KONSTRUKSI MUTAN Pseudomonas sp. CRB 17 UNTUK MENINGKATKAN PRODUKSI ASAM INDOL ASETAT MELALUI MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON

KONSTRUKSI MUTAN Pseudomonas sp. CRB 17 UNTUK MENINGKATKAN PRODUKSI ASAM INDOL ASETAT MELALUI MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON Mutiha Panjaitan G34103046 DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007

ABSTRAK MUTIHA PANJAITAN. Konstruksi Mutan Pseudomonas sp. CRB17 untuk Meningkatkan Produksi Asam Indol Asetat melalui Mutagenesis dengan Transposon. Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan NISA RACHMANIA MUBARIK. Banyak bakteri yang hidup di rizosfer yang berperan sebagai pemacu pertumbuhan tanaman (plant growth promoting rhizobacteria, PGPR). Salah satu di antaranya yaitu Pseudomonas sp. Hasil isolasi dari tanah rizosfer kedelai didapatkan 100 isolat yang dikategorikan Pseudomonas sp. Salah satu isolat yaitu Pseudomonas sp. CRB17 menghasilkan asam indol asetat (IAA) tertinggi, yaitu sebesar 16.02 ppm. Untuk meningkatkan produksi IAA yang dihasilkan, dilakukan mutagenesis dengan transposon menggunakan Escherichia coli S17-1 (λ pir) pembawa transposon minitn5km1 (putmini-tn5km1) sebagai donor dan Pseudomonas sp. CRB17 sebagai resipien. Frekuensi konjugasi diperoleh berkisar 3.1 x 10-5 sel per resipien pada konjugasi selama 24 jam. Sebanyak 49 mutan telah dianalisis produksi IAA yang dihasilkannya. Mutan-mutan tersebut menghasilkan IAA dengan jumlah yang bervariasi mulai dari yang mengalami penurunan IAA hingga 55.31 %, yang mengalami peningkatan produksi IAA hingga 77.52 %, dan sisanya menghasilkan IAA yang moderat. Dari hasil penelitian ini, mutagenesis dengan transposon dapat digunakan untuk meningkatkan produksi IAA khususnya pada Pseudomonas sp. CRB 17. ABSTRACT MUTIHA PANJAITAN. Construction of Mutant Pseudomonas sp. CRB 17 to Increase Indole Acetic Acid Production by Transposon Mutagenesis. Supervised by ARIS TRI WAHYUDI and NISA RACHMANIA MUBARIK. Many bacteria living in the rhizosphere contribute as a plant growth promoter called as plant growth promoting rhizobacteria. One of them is Pseudomonas sp.. One hundred isolates categorized as Pseudomonas sp. was succesfully isolated from soybean rhizosphere soil. The isolate Pseudomonas sp. CRB 17 produce highest amount of indole acetic acid (IAA) at 16.02 ppm. To increase IAA production, transposon mutagenesis had been done using Escherichia coli S17-1 (λ pir), carrying minitn5km1 (putmini-tn5km1) as the donor and Pseudomonas sp. CRB 17 as the recipient strain. The frequency of conjugation obtained was approximately 3.1 x 10-5 cell per recipient for 24 hours incubation time of conjugation. Forty nine mutants have been analyzed for their IAA production. These mutants produced a varying amount of IAA, ranging from mutants which have decreasing IAA production down to 55.31 %, mutants with moderate IAA production, and the remaining with increasing IAA production up to 77.52 %. From the results of this research can be concluded that transposon mutagenesis can be used to increase IAA production of Pseudomonas sp. CRB 17.

KONSTRUKSI MUTAN Pseudomonas sp. CRB 17 UNTUK MENINGKATKAN PRODUKSI ASAM INDOL ASETAT MELALUI MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh Sarjana Sains pada Fakultas Matematikan dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor Mutiha Panjaitan G34103046 DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007

Judul : Konstruksi Mutan Pseudomonas sp. CRB17 untuk Meningkatkan Produksi Asam Indol Asetat melalui Mutagenesis dengan Transposon Nama : Mutiha Panjaitan NRP : G34103046 Menyetujui: Pembimbing I, Pembimbing II, Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si NIP. 131957319 NIP. 132045531 Mengetahui: Dekan Faklutas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS NIP 131473999 Tanggal lulus :

PRAKATA Segala puji bagi Tuhan Yang Maha Kuasa atas berkat dan kasih-nya, sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian ini dilakukan mulai bulan Februari 2007 sampai dengan Juli 2007, di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Kampus IPB Baranang Siang, Bogor. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si. dan Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M. Si. selaku pembimbing atas segala saran, dukungan dan waktu yang telah diberikan. Penulis juga berterima kasih kepada Dr. Ir. Miftahudin, M.Si. atas perbaikan dan masukan untuk penulisan karya ilmiah ini. Penelitian ini dibiayai oleh Program Insentif Penelitian Dasar dari Kementerian Negara Riset dan Teknologi Indonesia kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si. dan untuk itu penulis mengucapkan terima kasih atas dukungan dananya. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada staf-staf laboratorium Mikrobiologi atas sarana dan bantuannya selama penulis melakukan penelitian. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Pak Joni dan Mba Yeni atas bantuan dan kerjasamanya. Ucapan terima kasih dan rasa hormat juga penulis sampaikan kepada keluarga tercinta : Ayah, Ibu, Kakak, Abang dan Adik untuk kasih, bantuan dan doanya. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada rekan-rekan dan teman satu lab: Sarah, Ka Rika, Mba Dini, Bibah, Andri, Ima, Novan, Ai, Ika, Wahyu, Besty, Tri, Bu It, Mba Rina, Mba Widya, Bu Rene, dan Irni. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Ka Deri, Icha, Rika, Ka Nita, Septi, Rosma, Merly, Bang Manaor, Ka Sigit, Ka Nanda, dan teman-teman Bio 40 untuk bantuan, dukungan, dan tawanya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Agustus 2007 Mutiha Panjaitan

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Hamburg tanggal 24 Mei 1985 dari ayah Maruli dan Ibu Irma. Penulis merupakan anak ketiga dari empat bersaudara. Penulis tamat SD tahun 1997 dan tamat SLTP tahun 2000. Tahun 2003 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Bogor dan pada tahun yang sama di diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Penelusuran Minat dan Kemampuan (PMDK). Selama mengikuti perkuliahan penulis pernah menjadi asisten Biologi Dasar, Mikrobiologi Dasar dan Genetika Dasar. Penulis juga melaksanakan kegiatan praktik lapang pada tahun 2006 di PT Actavis Indonesia, Jakarta Timur. Penulis juga pernah lolos seleksi PKMP tingkat IPB dan mendapat dana penelitian PKMP dari Dikti. Penulis juga pernah mengikuti seminar nasional Penelitian yang Dibiayai Hibah Kompetitif dalam Rangka Purnabakti Prof. Dr. Ir Yayah Koswara sebagai presenter untuk mempresentasikan hasil penelitian ini, dan terpilih sebagai presenter terbaik bidang bioteknologi.

DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... vii PENDAHULUAN... 1 METODE Isolasi Pseudomonas sp. dari Rizosfer Tanaman Kedelai (Glycine max)... 1 Uji Produksi Asam Indol Asetat Isolat-isolat Pseudomonas sp.... 2 Esai Pemacuan Pertumbuhan...... 2 Uji Resistensi Antibiotik sebagai Penanda dalam Seleksi Transkonjugan... 2 Mutagenesis dengan Transposon... 2 Seleksi Transkonjugan dan Kuantifikasi Asam Indol Asetat... 3 HASIL Isolasi Pseudomonas sp. dari Rizosfer Tanaman Kedelai... 3 Uji Produksi Asam Indol Asetat Isolat-isolat Pseudomonas sp.... 3 Esai Pemacuan Pertumbuhan...... 3 Uji Resistensi Antibiotik sebagai Penanda dalam Seleksi Transkonjugan... 5 Mutagenesis dengan Transposon... 5 Seleksi Transkonjugan dan Kuantifikasi Asam Indol Asetat... 5 PEMBAHASAN... 6 SIMPULAN... 7 DAFTAR PUSTAKA... 7

DAFTAR TABEL Halaman 1 Uji produksi asam indol asetat isolat-isolat Pseudomonas sp... 4 2 Esai pemacuan pertumbuhan kecambah kedelai oleh Pseudomonas sp. CRB 17... 5 3 Persentase kenaikan asam indol asetat yang dihasilkan oleh mutan Pseudomonas sp. CRB17 hasil mutagenesis dengan transposon... 5 4 Persentase penurunan asam indol asetat yang dihasilkan oleh mutan Pseudomonas sp. CRB17 hasil mutagenesis dengan transposon... 6

PENDAHULUAN Usaha ekstensifikasi dan intensifikasi pertanian yang kian digalakkan untuk mencapai swasembada pangan berimplikasi terhadap penggunaan pupuk kimia yang terus meningkat. Residu pupuk kimia diketahui dapat mencemari perairan dan menimbulkan eutrofikasi. Teknologi berwawasan lingkungan yang dapat meningkatkan efektivitas penggunaan pupuk kimia menjadi penting untuk dikembangkan. Salah satu produk teknologi alternatif yang ramah lingkungan ialah dengan menggunakan mikrob sebagai pupuk hayati. Bakteri tanah hidup bebas di daerah rizosfer yang menguntungkan dan telah menunjukkan dapat memperbaiki kesehatan atau meningkatkan hasil tanaman disebut plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) (Dey et al. 2004). Mekanisme pemacuan pertumbuhan tanaman yang dilakukan oleh PGPR ialah melalui penambatan nitrogen, produksi antibiotik, produksi siderofor, pelarutan fosfat, dan produksi zat pengatur tumbuh tanaman (Kapulnik & Okon 2002). Beberapa PGPR mampu menghasilkan zat pengatur tumbuh seperti auksin, giberelin, dan sitokinin (Dey et al. 2004). Salah satu genus PGPR yang banyak diteliti karena kemampuannya dalam menghasilkan auksin ialah Pseudomonas. Sebagai contoh Pseudomonas putida telah diketahui menghasilkan berbagai zat pemacu tumbuh termasuk auksin dan giberelin, siderofor, asam organik dan antibiotik (Premono & Widyastuti 1996, Patten & Glick 2002). Asam indol asetat (IAA) adalah auksin yang paling aktif untuk berbagai tanaman dan berperan penting dalam pemacuan pertumbuhan, seperti inisiasi akar, pembesaran sel, diferensiasi pembuluh dan pemacu pembungaan. Tanaman kurang mampu menghasilkan IAA yang cukup untuk pertumbuhan yang optimal. Sejumlah bakteri telah diidentifikasi mensintesis IAA pada biakan murni dan di tanah (Husen & Saraswati 2003). Pseudomonas putida GR12-2 penghasil auksin berupa asam indol asetat mampu memacu perpanjangan akar primer dan pembentukan akar lateral (Patten & Glick 2002). Berbagai jalur sintesis IAA digunakan oleh prokariot. Suatu galur bakteri dapat menggunakan lebih dari satu jalur sintesis IAA. Jalur-jalur ini dikelompokkan berdasarkan jenis intermediatnya, yaitu jalur indol asetamida (IAM), asam indol-3-piruvat (IPA), triptamin, dan indol-3-asetonitril (Manulis et al. 1998). Bakteri yang menguntungkan bagi bakteri menggunakan jalur IPA sebagai jalur utama untuk mensintesis IAA (Patten & Glick 2002). Mutagenesis dengan transposon merupakan salah satu metode untuk membuat mutan dengan cara menyisipkan segmen DNA (transposon) ke dalam genom bakteri yang bersangkutan (Wahyudi 2001). Secara umum metode ini digunakan untuk isolasi dan lokalisasi gen. Transposon merupakan suatu fragmen DNA yang dapat meloncat dan menyisip pada genom organisme (Wahyudi 2000). Transposon ini akan menyisip pada DNA secara random. Dengan adanya penyisipan transposon ini dapat menyebabkan perubahan genetik yang memiliki kontribusi penting dalam evolusi genom karena selain dapat menyisip ke dalam genom, penyisipan juga dapat terjadi pada sekuen DNA yang berperan untuk regulasi proses fisiologi tertentu sehingga dapat menyebabkan modifikasi ekspresi gen dan menyebabkan mutasi kromosom. Transposon Tn5 sering digunakan untuk kegiatan mutagenesis dengan transposon seperti pada penelitian yang dilakukan oleh Harayama et al. (1984) untuk menganalisis operon gen jalur pemotongan meta dari plasmid TOL Pseudomonas putida mt-2. Selain itu, Wahyudi (2005) juga melakukan mutagenesis dengan transposon dalam penelitiannya untuk melaporkan konstruksi pustaka genom Magnetospirillum magneticum AMB-1 dan penapisan pustaka yang membawa gen yang terlibat dalam biosintesis magnetosom. Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengkarakterisasi Pseudomonas sp. asal rizosfer tanaman kedelai yang berpotensi sebagai pemacu pertumbuhan tanaman, serta mengkonstruksi mutan Pseudomonas sp. CRB17 untuk meningkatkan produksi IAA melalui mutagenesis dengan transposon. METODE Isolasi Pseudomonas sp. dari Rizosfer Tanaman Kedelai (Glycine max) Pseudomonas sp. diisolasi dari tanah rizosfer kedelai daerah Cirebon. Isolasi dilakukan dengan pengenceran serial menggunakan garam fisiologis 0.85 % hingga 10-4. Tiga pengenceran terakhir disebar pada media agar King s B (20 g pepton, 15 ml gliserol, 1.5 g K 2 HPO 4, 1.5 g MgSO 4. 7H 2 O, 15 g agar, 1 L akuades) dan diinkubasi selama

2 24 jam. Koloni-koloni yang tumbuh kemudian diamati morfologinya dan diuji fisiologinya yang meliputi pewarnaan Gram, bentuk sel, motilitas, dan reaksi uji oksidase. Uji Produksi Asam Indol Asetat Isolatisolat Pseudomonas sp. Uji produksi IAA dilakukan sesuai metode Patten dan Glick (2002). Isolat-isolat Pseudomonas sp. diinokulasikan ke dalam 5 ml media cair King s B dengan penambahan triptofan 0.5 mm, selanjutnya diinkubasi selama 48 jam (120 rpm) pada suhu ruang. Triptofan digunakan sebagai prekursor terbentuknya IAA (Vande Broek et al. 2005). Sebanyak 1.5 ml kultur disentrifus selama 15 menit pada 10000 rpm. Selanjutnya 1 ml supernatannya dicampur dengan reagen Salkowski (150 ml H 2 SO 4 pekat, 250 ml H 2 O destilata, 7.5 ml 0.5 M FeCl 3 6H 2 O) dan diinkubasi pada suhu ruang selama 20 menit untuk kemudian diukur absorbansinya pada λ520 nm (Spectronic 20, Bausch & Lomb, US). Konsentrasi IAA ditentukan dengan membandingkannya terhadap kurva standar IAA dengan kisaran konsentrasi 0 30 ppm. Esai Pemacuan Pertumbuhan Esai pemacuan pertumbuhan dilakukan sesuai metode Dey et al. (2004). Isolat Pseudomonas sp. CRB 17 yang memproduksi IAA tinggi digoreskan secara penuh pada media agar King s B, diinkubasi selama 24 jam dan disuspensikan dengan kaldu nutrien steril. Sebanyak 100 µl kultur dengan konsentrasi 10 10 sel per ml dipipet dan diinokulasikan pada tiap kecambah kedelai varietas Slamet berumur 24 jam pada media agar semisolid dalam cawan petri. Kecambah diinkubasi selama 7 hari. Uji ini dilakukan dengan tiga ulangan cawan petri. Sebanyak 9 kecambah digunakan untuk tiap ulangannya. Parameter yang diamati meliputi panjang akar primer dan jumlah akar. Analisis data dilakukan menggunakan uji Anova SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) 12.0 for Windows. Uji Resistensi Antibiotik sebagai Penanda dalam Seleksi Transkonjugan Uji resistensi antibiotik dilakukan terhadap Escherichia coli S-17 λ pir (donor) dan isolat Pseudomonas sp. CRB 17. Jenis antibiotik yang digunakan dalam pengujian yaitu kanamisin, kloramfenikol, rifampisin, dan ampisilin pada konsentrasi 50 µg/ml. Masing-masing jenis antibiotik ditambahkan pada media-media agar Luria (10 g tripton, 5 g ekstrak khamir, 10 g NaCl, 15 g agar dan akuades 1 L). Baik E. coli S17-1 λ pir maupun CRB17 ditumbuhkan pada media tersebut dengan cara digores, dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang untuk CRB17 dan pada suhu 37 o C untuk E. coli. Mutagenesis dengan Transposon Konstruksi mutan dilakukan dengan menyisipkan gen kanamisin resisten (Km1) yang dibawa transposon mini-tn5km1 yang berada pada plasmid putmini-tn5km1 dalam E. coli S17-1 λ pir (donor) ke dalam genom Pseudomonas sp. CRB17 (resipien) secara diparental mating. Biakan resipien CRB17 ditumbuhkan pada 50 ml King s B cair + Kloramfenikol (Kl) 50 µg/ml dalam erlenmeyer 250 ml. Selanjutnya kultur diinkubasi pada mesin bergoyang dengan kecepatan 120 rpm pada suhu ruang selama 24 jam. Sementara biakan donor E. coli S17-1 (λ pir) ditumbuhkan pada media 50 ml Luria Broth (LB) + Kanamisin (Km) 50 µg/ml dalam erlenmeyer 250 ml dinkubasi pada inkubator bergoyang (120 rpm) pada suhu 37 0 C selama 20 jam. Perbandingan jumlah sel donor dan resipien yang digunakan ialah 1:1 (kisaran konsentrasi 10 8 : 10 8 ). Kultur sel donor dan resipien disentrifugasi dan pelet yang terbentuk dicuci sebanyak 3 kali dan diresuspensi dalam garam fisiologis. Pelet sel resipien yang telah dipanen ditambahkan LB sebanyak 40 µl. Suspensi sel resipien kemudian dipindahkan ke dalam tabung mikro yang berisi pelet sel donor. Suspensi campuran sel donor dan resipien diresuspensi dan dipindahkan ke membran filter milipore steril dan diletakan di atas media Luria Agar (LA), begitu pula pelet sel donor dan pelet sel resipien saja sebagai kontrol negatif. Inkubasi dilakukan selama 24 jam. Masing-masing membran milipore selanjutnya diangkat dan dimasukkan ke dalam tabung mikro berisi 1 ml garam fisiologis. Setelah divorteks hingga sel terlepas dari membran milipore, sebanyak 100 µl suspensi sel disebarkan pada agar cawan King s B + Km 50 µg/ml + Kl 50 µg/ml dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Koloni yang muncul pada media tersebut menunjukkan Pseudomonas sp. CRB17 mutan yang telah tersisipi genomnya oleh gen Km1 dari transposon Mini-Tn5Km1 sehingga selain resisten kloramfenikol juga resisten kanamisin. Diagram skematik mutagenesis dengan transposon dalam kegiatan ini terlihat pada Gambar 1.

3 Gambar 1 Diagram skematik mutagenesis dengan transposon. Seleksi Transkonjugan dan Kuantifikasi Asam Indol Asetat Seleksi dilakukan terhadap 49 mutan Pseudomonas sp CRB17 yang ditentukan secara random. Tiap mutan ditumbuhkan dalam 5 ml media King s B cair + 50 µg/ml Kl dan diinkubasi di inkubator bergoyang (120 rpm, suhu ruang) selama 24 jam sebagai prekultur. Sebanyak 100 µl biakan prekultur kemudian diinokulasikan ke dalam 5 ml media King s B cair + Kl 50 µg/ml yang disuplementasi dengan 0.5 mm L-triptofan dan dinkubasi pada suhu ruang serta digoyang pada 100 rpm selama 48 jam. Sebanyak 1.5 ml kultur disentrifus selama 15 menit pada 10000 rpm, kemudian sebanyak 1 ml supernatan dicampur rata dengan 4 ml reagen Salkowski dan dibiarkan pada suhu ruang selama 20 menit dalam keadaan gelap dan selanjutnya diukur absorbansinya pada λ520 nm (Spectronic 20, Bausch & Lomb, US). Konsentrasi IAA ditentukan dengan membandingkannya terhadap kurva standar IAA dengan kisaran konsentrasi 0 30 ppm. Konsentrasi IAA yang dihasilkan mutanmutan Pseudomonas sp. CRB17 dibandingkan dengan konsentrasi IAA Pseudomonas sp. CRB17 tipe liarnya. HASIL Isolasi Pseudomonas sp. dari Rizosfer Tanaman Kedelai Hasil isolasi dari tanah rizosfer kedelai daerah Cirebon didapatkan 100 isolat yang dikategorikan Pseudomonas sp. Isolat-isolat tersebut memiliki karakter mampu tumbuh pada media agar King s B, berbentuk batang, motil, Gram negatif, dan uji oksidasenya positif (Holt et al. 1994, Gambar 2). Uji Produksi Asam Indol Asetat Isolatisolat Pseudomonas sp. Berdasarkan hasil uji produksi IAA menyatakan bahwa 98 isolat Pseudomonas sp. yang telah berhasil diisolasi menghasilkan IAA dengan konsentrasi yang berbeda-beda. Salah satu isolat yaitu Pseudomonas sp. CRB17 diketahui sebagai galur penghasil IAA terbesar, yakni sebesar 16.02 ppm (Tabel 1). Isolat tersebut diketahui mampu menghasilkan pigmen fluoresen pada media King s B, sehingga dapat dikatakan Pseudomonas sp. CRB17 termasuk kelompok Pseudomonads yang berfluoresen. Isolat CRB17 ini selanjutnya digunakan untuk telaah lebih lanjut pada telaah pemacuan pertumbuhan dan mutagenesis dengan transposon. Esai Pemacuan Pertumbuhan Hasil uji pemacuan pertumbuhan terhadap kecambah kedelai menunjukkan bahwa isolat Pseudomonas sp. CRB17 ternyata mampu memacu pertumbuhan dengan memperpanjang akar primer dan memperbanyak jumlah akar. Hal ini dibuktikan dari nilai parameter esai pemacuan pertumbuhan kecambah kedelai yang diinokulasi CRB 17 secara signifikan berbeda nyata dengan kontrol pada taraf 5% (Tabel 2).

4 A B 0.17 cm 4 µm Gambar 2 (A) Penampilan koloni Pseudomonas sp. CRB 17 pada agar King s B berumur 48 jam, dan (B) penampilan sel Pseudomonas sp. CRB 17 berbentuk batang hasil pewarnaan Gram. Tabel 1 Uji produksi asam indol asetat isolat-isolat Pseudomonas sp. No Nama Konsentrasi IAA Nama Konsentrasi IAA No Isolat (ppm) yang dihasilkan Isolat (ppm) yang dihasilkan 1 Crb-7 0.00 51 Crb-68 7.72 2 Crb-38 0.00 52 Crb-18 7.82 3 Crb-89 0.33 53 Crb-70 7.86 4 Crb-88 0.81 54 Crb-55 8.04 5 Crb-84 1.13 55 Crb-60 8.12 6 Crb-82 1.44 56 Crb-6 8.35 7 Crb-81 1.52 57 Crb-11 8.35 8 Crb-27 1.98 58 Crb-62 8.43 9 Crb-25 2.20 59 Crb-40 8.66 10 Crb-3 2.32 60 Crb-51 8.79 11 Crb-37 2.34 61 Crb-9 8.98 12 Crb-32 2.60 62 Crb-48 8.98 13 Crb-29 2.64 63 Crb-52 9.18 14 Crb-34 2.82 64 Crb-59 9.18 15 Crb-33 3.26 65 Crb-92 9.18 16 Crb-19 3.37 66 Crb-96 9.18 17 Crb-14 3.45 67 Crb-100 9.30 18 Crb-22 3.45 68 Crb-4 9.46 19 Crb-41 3.73 69 Crb-2 9.58 20 Crb-44 3.73 70 Crb-67 9.62 21 Crb-39 3.91 71 Crb-45 9.65 22 Crb-30 4.31 72 Crb-93 9.74 23 Crb-36 4.39 73 Crb-49 10.01 24 Crb-90 4.39 74 Crb-50 10.17 25 Crb-73 4.45 75 Crb-1 10.21 26 Crb-42 4.61 76 Crb-47 10.36 27 Crb-16 4.89 77 Crb-58 10.60 28 Crb-75 5.04 78 Crb-61 10.68 29 Crb-43 5.08 79 Crb-98 10.93 30 Crb-20 5.16 80 Crb-54 11.27 31 Crb-31 5.45 81 Crb-94 11.52 32 Crb-80 5.45 82 Crb-86 11.60 33 Crb-97 5.85 83 Crb-53 11.66 34 Crb-71 6.04 84 Crb-66 11.74 35 Crb-78 6.26 85 Crb-65 11.90 36 Crb-57 6.31 86 Crb-28 12.16

5 Lanjutan No Nama Konsentrasi IAA Nama Konsentrasi IAA No Isolat (ppm) yang dihasilkan Isolat (ppm) yang dihasilkan 37 Crb-77 6.31 87 Crb-56 12.29 38 Crb-72 6.40 88 Crb-26 12.53 39 Crb-91 6.48 89 Crb-35 12.53 40 Crb-74 6.63 90 Crb-5 12.75 41 Crb-12 6.68 91 Crb-23 13.17 42 Crb-99 6.88 92 Crb-87 13.55 43 Crb-69 7.13 93 Crb-15 13.99 44 Crb-85 7.24 94 Crb-21 14.15 45 Crb-79 7.26 95 Crb-63 14.42 46 Crb-8 7.40 96 Crb-64 14.46 47 Crb-13 7.40 97 Crb-76 14.63 48 Crb-95 7.44 98 Crb-24 15.16 49 Crb-83 7.60 99 Crb-46 15.80 50 Crb-10 7.64 100 Crb-17 16.02 Tabel 2 Perlakuan Esai pemacuan pertumbuhan kecambah kedelai oleh Pseudomonas sp. CRB 17 Panjang akar primer (cm) Jumlah akar Pseudomonas 21.4 * 75 * sp. CRB 17 Kontrol 11.4 32 * berbeda nyata secara stastistik pada taraf 5% Uji Resistensi Antibiotik sebagai Penanda dalam Seleksi Transkonjugan Berdasarkan hasil uji resistensi diketahui bahwa E. coli S17-1 λ pir (donor) sensitif terhadap kloramfenikol 50 µg/ml, namun resisten kanamisin 50 µg/ml. Sedangkan Pseudomonas sp. CRB17 diketahui sensitif terhadap kanamisin 50 µg/ml, namun resisten kloramfenikol 50 µg/ml. Dengan demikian antibiotik kanamisin dan kloramfenikol dapat digunakan sebagai marker seleksi transkonjugan/mutan Pseudomonas sp. CRB17 hasil mutagenesis dengan transposon. Mutagenesis dengan Transposon Hasil mutagenesis dengan transposon menunjukkan bahwa gen kanamisin resisten (Km1) telah berhasil diintegrasikan ke dalam genom Pseudomonas sp. CRB17 melalui konjugasi diparental mating. Frekuensi transkonjugasi hasil transposon mutagenesis tersebut yang didapat dari masa inkubasi konjugasi selama 24 jam sekitar 3.1 x 10-5 sel per resipien. Seleksi Transkonjugan dan Kuantifikasi IAA Seleksi mutan Pseudomonas sp. CRB17 terhadap produksi IAA telah dilakukan terhadap 49 mutan hasil mutagenesis dengan transposon. Dari hasil seleksi diperoleh sebanyak 21 transkonjugan menghasilkan IAA yang lebih tinggi daripada tipe liarnya yaitu mengalami kenaikan produksi IAA-nya hingga 77.52 % (Tabel 3). Transkonjugan I 3 diketahui merupakan mutan yang menghasilkan IAA paling tinggi yaitu kenaikan produksi IAA-nya hingga 77.52 % dibandingkan tipe liarnya (Tabel 3). Sebanyak 28 mutan menghasilkan IAA yang lebih rendah dibandingkan dengan tipe liarnya yaitu dengan persentase penurunan hingga 55.31 %. Salah satu transkonjugan yaitu II 73 mengalami penurunan (downregulated) sebanyak 55.31% (Tabel 4). Tabel 3 Persentase kenaikan asam indol asetat yang dihasilkan oleh mutan Pseudomonas sp. CRB17 hasil mutagenesis dengan transposon Mutan Kenaikan produksi IAA (%) Mutan Kenaikan produksi IAA (%) III 73 1.80 I 22 22.99 II 20 2.93 II 99 30.41 I 25 5.12 V 20 32.67 I 33 8.13 I 23 37.94 III 41 8.33 I 8 48.43 III 14 9.53 II 11 49.58 II 30 9.83 I 2 51.48 V 11 10.29 I 1 65.59 II 7 10.62 I 11 70.54 I 31 14.76 I 3 77.52 I 32 17.81

6 Tabel 4 Persentase penurunan asam indol asetat yang dihasilkan oleh mutan Pseudomonas sp. CRB17 hasil mutagenesis dengan transposon Mutan Penurunan produksi IAA (%) Mutan PEMBAHASAN Penurunan Produksi IAA (%) I 18 2.66 III 52 22.79 II 41 4.39 III 2 30.12 II 4 7.68 I 26 31.47 III 20 8.64 III 11 32.94 I 16 10.39 II 83 33.71 II 23 11.37 V14 34.56 II 52 11.49 II 92 39.68 II 33 14.37 V 7 39.96 I 30 14.63 III 23 40.61 I 27 14.76 III 83 47.31 III 4 17.90 V 23 47.68 I 29 19.58 I 28 54.61 III 63 20.04 III 30 54.73 II 63 21.62 II 73 55.31 Pseudomonas sp. yang berpotensi dalam penghasilan IAA yang mampu memacu pertumbuhan banyak terdapat di rizosfer suatu tanaman (Dey et al. 2004). Oleh karenanya, dalam penelitian ini untuk mendapatkan isolat Pseudomonas sp. penghasil IAA maka dilakukan isolasi Pseudomonas sp. dari rizosfer tanaman kedelai. Sebanyak 100 isolat dikategorikan sebagai Pseudomonas sp. Karakter-karakter umum yang dimiliki Pseudomonas sp. tersebut adalah berbentuk batang, motil, Gram negatif, memiliki oksidase positif dan mampu tumbuh pada media semiselektif King s B (Holt et al. 1994). Berdasarkan hasil uji produksi IAA didapatkan bahwa Pseudomonas sp. CRB17 merupakan isolat penghasil IAA tertinggi yaitu sebesar 16.02 ppm (Tabel 1). Isolat CRB17 ini selanjutnya dipilih untuk dikonstruksi mutan yang menghasilkan IAA lebih tinggi. Karakter lain yang dimiliki CRB17 ialah menghasilkan pigmen fluoresen pada media King s B. Banyak spesies Pseudomonas sp. yang mampu menghasilkan pigmen yang berfluoresen terutama pada kondisi pertumbuhan miskin besi misalnya jika ditumbuhkan pada media King s B yang tidak ditambahkan zat besi. Beberapa pigmen ini dan turunannya berperan sebagai siderofor (zat pengkelat besi) yang berpotensi menghambat pertumbuhan patogen (Garibaldi 1967). Berdasarkan hasil esai pemacuan pertumbuhan diketahui bahwa Pseudomonas sp. CRB17 mampu memacu pertumbuhan kecambah kedelai. Hal ini dibuktikan dari nilai parameter esai pemacuan pertumbuhan kecambah yang diinokulasi CRB17 yang secara signifikan berbeda nyata dengan kontrol. Panjang akar primer kecambah yang diinokulasi CRB17 memiliki rataan sebesar 21.4 cm dan jumlah akarnya sebanyak 75 buah. Sedangkan panjang akar primer kontrol sebesar 11.4 cm dan jumlah akarnya sebanyak 32 buah (Tabel 2). Dari hasil ini dapat dikatakan bahwa isolat Pseudomonas sp. CRB17 dengan konsentrasi IAA yang dihasilkannya, dapat berperan sebagai rhizobakteria pemacu pertumbuhan tanaman khususnya kedelai. IAA yang disekresikan oleh suatu bakteri kemungkinan dapat memacu pertumbuhan baik secara langsung dengan merangsang pemanjangan atau pembelahan sel atau secara tidak langsung dengan mempengaruhi aktivitas asam 1-aminocyclopropane-1- carboxylic (ACC) deaminase. Enzim ini menghidrolisis ACC tanaman, prekursor fitohormon etilen, sehingga mencegah produksi etilen dengan konsentrasi yang menghambat pertumbuhan. IAA eksogenus dapat meningkatkan transkripsi dan aktivitas sintesis ACC pada tanaman. ACC ini memacu aktivitas ACC deaminase bakteri (Patten & Glick 2002). Dari hasil uji resistensi didapatkan bahwa Pseudomonas sp. CRB17 sensitif kanamisin 50 µg/ml dan resisten kloramfenikol 50 µg/ml. Sehingga E. coli S17-1 λ pir pembawa plasmid putmini-tn5km1 yang memiliki transposon resistensi kanamisin dapat digunakan dalam proses mutagenesis CRB17. Selain itu, dari hasil uji resistensi ini didapatkan bahwa antibiotik kanamisin dan kloramfenikol dapat digunakan sebagai marker seleksi transkonjugan/mutan Pseudomonas sp. CRB17 hasil mutagenesis dengan transposon. Frekuensi transkonjugasi hasil transposon mutagenesis tersebut yang didapat dari masa inkubasi konjugasi selama 24 jam sekitar 3.1 x 10-5 sel per resipien. Frekuensi ini lebih tinggi dibandingkan penelitian Rukayadi (1998) yang mendapatkan frekuensi transkonjugasi pada Xanthomonas campestris sebesar 8.3 x 10-6 menggunakan galur E. coli yang sama. Mutan-mutan Pseudomonas sp. CRB17 yang dihasilkan melalui mutagenesis dengan transposon diekspresikan melalui kemampuannya tumbuh pada media King s B

7 yang ditambah kloramfenikol dan kanamisin. Hal ini mengindikasikan bahwa gen Km1 yang dibawa transposon mini-tn5km1 telah berhasil disisipkan ke dalam genom Pseudomonas sp. CRB17. Transposon Tn5 merupakan salah satu transposon yang telah banyak dikaji karena menyediakan model sistem transposisi cut- (potong) dan paste- (pindah) yang baik. Transposon mini-tn5km1 merupakan turunan dari Tn5 yang sangat berguna untuk mutagenesis pada bakteri Gram negatif (Holtwick et al. 1997). Selama konjugasi plasmid putmini- Tn5Km1 dipotong menjadi utas tunggal dan utas tunggal ini pindah ke dalam sel resipien melalui pili. Pada sel resipien transposon penyandi resistensi kanamisin ini akan menyisip acak pada genom resipien sehingga menghasilkan transkonjugan yang resisten kanamisin. Oleh karena itu pada media untuk seleksi transkonjugan ditambahkan antibiotik kanamisin sebagai penanda adanya penyisipan transposon. Penyisipan transposon mini-tn5km1 ini bersifat stabil karena gen transposase berada di luar transposon sehingga setelah transposon menyisip pada genom resipien tidak terjadi transposisi lagi yang diperantarai transposase. Selain itu juga karena plasmid putmini- Tn5Km1 merupakan plasmid bunuh diri. Plasmid ini tidak dapat bereplikasi dalam sel resipien karena hanya dapat bereplikasi dalam sel yang menyediakan protein pir (protein initiation replication). Kemudian akhirnya plasmid ini akan terdegradasi oleh DNAase.. Dari hasil seleksi diperoleh sebanyak 21 transkonjugan menghasilkan IAA yang lebih tinggi daripada tipe liarnya yaitu mengalami kenaikan produksi IAA-nya hingga 77.52 % (Tabel 3). Hal ini diduga karena adanya penyisipan transposon di daerah represor dan mengakibatkan terjadinya perubahan pada gen-gen yang terlibat dalam regulasi biosintesis IAA sehingga produksi IAA menjadi meningkat (Pratiwi et al. 2001). Selain itu juga didapatkan 28 mutan menghasilkan IAA yang lebih rendah dibandingkan dengan tipe liarnya yaitu dengan persentasi penurunan hingga 55.31 % dari hasil uji produksi IAA ini (Tabel 4). Mutan yang mengalami penurunan produksi IAA ini mungkin disebabkan oleh adanya penghambatan salah satu gen dalam penghasilan IAA. Melalui transposon mutagenesis ini tidak didapatkan mutan yang tidak menghasilkan IAA. Hal ini mungkin dikarenakan banyaknya jalur sintesis yang digunakan dalam penghasilan IAA yang kemungkinan dimiliki oleh galur Pseudomonas. Jika salah satu jalur saja terhambat karena salah satu gen yang berperan dalam jalur tersebut tidak dapat diekspresikan akibat penyisipan transposon maka bakteri penghasil IAA dapat mengambil jalur sintesis alternatif. Hal serupa juga ditemui dalam penelitian Pratiwi et al. (2001) yaitu didapatkan mutan-mutan Azospirillum braziliense menghasilkan IAA yang lebih tinggi dan lebih rendah melalui transposon mutagenesis. SIMPULAN Sebanyak 100 isolat Pseudomonas sp. telah berhasil diisolasi dari tanah rizosfer tanaman kedelai daerah Cirebon. Sebanyak 98 isolat di antaranya menghasilkan asam indol asetat. Salah satu isolat yaitu Pseudomonas sp. CRB 17 merupakan penghasil IAA tertinggi yakni sebesar 16.02 ppm dan mampu memacu pertumbuhan tanaman kedelai melalui pemacuan perpanjangan akar primer dan pembentukan akar. Melalui mutagenesis dengan transposon dapat dikonstruksi mutan Pseudomonas sp. CRB17 yang menghasilkan IAA dengan konsentrasi yang meningkat hingga 77.52%. Dari hasil penelitian ini, mutagenesis dengan transposon dapat digunakan untuk meningkatkan produksi IAA, khususnya pada Pseudomonas sp. CRB17. DAFTAR PUSTAKA Dey R, Pal KK, Bhatt DM, Chauhan SM. 2004. Growth promotion and yield enhancement of peanut (Arachis hypogaea L.) by application of plant growth-promoting rhizobacteria. Microbiol Res 159 : 371-394. Garibaldi JA. 1967. Media for the enhancement of fluorescent pigment production by Pseudomonas species. J Bacteriol 94 :1296-1299. Harayama S, Lehrbach PR, Timmis KN. 1984. Transposon mutagenesis analysis of meta-cleavage pathway operon genes of the TOL plasmid of Pseudomonas putida mt-2. J Bacteriol 160 : 251-255 Holt JG, et al. 1994. Bergey s Manual of Determinative Bacteriology. Ed ke-9. Philadelphia: Lippincott William & Wilkins

8 Holtwick R, Meinhardt F, Keweloh H. 1997. Cis- trans isomerization of unsatturated fatty acids: cloning and sequencing of the cti gene from Pseudomonas putida P8. Appl Environ Microbiol 63:4292-4297. Husen E, Saraswati R. 2003. Effect of IAAproducing bacteria on the growth of hot pepper. J Mikrobiol Indones 8 : 22-26 Kapulnik Y, Okon Y. 2002. Plant growth promotion by rhizosphere bacteria. Di dalam : Warsel Y, Eshel A, Kafkafi U,editor. Plant Roots: The Hidden Half. Ed ke-3. New York: Marcel Dekker. hlm. 869-885. Manulis S, Haviv-Chesner A, Brandl MT, Lindow SE, Barash I. 1998. Differential involvement of Indole-3-Acetic Acid biosynthetic pathways in pathogenicity and epiphytic fitness of Erwinia herbicola pv. gypsophilae. Mol Plant Microbe Interac 11: 634 642. Patten CL, Glick BR. 2002. Role of Pseudomonas putida indoleacetic acid in development of the host plant root system. Appl Environ Microbiol 68 : 3795-3801. Pratiwi E, Suwanto A, Gunarto L, Adijuwana H. 2001. Karakterisasi mutan biosintesis asam indol asetat pada Azospirillum lipoferum J21.4 yang dihasilkan dari mutagnesis transposon. Hayati 8 : 18-22 Premono ME. Widyastuti R. 1996. Status hara tanaman jagung yang diinokulasi dengan Pseudomonas putida L27A4A1. Hayati 3 : 55-60 Rukayadi Y, Suwanto A, dan Tjahjono B. 1998. Konstruksi plasmid yang mengandung situs PacI dan PmeI untuk transposon mutagenesis pada Xanthomonas campestris. Hayati 5 :79-85 Vande Broek et al. 2005. Transcriptional analysis of the Azospirillum brasilense Indole-3-Pyruvate decarboxylase gene and identification of a cis-acting sequence involved in auxin responsive expression. Mol Plant Mirobec Interac 18 : 311 323. Wahyudi AT. 2000. Inverse polymerase chain reaction. Hayati 7: 121-123 Wahyudi AT. 2001. Perpustakaan gen : bagaimana mengkonstruksinya. Hayati 8: 27-30 Wahyudi AT. 2005. Konstruksi pustaka genom Magnetospirillum magneticum AMB-1 dan penapisan gen yang terlibat dalam sintesis magnetosom. Hayati 10: 91-95

9