BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, dari bulan Februari sampai dengan September 2011. Bahan dan Alat Aktinomiset yang digunakan berasal dari tanah perakaran bambu, tanah persawahan di Bogor, dan koleksi isolat milik Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman IPB yang diisolasi dari tanah perakaran sawit. Bakteri X. oryzae pv. oryzae diperoleh dari hasil isolasi bagian tanaman padi yang menunjukkan gejala penyakit kresek. Media yang digunakan yaitu yeast-dextrose-carbonate-agar (YDCA), casamino acids-yeast extract-glucoseagar (YCED), water-yeast extract-agar (WYE), WYE broth, nutrient agar (NA), dan Luria Bertani broth (LB) (Lampiran 1). Bahan-bahan lain yang digunakan yaitu benih padi varietas Ciherang yang secara alami terinfeksi X. oryzae pv. oryzae, bahan-bahan kimia untuk ekstraksi DNA dan polymerase chain reaction (PCR), KAPA2G Fast ReadyMix(2x), dan gel agarose. Alat yang digunakan untuk amplifikasi DNA yaitu mesin PCR/thermal cycler (GeneAmp PCR System 9700). Metode Penelitian Isolasi Aktinomiset Aktinomiset diisolasi dari sampel tanah yang diperoleh dari area persawahan di Cikarawang dan hutan bambu di Darmaga, Bogor. Tanah sampel yang diambil berasal dari kedalaman 5-12 cm di bawah permukaan tanah. Sampel tanah tersebut dikeringanginkan selama 7-14 hari. Untuk mengisolasi aktinomiset, 10 g sampel tanah disuspensikan ke dalam 100 ml akuades steril kemudian diinkubasi pada inkubator bergoyang selama 15 menit. Selanjutnya dilakukan pengenceran berseri dengan tingkat pengenceran 10-1 hingga 10-8 dan hasil tiap pengenceran dicawankan sebanyak 100 µl. Pencawanan dilakukan pada media
9 YCED dan WYE yang merupakan media bernutrisi rendah yang baik untuk mengisolasi aktinomiset (Crawford et al. 1993). Koloni-koloni tunggal aktinomiset yang tumbuh kemudian dimurnikan sebagai isolat murni pada cawan terpisah dengan media YCED atau WYE. Isolasi Bakteri X. oryzae pv. oryzae Bakteri X. oryzae pv. oryzae diisolasi dari daun padi yang menunjukkan gejala penyakit kresek lalu ditumbuhkan pada media YDCA dan dimurnikan. Daun yang menunjukkan gejala hawar dipotong-potong kecil lalu dicelupkan pada kloroks 10% untuk sterilisasi permukaan. Potongan daun dibilas dengan akuades steril dan dikeringkan di atas tisu. Untuk memperoleh suspensi bakteri, potongan daun direndam dalam akuades steril lalu dikocok dengan vortex. Selanjutnya, dilakukan pengenceran berseri dengan memindahkan 1 ml suspensi bakteri ke dalam 9 ml akuades steril dari satu tabung ke tabung selanjutnya. Pengenceran dilakukan dari 10-1 hingga 10-3. Hasil tiap pengenceran dicawankan sebanyak 50 µl pada cawan dengan media YDCA. Koloni tunggal bakteri X. oryzae pv. oryzae yang tumbuh kemudian dimurnikan pada media YDCA baru untuk dijadikan isolat stok. Isolat X. oryzae pv. oryzae yang telah diisolasi selanjutnya diuji patogenisitasnya dengan uji reaksi hipersensitif pada daun tanaman tembakau sehat. Isolat bakteri juga diujikan pada tanaman padi dengan cara menginokulasikannya pada daun padi sehat yang telah dipotong. Hal ini dilakukan untuk membuktikan bahwa isolat yang diperoleh merupakan bakteri patogen X. oryzae pv. oryzae yang dapat menyebabkan penyakit kresek pada padi. Uji Potensi Antibiosis Aktinomiset terhadap X. oryzae pv. oryzae Pengujian ini bertujuan menyeleksi aktinomiset yang memiliki sifat antagonis terhadap X. oryzae pv. oryzae, yaitu aktinomiset yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri X. oryzae pv. oryzae. Akan diseleksi empat isolat aktinomiset yang memiliki sifat antibiosis paling baik terhadap X. oryzae pv. oryzae. Pengujian dilakukan dengan dua metode, yaitu metode plate diffusion dan metode cross-streak.
10 Metode plate diffusion. Pengujian aktivitas antibiosis dilakukan dengan metode pengujian plate diffusion dengan beberapa modifikasi (Jeffrey 2008). Isolat aktinomiset berumur 7 hari, yang dibiakkan pada media WYE atau YCED, diambil menggunakan cork borer dengan diameter 8 mm dan diletakkan di atas media NA yang telah disebari dengan 50 µl bakteri X. oryzae pv. oryzae. Isolat diambil bersama dengan media agarnya. Zona bening (zona hambatan pertumbuhan) yang terbentuk mengindikasikan adanya reaksi antagonis antara aktinomiset dengan bakteri X. oryzae pv. oryzae. Pengamatan dan pengukuran terhadap zona bening dilakukan setelah 24 dan 48 jam inkubasi. Metode cross-streak. Pengujian antibiosis juga dilakukan dengan modifikasi metode cross-streak (Madigan et al. 1997) antara isolat aktinomiset dengan X. oryzae pv. oryzae pada media NA. Isolat aktinomiset yang diujikan digores pada satu sisi cawan seluas sepertiga cawan. Aktinomiset diinkubasi hingga tumbuh selama 5 hari agar menghasilkan senyawa metabolit sekunder atau antibiotik yang akan berdifusi ke media agar. Setelah 5 hari, bakteri X. oryzae pv. oryzae digoreskan pada sisi cawan yang kosong sepanjang 4 cm dengan arah tegak lurus terhadap goresan isolat aktinomiset dan diinkubasi hingga tumbuh. Isolat aktinomiset yang berpotensi antagonis akan ditunjukkan dengan terbentuknya zona hambatan di mana X. oryzae pv. oryzae yang digores tidak tumbuh. Uji Reaksi Hipersensitivitas Isolat Aktinomiset Terpilih Uji reaksi hipersensitivitas dilakukan pada daun tanaman tembakau yang sehat. Isolat aktinomiset yang akan diuji ditumbuhkan terlebih dahulu pada media WYE broth selama 1 minggu. Isolat kemudian disuntikkan sebanyak 1 ml pada daun tembakau sehat dan diamati pada 24 dan 48 jam setelah inokulasi. Isolat yang tidak menimbulkan nekrosis pada daun tembakau akan dilanjutkan untuk perlakuan perendaman benih padi.
11 Pengujian Aktinomiset terhadap Perkecambahan Benih Padi Perlakuan perendaman benih padi menggunakan empat isolat aktinomiset yang terbaik dari dua pengujian sebelumnya. Tujuan perlakuan perendaman benih padi adalah untuk mengetahui pengaruh isolat aktinomiset terhadap perkecambahan dan pertumbuhan padi. Perlakuan dilakukan menggunakan kultur isolat aktinomiset yang berdasarkan hasil uji antibiosis mampu menghambat X. oryzae pv. oryzae. Dalam pengujian ini akan diamati pengaruh aktinomiset terhadap perkecambahan benih dan pertumbuhan bibit padi. Aktinomiset yang telah dikulturkan dalam media WYE broth selama 1 minggu digunakan untuk merendam 50 benih padi selama 24 jam. Untuk kontrol, benih padi hanya direndam dalam WYE broth tanpa aktinomiset. Sebanyak 25 benih padi yang telah diberi perlakuan perendaman dengan aktinomiset lalu diuji daya kecambahnya dan pertumbuhannya dengan metode uji kertas digulung dalam plastik. Benih padi ditumbuhkan pada media kertas buram yang telah dilembabkan kemudian digulung. Benih diinkubasi selama 7 hari kemudian dihitung persentase daya kecambah dan diukur panjang tunas serta panjang akarnya. Penimbangan juga dilakukan untuk mengetahui bobot basah per 10 kecambah. Pengujian dilakukan dengan tiga ulangan dan pada setiap ulangan diambil 20 unit sampel yang dipilih secara acak sebagai sumber parameter pengamatan. Pengujian Aktinomiset terhadap Penekanan Populasi X. oryzae pv. oryzae pada Benih dan Kecambah Padi Benih yang telah diberi perlakuan perendaman aktinomiset juga diuji dengan pencawanan untuk melihat pengaruh metabolit aktinomiset terhadap X. oryzae pv. oryzae terbawa benih padi. Benih padi yang digunakan merupakan benih yang telah terinfeksi X. oryzae pv. oryzae secara alami. Sebanyak 25 benih padi yang telah diberi perlakuan perendaman dengan isolat aktinomiset digerus lalu disuspensikan dalam 50 ml air steril. Suspensi diinkubasi pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm selama 1 jam. Suspensi diambil 1 ml, kemudian dilakukan pengenceran berseri dari 10-1 hingga 10-4. Sebanyak 50 µl dari tiap hasil pengenceran dicawankan pada media YDCA. Setelah diinkubasi
12 selama 48 jam, koloni X. oryzae pv. oryzae yang tumbuh diamati dan dihitung. Jumlah koloni yang tumbuh selanjutnya dikonversi ke dalam satuan cfu/ml dengan rumus (Hadioetomo 1993): Populasi bakteri/ml = Keterangan:. x = jumlah koloni yang tumbuh pada cawan dengan faktor pengenceran ke-n (cfu) p = faktor pengenceran ke-n v = volume suspensi yang disebar pada cawan (ml) Dengan metode yang sama, penghitungan populasi X. oryzae pv. oryzae juga dilakukan terhadap 25 kecambah padi yang tumbuh dari benih yang diberi perlakuan aktinomiset. Populasi bakteri per mililiter (cfu/ml) yang terhitung selanjutnya dikonversikan menjadi populasi bakteri per gram (cfu/g) sesuai dengan bobot tertentu dari 25 butir benih padi dan kecambah yang digunakan. Identifikasi Isolat Aktinomiset yang Berpotensi sebagai Agens Hayati X. oryzae pv. oryzae Ekstraksi DNA aktinomiset. Ekstraksi DNA dari dua isolat aktinomiset terpilih menggunakan metode ekstraksi DNA dari Song et al. (2004) dengan beberapa modifikasi. Miselium aktinomiset yang telah ditumbuhkan dalam media WYE broth selama seminggu diambil sebanyak 2 ml lalu disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Pellet, yaitu miselium aktinomiset yang mengendap di dasar tabung, dicuci dengan 2 ml TE (10 mm Tris dan 1 mm EDTA) kemudian disentrifugasi kembali. Selanjutnya, pellet diresuspensikan dalam 0,4 ml SET buffer (75 mm NaCl, 25 mm EDTA, 20 mm Tris ph 8,5). Lysozyme ditambahkan dengan konsentrasi 1 mg/ml kemudian diinkubasi pada 37 o C selama 0,5-1 jam dengan pembalikan setiap 15 menit. Lalu 0,1 volume 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) ditambahkan dan diinkubasi pada 55 o C selama 2 jam dengan pembalikan sesekali. Campuran ditambahkan 5 M NaCl sebanyak 1/3 volume dan 1 volume kloroform lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit. Selanjutnya, campuran disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan sebanyak 500 µl dipindah ke tabung eppendorf
13 baru dengan pipet berujung tumpul. Sampel diekstrak dengan fenol/kloroform/isoamil alkohol (25:24:1) dalam volume yang sama dan dipresipitasi dengan 2,5 volume etanol absolut dingin dan 0,1 volume 3 M sodium asetat (NaOAc). Setelah dipresipitasi dalam kulkas bersuhu -20 o C selama semalam, campuran disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit dan diambil pellet-nya. Pellet ditambah 500 ml etanol 70% dingin kemudian kembali disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit. Setelah supernatan dibuang, pellet dikeringkan dan disuspensikan dalam 25 µl TE. Keberadaan DNA aktinomiset hasil ekstraksi dideteksi menggunakan gel elektroforesis pada agarose. Amplifikasi dan sekuensing gen 16S rrna aktinomiset. Amplifikasi DNA hasil ekstraksi dilakukan dengan metode polymerase chain reaction (PCR). Amplifikasi dilakukan pada 25 µl campuran yang terdiri dari 7,5 µl ddh 2 O, 12,5 µl KAPA2G Fast ReadyMix(2x), 2 µl primer forward 27F_8-27 (5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ), 2 µl primer reverse 1492R_1510-1492 (5 -GGTTACCTTACGACTT-3 ), dan 1 µl DNA aktinomiset. Tabung berisi campuran reaksi tersebut diletakkan dalam mesin PCR (GeneAmp PCR System 9700) yang telah diprogram untuk tahap pre-denaturasi pada 94 o C selama 2 menit, diikuti dengan 30 siklus yang terdiri dari tahap denaturasi pada 94 o C selama 30 detik, annealing pada 52 o C selama 30 detik, dan elongasi/extension pada 72 o C selama 2 menit. Tahap final extension dilakukan pada suhu 72 o C selama 2 menit. Produk PCR tidak dimurnikan. Produk hasil PCR dideteksi dengan gel elektroforesis pada agarose. Sekuensing (perunutan nukleotida) dari produk PCR yang belum dimurnikan dilakukan oleh Laboratorium First Base Asia. Sekuen parsial nukleotida gen 16S rrna yang diperoleh kemudian dibandingkan dengan sekuen di NCBI genebank database dengan Basic Local Allignment Search Tool (BLAST) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) (Zhang et al. 2000). Analisis Statistik Rancangan percobaan yang dilakukan pada pengujian aktinomiset terhadap perkecambahan benih padi adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL). Terdapat
14 lima perlakuan dan masing-masing perlakuan diulang sebanyak tiga kali. Setiap pengulangan diambil 20 unit sampel. Data yang diperoleh diolah menggunakan Microsoft Office Excel 2007 dan analisis sidik ragam menggunakan program Statistical Analysis System (SAS) versi 9.1.3 untuk Windows. Perlakuan yang berpengaruh nyata diuji lanjut dengan uji Duncan pada taraf nyata α=0,05 (Mattjik & Sumertajaya 2006).