BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian ini adalah penelitian deskriptif. B. Tempat dan Waktu Penelitian Tempat penelitian di laboratorium lab. Mikrobiologi, Lantai II di kampus NRC UNIMUS Semarang Waktu penelitian pada tanggal 15 Mei s/d 28 Mei 2012 C. Sampel Sampel penelitian ini adalah 4 jamu serbuk tanpa merk yang berbeda warna dan manfaatnya di 2 warung berbeda di sepanjang jl. Fatmawati pedurungan kidul. D. Variabel Penelitian Variabel terikat adalah jamu tanpa merk Variabel bebas adalah jenis bakteri E. Definisi Operasional Jamu serbuk adalah jamu berbentuk serbuk tanpa merk yang dijual di warung jamu sepanjang jalan fatmawati-pedurungan. Identifikasi bakteri adalah pemeriksaan laboratorium untuk mengidentifikasi ada tidaknya cemaran bakteri dan jenis bakteri yang mencemarinya melalui uji mikrobiologi.
F. Pengumpulan Data Data yang dipakai adalah data primer dan sekunder. Data primer diperoleh secara langsung terhadap penjual jamu serbuk. Sedangkan data sekunder diambil secara wawancara dengan penjual jamu serbuk yang ada pada warung Jl. Pedurungan Kidul. G. Alat dan Bahan 1. Alat yang digunakan : ose, api bunsen, becker glass, cawan petri, mikroskop olympus, erlenmeyer, incubator Memmet, autoclave Hirayama, dan oven Memmet. 2. Media/ reagensia yang digunakan adalah media Brain Heart Infution (BHI), Blood Agar Plate (BAP), uji katalase, uji koagulase, Mac Concey (MC), Manitol Salt Agar (MSA), Nutrient Agar (NA), NaCl fisiologis, Plasma citrat, Reagen Hidrogen Peroksida (H 2 O 2 )3%, CatGram ( kristal violet, lugol, alkohol absolut, safranin ), disc Novobiosin, TSIA ( Triple Sugar Iron Agar), Trypthopan Broth, MR (Metyl Red), VP (Voges Proskaeur), Semi Solid Agar, Simon Citrat Agar, Urea Agar, Gula-gula (glukosa, laktosa, sukrosa, maltosa, manitol), H. Prosedur Pemeriksaan 1. Sterilisasi alat : Alat yang akan digunakan dicuci terlebih dahulu, sampai bersih, kemudian dibungkus dengan kertas, selanjutnya diautoclave pada suhu 121 0 C dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit. Setelah itu dimasukkan dalam oven pada suhu 100 0 C selama satu hari tujuannya untuk mengeringkan alat-alat tersebut.
2. Kultur : Sampel 1gr jamu serbuk diencerkan dengan 9ml Brain Heart Infuction (BHI) steril dan diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam. Kemudian ditanam pada media Blood Agar Plate dan diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam. Penanaman pada media Blood Agar Plate bertujuan untuk mengetahui pertumbuhan bakteri gram positif dan gram negatif berdasarkan sifat hemolisanya. Kemudian dilakukan identifikasi bakteri bentuk coccus dengan pengecatan gram. Interpretasi hasil pengecatan gram meliputi bentuk, warna, dan sifat dari bakteri tersebut. a. Pemurnian Setelah dilakukan pengecatan, diambil dari media BAP Untuk koloni bentuk coccus digores kembali pada media BAP, dan untuk koloni bentuk batang digores kembali pada media MC. Bertujuan untuk menumbuhkan bakteri yang hanya akan diidentifikasi. Carakerja : Menggunakan ose jarum steril, hasil penanaman dari madia BAP diambil koloni dengan hasil pengecatan bakteri bentuk coccus ditanam pada media 1ml BHI, inkubasi selama 3 jam kemudian ditanam kembali pada media BAP yang baru. Diambil koloni dengan hasil pengecatan bakteri bentuk batang ditanam pada media 1ml BHI, inkubasi selama 3 jam kemudian ditanam kembali pada media MC. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam.
b. Ujikatalase Uji katalase ini bertujuan untuk melihat kemampuan bakteri menghasilkan enzim katalase.dengan memecah H 2 O 2 menjadi 2 H 2 O dan O 2. Cara kerja : diambil 1 ose bakteri ditambah setetes reagen hidrogen peroksida ( H 2 O 2 ) 3 % diteteskan pada objek glass dicampur dan diamati ada tidaknya gelembung udara. Interpretasi hasil : Hasil positif terlihat gelembung udara dalam waktu kurang dari 20 detik. c. Uji koagulase Untuk membedakan bakteri Staphylococcus aureus dengan spesies staphylococcus yang lain. Cara kerja: setelah diuji katalase, suspensi bakteri yang diambil dari media BAP diletakkan di objek glass kemudian ditambah 1 ose mata plasma citrat dan digoyang selama 5 detik. Interpretasi hasil : Apabila terdapat gumpalan-gumpalan yang menyerupai pasir dinyatakan positif. d. Uji MSA (Manitol Salt Agar) Secara aseptis diinokulasikan biakan bakteri dari hasil pemurnian ke media MSA. Cara kerja : Koloni diambil satu mata ose dan ditanam pada media MSA secara gores kuadrat, kemudian diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam.
Interpretasi hasil : Koloni bakteri tersangka Staphylococcus aureus berwarna kuning dan terjadi perubahan warna media dari merah menjadi kuning. e. Uji Novobiosin Cara kerja : Inokulasi bakteri digores rapat ke media NA dengan menggunakan ose mata. Disc Novobiosin diletakkan ditengah-tengah media dengan sedikit ditekan agar menempel. Di inkubasi selama 24 jam pada temperatur 37 0 C. Interpretasi hasil : Resisten Sensitif : tidak terdapat zona hambat : terdapat zona hambat dengan diameter < 18 mm. 3. Uji biokimia bakteri batang gram negatif (-) Uji Biokimia : a. Uji produksi H 2 S pada media TSIA ( Triple Sugar Iron Agar). Cara kerja : Diambil koloni biakan yang terpisah dari media MC ke media TSIA dengan mengambil satu ose mata ditanam dengan cara digoreskan pada lereng media dan ditusuk sampai dasar media, diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam. Interpretasi hasil :Dilihat hasilnya menfermentasi laktosa dan sukrosa lereng media berwarna kuning, memfermentasi glukosa dasar media berwarna kuning, endapan hitam adanya H 2 S dan adanya gas ditandai dengan gelembung udara.
b. Uji Indol Cara kerja : Diambil koloni biakan dari media MC ke media Trypthopan Broth, diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam. Hasil inkubasi ditambah 3-4 tetes reagen kovac s melalui dinding tabung reaksi. Interpretasi hasil : Hasil posiitif ditandai terbentuknya cincin merah. c. Uji MR (Metyl Red) Cara kerja : Diambil koloni biakan dari media MC ke media MR, inkubasi 37 0 C selama 24 jam, kemudian 3-4 tetes reagen MR dan dikocok. Interpretasi hasil : Uji MR positif terbentuk warna merah pada media. d. Uji VP (Voges Proskaeur) Cara kerja : Diambil koloni biakan dari media MC ke media VP, inkubasi 37 0 C selama 24 jam, kemudian ditambah 3-4 tetes alfa naftol 5% dan KOH 40% dikocok. Interpretasi hasil : Uji VP positif jika terbentuk warna merah pada media. e. Uji Citrat, Motilitas dan Urease Cara kerja : Diambil koloni biakan dari media MC ke media Semi Solid dengan cara ditusukkan pada media, serta dikultur lagi ke media Simon Citrat dan media Urea Agar dengan cara digoreskan pada media, inkubasi pada suhu 37 0 C selam 24 jam. Interpretasi hasil :
Uji Citrat positif jika warna media Simon Citrat berubah warna dari hijau menjadi biru, Uji Motilitas positif jika pada media Semi Solid terdapat pertumbuhan di bekas tusukan, dipermukaan media atau berbentuk seperti akar. Uji Urease positif jika warna media Urea Agar berubah dari orange menjadi pink keunguan. f. Uji Fermentasi gula-gula Cara kerja : Diambil koloni biakan dari media MC ke media gula-gula (glukosa, laktosa, sukrosa, maltosa dan manitol) diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam. Uji gula-gula positif apabila terjadi perubahan warna media dari merah menjadi kuning disertai pembentukan gas pada tabung durham. g. Uji katalase dan Oksidase Cara kerja uji katalase: diambil 1 ose bakteri ditambahkan setetes reagen hidrogen peroksida ( H 2 O 2 3% ) diteteskan pada objek glass, dicampur dan diamati ada tidaknya gelembung udara. Interpretasi hasil : Pada uji katalase positif, ditandai dengan gelembung-gelembung O 2 Cara kerja oksidase : koloni yang diletakkan pada kertas saring yang ditambah pada reagen Dimetil paraphenildiamin Hydrochlorid 1%. Interpretasi hasil : pada uji oksidase positif ditandai dengan terbentuknya warna hitam
I. SKEMA PENELITIAN Jamu BHI steril BP agar MC agar Pengecatan Gram Sifat fermentasi : LLFC, MLF, LFC Coccus Gram positif Uji katalase terpisah HIA negatif positif Uji biokimia streptococcus staphylococcus bakteri hemo lisa Novobiosin MSA Koagul ase S.aureus β Sensitif + + S.Epidermis β Sensitif - ± S. saprophyticus γ Resisten ± - - Uji produksi H2S - Uji indol - Uji MR, VP - Uji Citrat, motilitas, urease - Uji fermentasi gula-gula Kesimpulan jenis bakteri yang ditemukan - Uji resistensi - Uji katalase - Uji oksidase