BAB III BAHAN DAN METODE 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini terdiri dari dua tahap, tahap pertama dilaksanakan di laboratorium bioteknologi Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Unpad, tahap kedua dilaksanakan di hatchery kelompok pembudidaya ikan mas koki Kelapa Ciung Kecamatan Cimalaka, Sumedang. Penelitian ini dilaksanakan yaitu pada bulan April 2013 sampai dengan Juni 2013. 3.2 Alat dan Bahan Penelitian 3.2.1 Alat Penelitian Alat-alat penelitian yang digunakan dalam pelaksanaan penelitian ini adalah : 1. Akuarium ukuran 30 cm x 45 cm x 50 cm sebanyak 15 buah sebagai wadah dalam pemeliharaan hewan uji. 2. Akuarium ukuran 90 cm x 45 cm x 50 cm sebanyak 3 buah sebagai wadah pembuatan bioflok. 3. Blower dan selang aerasi sebagai alat penyuplai oksigen pada media kultur. 4. Timbangan digital dengan ketelitian 0,01 gram. 5. Gelas ukur untuk mengukur air yang digunakan dan bioflok yang akan digunakan. 6. Termometer untuk mengukur suhu selama penelitian. 7. ph meter untuk mengukur derajat keasaman. 8. DO meter untuk mengukur kadar oksigen terlarut dalam air. 9. Tabung Erlenmeyer untuk wadah media agar. 10. Tabung reaksi untuk menyimpan bakteri. 11. Hot plate dan stirrer untuk pemanasan media agar. 12. Autoclave dengan tekanan 1 atm pada suhu 121ºC untuk mensterilkan alat dan media agar.
13. Petridish untuk wadah media agar tempat kultur bakteri. 14. Bunsen untuk menciptakan kondisi steril pada saat kultur bakteri. 15. Mikro pipet dengan ketelitian 0,01 µl. 16. Inkubator untuk menginkubasi bakteri dalam suhu yang terkontrol. 17. Kapas untuk menutup tabung reaksi tempat menyimpan bakteri agar tidak terkontaminasi. 18. Jarum ose untuk mengambil dan menginokulasi bakteri. 19. Kertas alumunium foil untuk menutup Erlenmeyer saat pemanasan media agar. 20. Spektrofotometer untuk mengukur kepadatan bakteri. 21. Plankton net untuk menyaring sampel plankton. 22. Gayung dengan volume 1 L untuk mengambil media bioflok. 23. Jarum suntik untuk penginfeksian bakteri Aeromonas hydrophila. 24. Mikroskop cahaya untuk mengamati plankton. 25. Erlenmeyer untuk wadah pembuatan media agar. 26. Serok kain kasa untuk mengambil ikan dalam wadah. 27. Kamera digital untuk mendokumentasikan selama penelitian berlangsung. 3.2.2 Bahan Penelitian Bahan-bahan penelitian yang digunakan dalam pelaksanaan penelitian ini adalah : 1. Benih ikan mas koki jenis tosa sebanyak 225 ekor ukuran 5 cm dengan berat ±15 gram per ekor digunakan sebagai hewan uji. 2. Agen bakteri dengan merk dagang EM4 digunakan dalam pembuatan bioflok, EM4 yang diaktivasi sebanyak 100 ml. 3. Pakan ikan mas koki berupa pellet terapung dengan merk dagang PF- 600 dengan kandungan protein 39 %. 4. Molase digunakan dalam pembuatan media bioflok sebagai penambah kandungan karbon.
5. Bakteri Aeromonas hydrophila yang didapat dari Sempur, Bogor digunakan sebagai penginfeksi hewan uji yang diberikan melalui media pemeliharaan. 6. Nutrien Agar untuk menumbuhkan bakteri. 7. NaCl fisiologis steril untuk mengencerkan dan media penyimpanan sampel bakteri. 3.3 Metode Penelitian Penelitian ini termasuk dalam penelitian eksperimental di laboratorium. Penelitian dilakukan dengan menggunakan metode Rancangan Acak Lengkap (RAL), dengan 5 perlakuan dan tiga kali ulangan. Pengamatan dilakukan setiap hari agar dapat diketahui apabila ada faktor lain yang berpengaruh terhadap kelangsungan hidup benih ikan mas koki. Adapun perlakuan yang diberikan sesuai dengan feeding rate, yaitu: Perlakuan A : Pemberian Bioflok 0 %. Perlakuan B : Pemberian Bioflok 7 %. Perlakuan C : Pemberian Bioflok 14 %. Perlakuan D : Pemberian Bioflok 21 %. Perlakuan E : Pemberian Bioflok 28 %. Menurut Gasperz (1991), Model linier rancangan acak lengkap adalah sebagai berikut : Y ij = μ + α + Ʃ ij Keterangan : Y ij : Hasil pengamatan perlakuan ke-i dan ulangan ke-j. µ : Nilai rata-rata dari semua perlakuan. α : Pengaruh perlakuan ke-i. Ʃ ij : Pengaruh error yang timbul karena perlakuan ke-i dan ulangan ke-j.
3.4 Prosedur Penelitian Penelitian ini dilakukan dua tahap, tahap pertama yaitu persiapan penelitian yang terdiri dari pembuatan media bioflok dan kultur bakteri Aeromonas hydrophila. Tahap kedua yaitu pelaksanaan penelitian dengan cara penambahan media bioflok sebagai upaya pencegahan terhadap infeksi Aeromonas hydrophila. 3.4.1 Persiapan Penelitian 3.4.1.1 Prosedur Pembuatan Bioflok 1. Menyiapkan alat dan bahan seperti akuarium dan aerasi dengan cara dibersihkan terlebih dahulu. 2. Probiotik merk EM4 di aktivasi sebanyak 100 ml pada satu liter air dengan cara 100 ml EM4 dilarutkan pada satu liter air ditambah dengan molase sebanyak 6,4 gram lalu dibiarkan selama 5 jam. 3. Akuarium ukuran 90 x 45 x 50 cm 3 di isi dengan air sebanyak 150 L dan diberi aerasi sebanyak enam titik kemudian tebar 5 gram pakan (pakan diblender terlebih dahulu agar mudah larut dalam air) lalu masukan EM4 yang telah diaktifasi. 4. Media pemeliharaan bioflok dibiarkan selama 1-2 hari, flok akan terbentuk ditandai dengan adanya busa di permukaan air. 5. Perlakuan pada media setiap harinya adalah diberi pakan sebanyak 5 gram dan molase sebanyak 6,4 gram. Perhitungan kebutuhan molase tercantum pada Lampiran 1. 3.4.1.2 Prosedur Kultur Bakteri Aeromonas hydrophila 1. Menimbang Nutrient Agar (3 gram untuk 100 ml akuades) 2. Nutrient Agar dilarutkan dengan akuades pada Erlenmeyer dan ditutup dengan alumunium foil, dipanaskan hingga mendidih dan homogen. 3. Sterilisasi dalam autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121 C dan tekanan 1 atm.
4. Nutrient Agar dituangkan dalam cairan petri steril hingga merata (25 ml), simpan hingga dingin dan beku. 5. Penginokulasian bakteri Aeromonas hydrophila pada Nutrien Agar dan petri disk, diinkubasi dalam inkubator dengan suhu 27 C selama 24 jam. 6. Pemanenan bakteri dengan jarum ose secara aseptik lalu dimasukan ke dalam tabung reaksi yang berisi NaCl Fisiologis. 3.4.2 Pelaksanaan Penelitian 3.4.2.1 Prosedur Pemeliharaan 1. Menyiapkan alat dan bahan seperti akuarium dan aerasi dengan cara dibersihkan terlebih dahulu. 2. Akuarium diisi dengan air sebanyak 15 liter dan diberi aerasi untuk media pemeliharaan benih ikan koki. 3. Benih ikan mas koki dimasukan ke dalam media kultur sebanyak 15 ekor setiap akuarium, dibiarkan selama satu hari dengan diberi pakan pada pagi dan sore hari. 4. Bioflok dimasukan ke dalam media pemeliharaan benih ikan mas koki sesuai perlakuan feeding rate yaitu 0 %, 7 %, 24 %, 21 % dan 28 %. (Lampiran 2). Pemberian bioflok dilakukan setiap hari selama penelitian. 5. Pemberian pakan buatan dilakukan setiap hari selama penelitian yaitu pada pagi hari dan sore hari sebanyak 2 % dari bobot biomassa benih ikan mas koki. 3.4.2.2 Prosedur Uji Tantang Setelah 20 hari pemeliharaan hewan uji diinfeksi Aeromonas hydrophila dengan cara diinjeksi secara intramuscular dengan kepadatan Aeromonas hydrophila 10 8 cfu/ml sebanyak 0,1 ml. Setelah penginfeksian dilakukan pengamatan gejala klinis yang meliputi respon pakan dan gerak serta kelangsungan hidup, pengamatan dilakukan selama 14 hari.
3.5 Parameter yang Diamati 3.5.1 Organisme Pembentuk Bioflok 3.5.1.1 Populasi Bakteri Pengambilan sampel bakteri pada bioflok dilakukan dengan botol, sampel yang diambil sebanyak 10 ml. Setelah itu disiapkan larutan NaCl fisiologis yang telah diseterilkan dan dimasukan ke dalam tabung reaksi sebanyak 9 ml/tabung. Kemudian ke dalam tabung reaksi yang telah di isi NaCl fisiologis steril dimasukan air sampel sebanyak 1 ml, larutan dihomogenkan. Dari tabung satu diambil 1 ml untuk tabung kedua dan seterusnya hingga enam kali sesuai dengan jumlah pengenceran. Diambil 1 µm sampel dari dalam tabung pengenceran lalu dituang kedalam petridisk yang telah diberi nutrient agar dan disimpan dalam mesin inkubator selama 24 jam, koloni yang terbentuk dicatat secara spesifik. 3.5.1.2 Kelimpahan Plankton Pengambilan plankton pada bioflok dilakukan dengan menggunakan gayung dengan volume 1 L, jumlah sampel yang diambil adalah 10 liter kemudian disaring menggunakan plankton net air yang tersaring ditampung dalam botol ukuran 30 ml. Pengamatan plankton dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya elektrik, jumlah sampel bioflok yang diamati diatas gelas objek sebanyak 1 ml kemudian ditutup menggunakan cover glass selanjutnya plankton dihitung dan diidentifikasi. 3.5.2 Gejala Klinis Pengamatan gejala klinis dilakukan setelah hewan uji di infeksi bakteri Aeromonas hydrophila. Pengamatan ini dilakukan setiap hari selama penelitian berlangsung dengan cara mengamati kerusakan tubuh hewan uji bagian luar dan perubahan tingkah laku. Pengamatan gejala klinis dilakukan dengan mengambil hewan uji secara acak dari dalam akuarium kemudian diamati gejala klinisnya dengan melihat indikasi yang ditunjukan oleh benih ikan mas koki seperti pada Tablel 3.
Tabel 3. Ciri-ciri ikan mas koki sehat dan terinfeksi Aeromonas hydrophila Ikan Mas Koki Sehat Ikan Mas Koki Terinfeksi Sirip utuh, tubuh ikan tidak luka Sirip dan tubuh ikan luka Mata sehat, tidak berdarah Mata berdarah Warna tubuh cerah Warna tubuh kusam Gerakannya lincah Gerakannya lamban Perut tidak membengkak Nafsu makan baik Perut membengkak Nafsu makan kurang Sumber : Sitanggang (2002) 3.5.2 Kelangsungan Hidup Kelangsungan hidup pada benih ikan mas koki dilakukan dengan cara menghitung jumlah ikan yang mati setiap hari. Menurut Effendie (1997), kelangsungan hidup dapat dihitung menggunakan rumus : Keterangan : SR N t N 0 : Kelangsungan hidup SR = N t N 0 x 100 % : Jumlah hewan uji pada waktu ke-t (ekor) : Jumlah hewan uji pada awal pemeliharaan (ekor) 3.5.3 Kualitas Air Kualitas air mempunyai peranan penting dalam kegiatan budidaya akuakultur. Pengukuran kualitas air dalam penelitian ini meliputi pengukuran suhu, ph, amonia dan DO. Pengukuran kualitas air ini dilakukan pada awal penelitian, pertengahan dan akhir penelitian.
3.6 Analisis Data Pengaruh penggunaan media bioflok sebagai upaya pencegahan infeksi Aeromonas hydrophila pada benih ikan mas koki terhadap kelangsungan hidup dianalisis menggunakan ANOVA uji F dengan taraf kepercayaan 95 %. Apabila terdapat perbedaan nyata antar perlakuan pada uji F maka dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan pada taraf kepercayaan 95 % (Gazperz 1991). Gejala klinis yang terjadi dianalisis menggunakan analisis deskriptif.