III. BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini berlangsung dari bulan September 2006 hingga bulan September 2007. Pelaksanaan penelitian ini bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Laboratorium Biologi Tanah Faperta, Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis PPSHB, dan Rumah pengomposan Cikabayan, Departemen Biologi FMIPA IPB, Bogor. 3.2 Alat dan Bahan Peralatan yang dipergunakan dalam penelitian ini meliputi peralatan dalam isolasi bakteri selulolitik, produksi enzim selulase, xilanase, pengomposan, analisa kandungan karbon organik, nitrogen (N-total dan N-NH 4 ), unsur hara makro dan mikro, suhu, ph-h 2 O serta oven untuk penentuan bobot sisa, laju dekomposisi (R). Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel tanah, jerami padi, media CMC, avicel, kertas saring Whatman No.1, NaCl 2.0 M, merah kongo 0.1%, media xilan 0.75%, asam dinitro salisilat (DNS), glukosa, bufer fosfat ph 6.5, dan bahan dalam analisa C organik, N-total, N-NH + 4, ph-h 2 O, hara makro-mikro serta penentuan laju dekomposisi. 3.3. Metode Penelitian 3.3.1 Isolasi dan seleksi bakteri selulolitik Bakteri selulolitik diisolasi dari lahan pertanian di daerah Jawa Barat dan Jawa Tengah (Lampiran 1). Metode pengambilan sampel tanah dilakukan dengan cara mengambil sampel tanah pada ke dalaman 10-20 cm. Sampel tanah yang diambil merupakan sampel komposit, kemudian dimasukan dalam wadah plastik gelap berlabel. Isolasi bakteri selulolitik dilakukan dengan cara membuat serangkaian pengenceran dari sampel tanah. Dari pengenceran berseri tersebut dilakukan metode cawan sebar pada media agar-agar CMC. Koloni-koloni yang ditumbuhkan selama 24-48 jam pada suhu 30 o C dimurnikan. Terhadap biakan murni yang diperoleh dilakukan uji kualitatif aktivitas selulolitik dengan cara melihat kemampuan pembentukan zona jernih. Dari masing-
12 masing isolat yang membentuk zona jernih juga diukur nisbah selulolitik dengan rumus perhitungan: R = diameter zona diameter koloni diameter koloni Hasil isolat bakteri selulotik yang menunjukkan nilai nisbah terbesar dilanjutkan dengan uji aktivitas kemampuan produksi enzim selulase pada tiga substrat selulosa berbeda untuk melihat kompleksitas isolat bakteri dalam degradasi substrat selulosa. Isolat-isolat yang memiliki kemampuan degradasi baik dilakukan peremajaan pada media agar miring untuk aplikasi lebih lanjut (Cappucino dan Sherman 2001). 3.3.2 Produksi selulase Isolat bakteri selulase potensial ditumbuhkan pada media agar-agar CMC dengan komposisi per liter: CMC 10 g, CaCl 2 0.04 g, FeSO. 4 7H 2 O 0.02 g, glukosa 0.1%, KNO 3 0.11 g, K 2 HPO 4 0.02 g, ekstrak khamir 2.0 g, agar-agar 1.5%. Pengkulturan isolat dilakukan selama 48 jam pada suhu 30 o C. Sebanyak 1-2 loop bakteri diinokulasi dalam 100 ml media CMC cair selama 5 sampai 7 hari pada suhu ruang. Hasil kultur disentrifugasi pada kecepatan 12298 x g selama 15 menit untuk memperoleh ekstrak kasar untuk analisa aktivitas enzim selulase (Heck et al. 2002). 3.3.3 Pengujian aktivitas enzim Aktivitas selulase dilakukan pada ketiga jenis enzim yaitu aktivitas CMC-ase, avicelase, FP-ase. Aktivitas CMC-ase diukur dengan cara menambahkan larutan enzim sebanyak 1 ml dalam 1 ml substrat CMC 1.0% dalam bufer fosfat 0.2 M ph 6.5. Penentuan aktivitas avicelase dilakukan dengan cara menambahkan larutan enzim sebanyak 2 ml dalam 2 ml substrat avicel dalam bufer fosfat 0,2 M ph 6.5. FP-ase ditentukan dengan menambahkan sebanyak 1 ml larutan enzim ke dalam 0.5 g kertas saring Whatman No.1 (1 x 6 cm 2 ) dalam bufer fosfat ph 6.5. Inkubasi dilakukan pada suhu 50 o C selama 60 menit (Silva et al. 2005; Alam et al. 2004). Jumlah gula yang diproduksi dalam supernatan ditentukan dengan metode asam dinitro salisilat (DNS) dengan glukosa sebagai standar (Miller 1959). Aktivitas selulase dinyatakan sebagai jumlah glukosa yang dilepas dalam µg ml -1 dari enzim kasar/menit (U ml -1 ). Pengukuran aktivitas masing-masing larutan diukur
13 menggunakan spektrofotometer pada λ = 540 nm. Perhitungan aktivitas selulase dihitung berdasarkan rumus: Aktivitas selulase (U/ml) = (CX sampel CX kontrol) x Fp x 1000 berat molekul glukosa x waktu Keterangan : CX = kadar selulosa dan FP = faktor pengenceran 3.3.4 Produksi Streptomyces sebagai inokulan Isolat Streptomyces sp 234P-16 dan 45I-3 diremajakan dalam media agaragar xilan (ekstrak khamir 1.0%, sukrosa 10.3%, dan 0.5% birchwood xylan, agaragar 1.5%), inkubasi dilakukan selama 7-14 hari pada suhu 30 o C sampai terbentuk spora. Sebanyak 2 loop (berdiameter 1 cm) kultur Streptomyces sp 234P-16 dan 45I-3 diinokulasikan ke dalam 100 ml media cair xilan dalam Erlenmenyer 500 ml. Inkubasi dilakukan pada inkubator bergoyang dengan agitasi 150 rpm pada suhu 30 o C selama 5 hari (Fahrurrozi 2007; Prihandono 2007). 3.3.5 Dekomposisi substrat Substrat yang digunakan adalah jerami padi. Preparasi substrat dilakukan dengan mencacah bagian batang dan daun yang segar dengan ukuran 2-5 cm (Mishra et al. 2001; Devevre dan Horwath 2000). Kemudian substrat dimasukkan dalam kantong plastik dan disterilisasi menggunakan otoklaf pada suhu 121 o C selama 30 menit. Banyaknya substrat yang digunakan adalah 3.0 kg/sampel. Empat kombinasi isolat bakteri yang meliputi: C4-4 + xilanolitik (A), C5-1 + xilanolitik (B), C11-1 + xilanolitik (C), 45I-3 + 234P-16 (D) serta kontrol (E, tanpa bakteri) digunakan sebagai kombinasi inokulan dalam dekomposisi jerami padi. Dekomposisi substrat dilakukan selama 6 minggu. Pengukuran parameter dekomposisi dilakukan dalam selang waktu (0, 1, 2, 3, 4, 5, dan 6 minggu). 3.3.6 Pengukuran C-organik dan N-total substrat Kandungan C organik substrat diukur menggunakan metode Walkey dan Black dengan cara sebagai berikut: sebanyak 1.0 g substrat kering udara dimasukkan dalam labu ukur 100 ml dan ditambahkan 10 ml K 2 Cr 2 O 7 1.0 N serta H 2 SO 4 pekat. Pengocokan larutan dilakukan diatas kain flanel yang sedikit basah dan lunak selama 10 menit, jika warna larutan masih hijau ditambahkan lagi larutan
14 K 2 Cr 2 O 7 dan H 2 SO 4 pekat serta dicatat banyaknya penambahan. Pendinginan dilakukan sebelum ditepatkan dengan akuades dan dikocok kembali serta didiamkan selama 24 jam. Cairan yang jernih dipipet sebanyak 10 ml dan dimasukkan ke dalam Erlenmenyer 50 ml, ditambahkan 1 ml H 3 PO 4 pekat dan 2-3 tetes indikator difenilamin. Titrasi larutan menggunakan FeSO. 4 7H 2 O sebagai standar demikian pula halnya terhadap blanko (Teklay dan Malmer 2004; Nelson dan Sommers 1982). Kandungan C-organik substrat dihitung menggunakan rumus perhitungan sebagai berikut: % C-organik = ( vol sampel vol blanko) x 100 x 12 x 100 x 100 % berat substrat (g) 10 4 77 Penetapan N-total substrat menggunakan metode Mikro Kjeldahl dengan cara memasukan sebanyak 1.0 g substrat ke dalam labu Kjeldahl. Ke dalam labu tersebut ditambahkan 0.5 1.0 g katalis campuran selenium dan 3-5 ml H 2 SO 4 pekat. Larutan dipanaskan sampai seluruhnya terdenaturasi (± 2 jam), kemudian didinginkan serta ditambahkan akuades hingga volume menjadi 100 ml. Larutan dipipet sebanyak 10 ml dan dimasukkan ke dalam labu distilasi serta ditambahkan NaOH 40%. Larutan penampung yang terdiri atas 15 ml larutan H 3 BO 3 2.0% dan 3-5 tetes indikator campuran dalam labu Erlenmenyer 100 ml, diusahakan supaya tidak ada gas yang keluar. Distilasi dihentikan apabila larutan penampung sudah menunjukkan warna hijau (sekitar 15 menit). Larutan dititrasi dengan H 2 SO 4 standar dan dicatat volume titernya, demikian halnya terhadap perlakuan blanko (Tores et al. 2005; AOAC 1984). Kandungan N-total substrat dihitung menggunakan rumus perhitungan sebagai berikut: % N = 100/10 x (ml sampel ml blanko) x 0,014 x 100 % berat substrat (g) 3.3.7 Parameter Dekomposisi Beberapa parameter yang diamati dalam menilai dekomposisi substrat yang berasal dari jerami padi yaitu nisbah C/N, berat sisa substrat, dan laju dekomposisi. Berat sisa substrat di estimasi dengan persamaan sebagai berikut : Berat sisa (%) = (W i W d )/W i x 100 Keterangan: W i = massa kering awal substrat, W d = massa kering akhir substrat
15 Perhitungan terhadap laju dekomposisi (R) dan konstanta (k) di hitung berdasarkan rumus (Sangha et al. 2006; Fioretto et al. 2005; Uchida et al. 2005): R = Xo Xt Xt x t Ln (X t /X 0 = -k t Keterangan: X o = massa awal substrat (g) X t = massa tersisa substrat (g) t = waktu (bulan) k = laju dekomposisi (Fioretto et al. 2005; Uchida et al. 2005). Peubah-peubah yang diamati dalam dekomposisi substrat jerami padi dengan menggunakan bakteri selulolitik dan xilanolitik sebagai berikut: pengamatan harian meliputi perubahan suhu yang diukur pada siang hari dengan termometer. Pada minggu ke-0, 1, 2, 3, 4, 5, dan 6 dilakukan analisa terhadap kadar C-organik dengan metode Walkey dan Black, N-total dan N-NH 4 dengan metode Mikro Kjeldahl, dan ph-h 2 O dengan ph meter. Analisa akhir dilakukan untuk menilai kematangan substrat yang meliputi pengukuran unsur hara makro dan mikro (N, P, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, dan Mn). Terhadap unsur Ca, Mg, Fe, Cu dan Mn ditentukan dengan AAS (Atomic Absorption Spectroscopy), K menggunakan flame fotometer dan P dengan metode spektrofotometer. Penentuan berat sisa, laju dekomposisi serta kondisi fisik substrat yang terjadi ditentukan pada akhir dekomposisi.