DETOKSIFIKASI SIANIDA OLEH MIKROBA RUMEN (BIOPLUS RACUN) (Cyanide Detoxification by Rumen Microbes (Toxic Bioplus)) M. WINUGROHO 1, ARFAN ABRAR 2 dan K. G. WIRYAWAN 3 1 Balai Penelitian Ternak, PO Box 221, Bogor 2 Mahasiswa PPS IPB dan 3 Staf Pengajar PPS IPB, Bogor 28 ABSTRACT Cassava leaf can be used as feed for ruminants. However, there is cyanide toxic that can cause death to the ruminants if it consumed excessively. Ruminants has ability to detoxify toxic compound in their feed, this related with microbes in its rumen. Rumen fluid as inoculum was taken from cassava leaf adapted-sheep in Ciampea, Bogor. This rumen fluid then processed through Balitnak method (WINUGROHO et al., 1993) with Potassium cyanide (KCN) as substrates. This adapted rumen fluid then cultured through Hungate method in modified Brain Heart Infusion Agar (BHIA) medium to study its detoxification activity and product in vitro. Sampling were taken sequentially in 48 hours then these adapted fluid rumen were identified its morphology and gram staining reactions. The isolates were called B1, B2 and B3. Detoxification test shows that these three isolates can decrease cyanide concentration before and after incubation by; 37.5 vs. 9.5 (B1), 35.5 vs. 1.5 (B2) and 26.75 vs. 2.88 (B3) with rate of cyanide degradation were;.58 ppm/h (B1),.52 ppm/h (B2) and.5 ppm/h (B3). Detoxification product was ammonia with concentration;.54 mm (B1);.47 mm (B2) and.1mm (B3). Morphology and gram staining reaction shows that these isolates has cocci shapes and gram negative reaction. Fermentation product with cyanide as substrate were acetic, propionic, isobutyric, butyric, isovaleric and valeric acid, except for isolate B1 has no valeric acid. Key words: Cyanide, toxic bioplus ABSTRAK Daun singkong berpotensi sebagai pakan ternak ruminansia. Kelemahan daun singkong yaitu adanya senyawa toksik asam sianida (HCN) yang dapat menyebabkan kematian dan penyakit subklinis bila dikonsumsi dalam jumlah besar. Ternak ruminansia memiliki kemampuan untuk bertahan terhadap senyawasenyawa toksik yang terdapat dalam pakannya, hal ini berhubungan dengan mikroba yang hidup dalam rumen. Cairan rumen sebagai sumber inokulum diperoleh dari domba di Kecamatan Ciampea Bogor yang telah teradaptasi dengan daun singkong dalam ransumnya. Cairan rumen tadi kemudian diproses melalui metode Balitnak (Winugroho et al., 1993) dengan KCN sebagai sumber substratnya untuk mendapatkan mikroba rumen terseleksi. Mikroba rumen yang telah terseleksi ditumbuhkan dalam media Brain Heart Infussion Agar (BHIA) dan dilakukan pemurnian untuk memperoleh kultur murni. Cairan rumen teradaptasi tadi kemudian ditumbuhkan dengan metode Hungate dalam media BHIA yang dimodifikasi untuk diuji aktivitas dan produk detoksifikasinya secara in vitro selama 48 jam dan dilakukan identifikasi mikroba rumen teradaptasi secara morfologis dan sifat pewarnaan gram. Mikroba rumen yang terpilih selanjutnya disebut isolat B1, B2 dan B3. Hasil pengujian aktivitas detoksifikasi menunjukkan penurunan konsentrasi sianida sebelum dan sesudah inkubasi masing-masing 37,5 vs 9,5 (B1), 35,5 vs 1,5 (B2) dan 26,75 vs 2,88 (B3) dengan laju penurunan konsentrasi sianida masing-masing,58 ppm/jam (B1),,52 ppm/jam (B2) dan,5 ppm/jam (B3). Produk detoksifikasi yang dianalisa adalah amonia dengan hasil masing-msaing yaitu;,54 mm (B1);,47 mm (B2) dan,1mm (B3). Hasil identifikasi bakteri rumen secara morfologis menunjukkan bentuk-bentuk campuran batang dan kokus dengan sifat pewarnaan gram negatif. Produk fermentasi dengan substrat sianida menghasilkan asam asetat, propionat, isobutirat, butirat, isovalerat dan valerat, kecuali untuk isolat B1 tidak terdapat asam valerat. Kata kunci: Sianida, Bioplus racun
PENDAHULUAN Tanaman singkong dapat menghasilkan daun sebanyak 7-15 ton/ha (KHAJAREN,1977) dengan kandungan protein kasar berkisar antara 18-35% dari bahan kering (ROGERS dan MILNER, 1963). Oleh karena itu, tanaman ini sangat berpotensi dalam menyediakan daun singkong sebagai pakan untuk ternak ruminansia. Namun, daun singkong mengandung senyawa toksik asam sianida (HCN) yang dapat menyebabkan kematian dan penyakit subklinis bila dikonsumsi secara berlebihan. Ternak ruminansia memiliki kemampuan untuk bertahan terhadap senyawa-senyawa toksik yang terdapat dalam pakannya. Hal ini berhubungan dengan mikroba yang hidup dalam rumen. Komposisi dan populasi mikroba yang hidup dalam rumen ditentukan oleh jenis pakan yang dikonsumsi dan interaksi antar mikroba rumen (PRESTON dan LENG, 1987). Hasil penelitian yang dilakukan oleh JONES (1981) berhasil mengidentifikasi bakteri pendetoksifikasi mimosin yang diperoleh dari rumen kambing di Hawaii tetapi tidak terdapat pada kambing yang ada di Australia. Sehubungan dengan hal-hal di atas maka dalam penelitian ini akan dieksplorasi bakteri pada ternak ruminansia yang memiliki kemampuan mendegradasi sianida. MATERI DAN METODE Seleksi mikroba yang memiliki kemampuan mendegradasi sianida Cairan rumen sebagai sumber inokulum diperoleh dari domba yang telah teradaptasi mengkonsumsi daun singkong. Dengan menggunakan substrat KCN dari Merck, cairan rumen tersebut diadaptasikan dalam kondiisi anaerob suhu 39 o C selama 96 jam menggunakan metode Balitnak (WINUGROHO et al., 1993). Produksi gas sebagai indikator terjadinya fermentasi dicatat. Pada akhir masa inkubasi dari total produksi gas terbanyak diambil cairan rumen yang telah teradaptasi tadi sebanyak,5 ml untuk ditumbuhkan secara anaerob suhu 39 o C pada medium Brain Heart Infusion Agar (BHIA) yang telah dimodifikasi dengan KCN. Koloni bakteri yang terbentuk kemudian dimurnikan dan disiapkan sebagai inokulum untuk uji detoksifikasi sianida secara in vitro. Uji detoksifikasi sianida secara in vitro Fermentasi in vitro dilakukan dengan menggunakan metode THEODOROU dan BROOKS (199) yang telah dimodifikasi pada tabung reaksi dengan tutup karet. Media yang digunakan adalah 1 ml media basal, 1 ml larutan sianida dengan konsentrasi 75 ppm dan 3 inokulum bakteri terpilih (B1, B2 dan B3) yang telah teradaptasi sebanyak.2 ml. Fermentasi dilakukan selama 48 jam dengan pengambilan sampel pada ; 6; 12; 24 dan 48 jam sebanyak 1 ml untuk dianalisa konsentrasi sianidanya. Analisis kimia Analisa konsentrasi sianida menggunakan metode spektrofotometri dengan pembacaan pada panjang gelombang 578 nm (APHA, 1985) dan diukur laju penurunan sianida, konsentrasi sianida sebelum dan sesudah fermentasi. 29
Identifikasi bakteri Inokulum bakteri (B1, B2 dan B3) diuji secara morfologis, sifat pewarnaan gram dan produk asam lemak terbangnya dengan sianida sebagai substrat. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil analisa konsentrasi sianida selama waktu pengamatan (; 6; 12; 24 dan 48 jam) menunjukkan penurunan konsentrasi yang dapat dilihat pada tabel 1. Tabel 1. Rataan konsentrasi sianida (ppm) pada waktu pengamatan berbeda Inokulum Waktu pengamatan (jam) 6 12 24 48 B1 37,5 35, 14,75 1,5 9,5 B2 35,5 35,25 17,75 14,25 1,5 B3 26,75 26,25 4,75 4,38 2,88 Kontrol 21,5 21,5 2, 19,5 19,5 Dari Tabel 1, terlihat bahwa penurunan konsentrasi sianida dari tiga inokulum secara nyata berbeda dibandingkan kontrol (P<,5). Lebih jauh penurunan konsentrasi tersebut dapat dilihat pada Gambar 1. Penurunan konsentrasi sianida yang didapat dari tiap inokulum B1, B2 dan B3 masing-masing sebesar 74,67%, 7,42% dan 89,25% dengan rataan laju penurunan sianida selama masa inkubasi 48 jam masing-masing,58 ppm/jam,,52 ppm/jam dan,5 ppm/jam untuk B1, B2 dan B3 secara berurutan. Penurunan konsentrasi sianida menunjukkan inokulum yang diperoleh memiliki kemampuan mendegradasi sianida walaupun produk fermentasi sianida masih belum diketahui. Jalur hidrolisis sianida secara anaerob menurut FALLON (1992) dapat terjadi melalui reaksi berikut ; HCN 2H 2 O HCOOH NH 3 Analisa terhadap konsentrasi amonia sebagai produk detoksifikasi dapat dilihat pada Tabel 2. Konsentrasi amonia berbanding terbalik dengan konsentrasi sianida selama inkubasi, hal ini diduga berhubungan dengan proses detoksifikasi sianida. Pertumbuhan isolat pada media yang sudah dimodifikasi dengan sianida juga terlihat dengan meningkatnya nilai optical density pada media yang sebelum dan sesudah inkubasi. Peningkatan nilai optical density menunjukkan pertumbuhan isolat Gambar 3. Hasil identifikasi isolat dapat dilihat pada Tabel 3. 21
(ppm) 4. 3. 2. 1.. Sebelum Sesudah 37.5 9.5 35.5 1.5 26.75 2.88 21.5 B1 B2 B3 Kontrol Perlakuan 19.5 Gambar 1. Rataan konsentrasi sianida (ppm) sebelum dan sesudah inkubasi Laju penurunan konsentrasi sianida untuk tiap isolat juga berbeda-beda seperti terlihat pada Gambar 2. 4. 3.5 3. (ppm/jam) 2.5 2. 1.5 1..5. B1 B2 B3 Kontrol - 6 6-12 12-24 24-48 masa inkubasi Gambar 2. Laju penurunan sianida (ppm/jam) tiap inokulum 211
Tabel 2. Rataan produksi Amonia (mm) hasil inkubasi dengan mikroba rumen terseleksi (B1-B3) Isolat B1 B2 B3 Kontrol Waktu (jam) 6 12 24 48 Konsentrasi amonia (mm),29,39,4,54,21,33,34,47,32,33,56,1,12,8,5,7 1,8 1,63 1,6 NILAI OPTICAL DENSITY 1,4 1,2 1,8,6,4,2,4,62 1,2 Kontrol B1 B2 B3 Gambar 3. Nilai optical density sebelum dan sesudah inkubasi tiap isolat Tabel 3. Karakterisasi mikroba rumen terseleksi yang mampu mendegradasi sianida Karakteristik B1 B2 B3 Morfologi Pewarnaan gram Produk Fermentasi asetat propionat isobutirat butirat isovalerat valerat NH 3 Kokus Gram negatif - Kokus Gram negatif Kokus Gram negatif 212
KESIMPULAN Bakteri rumen yang teradaptasi memiliki kemampuan mendegradasi sianida secara in vitro dengan produk detoksifikasinya berupa amonia. DAFTAR PUSTAKA AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. 1985. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Association. Washington DC. FALLON, R. D. 1992. Evidence of a hydrolitic route for anaerobic cyanide degradation. Applied and Environmental Microbiology 58: 9. pp 3163-3164 JONES, R. J. 1981. Does ruminal metabolism of mimosine explain the absence of leucaena toxicity in Hawaii. Aust. Vet. J. 57 : 55-56 KHAJAREN, S., J.M. KHAJAREN, N. KITPANIT and Z. O. MULLER. 1977. Cassava in the Nutrition of Swine. Proceedings of a Workshop Held at the University of Guelph, Ottawa PRESTON, T. R. and R. A. LENG. 1987. Matching Ruminant Production System with Available Sources in Tropics. Penabul Book. Armidale ROGERS, D. J. and MILNER. 1963. Amino acid profile of minioc leaf protein in relation to nutritive value. Econ. Bot. 17:211 THEODOROU, M.K. and A. E. BROOKS. 199. Evaluation of a New Laboratory Procedure for Estimating the Fermentation Kinetics of Tropical Feeds. AFRC Institute for Grassland and Environmental Research. Hurley. Maidenhead, Berkshire, SL6 5LR, UK WINUGROHO, M., M. SABRANI, P. PUNARBOWO, Y. WIDIAWATI and A. THALIB. 1993. Non-genetic approach for selecting rumen fluid contain specific microorganisms (balitnak method). Ilmu dan Peternakan 6(2) :5-9 Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan. Bogor 213
214 Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 21