksi (ERL) dihitung dengan rumus: ERL = K x N/V K = 20 EU, N = jumlah alat dan V = total volume larutan ekstraksi

37 Metode Gel-Clot Pada metode ini, hasil akhir dapat dideteksi berupa spot pada slide, atau microplate Perlu pembanding, berupa Control Standard Endotoxin (CSE) Peralatan gelas yang digunakan harus di de-pirogenasi

38 Prinsip uji dan prosedur 100 ul CSE dimasukkan ke dalam tabung gelas depirogen (positive control) LAL reagent water (negative control) Sampel jumlah sama ul lysate Inkubasi 37 C di atas penangas air selama 1 jam Tabung lalu dibalik perlahan (180 ) untuk melihat solid clot yang terjadi

39 Hal yang harus diperhatikan dalam metode gel-clot Untuk membuat alat-alat depirogen : pemanasan pada 180 C, selama 4 jam atau 250 C selama 30 menit Teknik pengerjaan pada saat membalik tabung kira-kira selama 2 detik ph sampel 7,0 8,0. Jika diperlukan ph diatur menggunakan asam atau basa depirogen

40 Sensitivitas Lisat pada Gel-Clot Diperlukan untuk menentukan konsentrasi minimum endotoksin yang menyebabkan terjadinya gel Satuan dinyatakan dalam EU atau IU Dibuat 1 seri pengenceran endotoksin (dalam EU/mL) dan percobaan dilakukan rangkap 4 (quadruplicate) Titik akhir pengenceran (end-point dilution) ditentukan pada pengenceran terakhir yang masih memberikan reaksi positif

41 Metode kromogenik Metode kromogenik merupakan metode LAL test yang paling banyak digunakan saat ini karena lebih mudah dan murah Sesuai untuk jumlah produk yang diuji tidak banyak dan tidak sering (infrequent) Digunakan untuk uji sampel serum pada uji klinis

42 Prinsip uji dan prosedur Endotoksin akan mengkatalisis aktivasi suatu proenzim Enzim yang teraktivasi akan mengkatalisis terpecahnya PNA dari substrat Ac-Ile-Glu- Ala-Arg-PNA PNA yang dilepaskan diukur secara spektrofotometri pada 405 nm Nilai absorbans sebanding dengan jumlah endotoksin, dibandingkan terhadap endotoksin standard menggunakan kurva standard

43 New Discoveries Alternatif thp LAL saat ini telah berhasil diteliti di India dan China, yaitu pereaksital, or Tachypleus amoebocyte lysate, fungsinya mirip dengan LAL, juga untuk deteksi gram-negative bacteria. Scientists di Singapore tengah meneliti cloning gene pendeteksi toxin dalam darah horseshoe crab. Jika gen tsb dapat di klon derivat LAL dapat dibuat tanpa harus menggunakan horseshoe crabs untuk ekstraksi darahnya.

44

45