PENENTUAN DAN K ENZI TRIPSIN DALA ENGKATALISIS HIDROLISIS KASEIN Kadek Anggra Suprapta Fakultas atematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pendidikan Ganesha Email: Dekanggra5@gmail.com Abstract The purpose of this lab is to determine max and K for incubation time minutes and minutes is determined by using the graph the relationship between enzymatic reaction rate and substrate concentration. In this experiment, the measurement of enzyme levels is to measure the speed of the reaction dikatalisisnya. Enzyme reaction velocity is highest when the reaction product is not yet formed. The reaction proceeds through the formation of enzyme-substrate complex. If all enzymes are in a state of the enzyme is saturated with substrate, the reaction rate reaches a maximum value ( max ). The method used is a quantitative analysis method which provided ten test tubes already containing casein solution, trypsin, phosphate buffer and TCA with different compositions. From the experimental results and analytical calculation of K and for enzymatic reaction with the enzyme trypsin and casein substrates with t = min and t = min, respectively,.436 mg/ml and.343 μmol/min Keywords: Enzyme, max, K, casein.. PENDAHULUAN Enzim merupakan suatu protein yang mempunyai struktur tiga dimensi tertentu yang mampu mengkatalisis reaksi biologik (aktivitas biokatalitik). Enzim dapat meningkatkan laju reaksi karena dengan adanya enzim maka reaksi yang terjadi akan mempunyai energi aktivasi lebih rendah daripada reaksi biasanya. Enzim membantu reaksi dalam menyediakan jalur reaksi yang memiliki energi aktivasi lebih rendah untuk transisi substrat menjadi produk dibandingkan dengan proses tanpa katalis, sehingga enzim sering disebut sebagai katalisator. Enzim sebagai katalisator mempunyai sifat-sifat seperti katalis pada umumnya. Enzim ikut bereaksi namun pada akhir reaksi enzim kembali dalam bentuk semula. Hal tersebut mengakibatkan enzim dapat dipakai kembali setelah melaksanakan aktivitasnya, sehingga tubuh tidak memerlukan enzim dalam jumlah besar. Jumlah atau kadar enzim yang kecil tersebut menimbulkan kesulitan tersendiri bagi kita untuk mengukur kadar enzim, sehingga memerlukan teknik yang rumit. Secara klinis, pengukuran kadar enzim sangat penting untuk dilakukan (Tika, ). Laju reaksi awal ( ) dari reaksi yang dikatalisis oleh enzim meningkat dengan bertambahnya konsentrasi substrat hingga tercapai keadaan dimana penambahan substrat tidak lagi meningkatkan laju reaksi awal. Keadaan dimana laju reaksi awal imum ( ) dicapai pada kondisi substrat jenuh. Hal ini dapat dijelaskan dengan postulat reaksi sebagai berikut, dimana E, S, dan P masingmasing adalah enzim, substrat, dan produk reaksi E + S k k Reaksi berlangsung melalui pembentukan kompleks enzim-substrat (ES). Kompleks ES dapat berdisosiasi lagi untuk membentuk enzim ataupun substrat atau membentuk ES k 3 k 4 E + P enzim dan produk. Konstanta kecepatan K, K dan K 3 menunjukkan kecepatan yang berhubungan dengan masing-masing tahap proses katalitik. Dari pengamatan terhadap
beberapa sifat-sifat enzim, diketahui bahwa kecepatan awal ( o ) pada konsentrasi substrat yang rendah akan berbanding lurus dengan [S]. Namun pada kondisi dimana kecepatan substrat yang tinggi, maka akan memiliki nilai imum dimana kecepatan tidak lagi bergantung pada substrat. Bila semua enzim berada dalam keadaan ES (enzim dijenuhkan oleh substrat atau semua sisi aktif enzim sudah mengikat substrat), maka laju reaksi akan mencapai nilai imum ( ). Kecepatan disosiasi produk dari enzim dan penambahan substrat lebih lanjut tidak akan mempengaruhi (Tika, ). Pengaruh konsentrasi substrat adalah jika konsentrasi substrat dinaikkan dua kali, maka kecepatan reaksi awal ( o ) meningkat dua kali lipat. Pada konsentrasi tinggi, peningkatan konsentrasi substrat akan menyebabkan perubahan o sangat kecil dan pada konsentrasi substrat yang sangat tinggi, peningkatan konsentrasi substrat tidak akan mempengaruhi harga o (harga o konstan). Keadaan ini disebabkan karena enzim telah dijenuhkan oleh substrat. Kecepatan reaksi meningkat sesaat konsentrasi substrat ditingkatkan sampai pada suatu titik dimana enzim dikatakan jenuh dengan substrat. Kecepatan reaksi secara keseluruhan tergantung pada kecepatan disosiasi produk dari enzim, dan penambahan substrat tidak akan mempengaruhi o. Plot o terhadap [S] berbentuk hiperbolik. Biasanya enzim diuji pada ph tinggi (optimum), pada suhu kisaran 5 o C sampai 35 o C dan pada konsentrasi substrat mendekati jenuh. Pada keadaan ini laju reaksi biasanya sebanding dengan konsentrasi enzim, sedikitnya pada kisaran tertentu (yaitu linier kurva laju reaksi sebagai fungsi dari konsentrasi enzim). Perhatikan gambar. max Kecepatan imum () Kinetic Zero-order (Fase II) ½ max Campuran kinetic zero dan first-order Kinetic Zero-order (Fase I) K S Gambar. Hubungan Konsentrasi Enzim dan o Plot Langsung
/ Slope=K / max / ax [S]=,5 K [S]= K -/K /[S] Gambar. Hubungan / o dan /[S] plot Lineweaver Burk enurut ichaelis dan enten, dan adalah Kecepatan reaksi enzim dengan kadar kemudian Briggs dan Haldane, reaksi tersebut substrat [S], K adalah tetapan ichaelis digunakan untuk menurunkan persamaan (mol/liter), dan adalah kecepatan matematik yang menggambarkan hubungan antar laju reaksi awal dan konsentrasi substrat. imum enzim. yang diud adalah sebagai berikut. Adapun persamaan ichaelis dan enten, S S, maka K K S y =, x = S, a =, dan b = K. ETODE Pada praktikum kinetika reaksi enzim yang dilakukan pada tanggal 4 April di Laboratorium Kimia Organik Universitas Pendidikan Ganesha. Adapun alat yang digunakan terdiri dari pipet tetes, gelas kimia ml, gelas kimia 5 ml, batang pengaduk, gelas ukur 5 ml, pipet volumetri 5 ml, corong, erlenmeyer ml, spatula, termometer o C, penjepit kayu, kaca arloji, rak tabung reaksi, buah alat sentrifugasi dan buah alat instrument U-IS. Sedangkan bahan yang digunakan terdiri dari larutan TCA %, larutan kasein, larutan buffer fosfat,, larutan tripsin, larutan NaOH,5, reagen folin coicalteu, aquades, kertas saring secukupnya dan kertas indikator secukupnya. Prosedur kerja darlam eksperimen ini adalah sebagai berikut: Disediakan buah tabung reaksi. Setiap tabung ditambahkan larutan kasein, buffer dan tripsin dengan konsentrasi yang berbeda yang ditentukan berdasarkan tabel di bawah ini. 3
Tabel. Komposisi tabung reaksi Larutan / (ml) (ml) 3 (ml) 4 (ml) 5 (ml) tabung t= menit Kasein,,5 3 5 Buffer posfat 5,9 5,5 5, 3 Tripsin T= menit Kasein,,5 3 5 Buffers 5,9 5,5 5, 3 posfat Tripsin Waktu Inkubasi enit Larutan kasein % diinkubasi dalam tabung reaksi selama 5 menit pada 35 o C, kemudian ditambahkan larutan buffer pospat dan larutan tripsin sambil diaduk perlahanlahan. Kemudian diinkubasi selama menit pada penangas air dengan suhu 35 o C dihitung mulai enzim ditambahkan. Reaksi dihentikan dengan 3 ml penambahan larutan TCA % yang disertai dengan pengadukan yang kuat. Selanjutnya, didiamkan selama 3 menit dalam air es agar pengendapan protein dan tripsin dapat berlangsung dengan sempurna. Setelah itu, larutan disentrifugasi selama menit lalu disaring. Filtrat yang diperoleh lalu dikerjakan menurut metode Anson, dimana filtrate diambil sebanyak ml lalu ditambahkan 4 ml NaOH,5 dan reagen cioceltau. Kemudian didiamkan selama menit. asing-masing larutan yang berada pada tabung reaksi diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer. Waktu Inkubasi t = menit Ke dalam tabung reaksi dimasukkan larutan buffer dan larutan enzim. Kemudian ditambahkan 3 ml larutan TCA % lalu diaduk kuat dan terakhir ditambahkan larutan kasein % sebanyak 5 ml. Kemudian, diinkubasi selama menit pada penangas air dengan suhu 35 o C dihitung mulai enzim ditambahkan. Setelah itu, diambil sebanyak ml filtrat kemudian ditambahkan 4 ml NaOH,5 ml lalu ditambahkan reagen folincioceltau dan diamkan selama menit. Selanjutnya, masing-masing larutan dalam tabung diukur absorbansinya dengan menggunakan alat spektrofotometer. 3. HASIL DAN PEBAHASAN Dalam percobaan ini dilakukan pengujian kinetika reaksi enzim. Kinetika reaksi enzim ini ditentukan dengan harga dan K m. Harga dan K m ini ditentukan dengan cara membuat grafik hubungan antar laju reaksi terhadap konsentrasi substrat. Dalam percobaan ini yang digunakan sebagai substrat adalah larutan kasein dan menggunakan enzim tripsin. Tripsin merupakan enzim proteolitik, dimana enzim ini akan mengkatalisis hidrolisis ikatan peptida pada kasein. 4
Gambar 3. Aktivitas Enzim Proteolitik Sebelum dilakukan pengujian terlebih dahulu disedikan sepuluh tabung reaksi yang telah diisi dengan larutan kasein, tripsin dan buffer asetat dengan konsentrasi yang berbeda-beda. Kemudian diberi dua macam perlakuan berbeda. Lima dari sepuluh tabung reaksi diberikan waktu inkubasi menit dan lima tabung reaksi lainnya diberi perlakukan inkubasi selama menit. Kemudian untuk tabung reaksi dengan perlakuan inkubasi selama menit, terlebih dahulu dilakukan inkubasi awal selama 5 menit pada suhu 35 o C. Tujuan dari proses inkubasi ini adalah untuk mengkondisikan substrat pada suhu yang optimal (35 o C). Setelah itu ditambahkan dengan buffer pospat (ph =8,) dan larutan tripsin. Penambahan buffer pospat ini bertujuan untuk memberikan faktor psikologis agar enzim dapat bekerja secara imum, dan penambahan larutan tripsin ini bertujuan untuk mengkatalisis reaksi hidrolisis ikatan peptida yang ada pada albumin. Larutan selanjutnya diinkubasi selama menit, dimana pada inkubasi ini memungkinkan terikatnya enzim tripsin dengan substrat. Setelah proses inkubasi selesai dilakukan, larutan ditambahkan larutan TCA % dan disertai dengan pengadukan. Tujuan dari penambahan larutan TCA ini adalah untuk menghentikan aktivitas enzim tersebut, sehingga dapat dianalisis pengaruh konsentrasi substrat terhadap laju reaksi enzimatis. Terhentinya aktivitas enzim karena penambahan TCA ini dibuktikan dengan terbentuknya warna kuning kecoklatan pada kelima tabung reaksi yang merupakan hasil denaturasi protein dari albumin dan enzim tripsin. Kemampuan TCA untuk menghentikan aktivitas enzim ini disebabkan karena larutan TCA bersifat asam dan mampu menurunkan ph larutan sehingga dapat mendenaturasi protein baik pada tripsin maupun kasein. Setelah endapan terbentuk, larutan disentrifugasi selama menit dan kemudian dilakukan penyaringan. Filtrat yang diperoleh kemudian dikerjakan dengan metode Anson dimana sebanyak ml filtrat diambil lalu ditambahkan dengan 4 ml larutan NaOH,5 dan reagen folin cioceltau. Reagen ini dapat direduksi oleh gugus fenolik pada asam amino tirosin yang ada pada filtrat menghasilkan tungstat dan molibdat yang berwarna biru. Kemudian dilakukan pengukuran absorbansi dengan menggunakan alat instrument U-IS. Untuk larutan dengan waktu inkubasi selama menit, ada sedikit perbedaan prosedur kerja. Dimana dalam kelima tabung reaksi ini terlebih dahulu ditambahkan buffer posfat kemudian larutan tripsin dan larutan TCA. Setelah mengalami proses inkubasi baru kemudian ditambahkan dengan larutan kasein dengan volume yang berbeda-beda. Setelah itu dilakukan pengukuran absorbansi dengan menggunakan U-IS. Adapun hasil pengukuran absorbansi disajikan dalam tabel di bawah ini 5
Tabel. Absorbansi pada masing-masing tabung reaksi No Tabung A ΔA (A t=menit A t=menit ) I t = menit,4 t = menit,6, II t = menit, t = menit,, III I t = menit,3 t = menit,5 t = menit,74 t = menit,4 t = menit,5 t = menit,,,68,5 Larutan albumin telur % dibuat dengan melarutkan 5 ml albumin telur ke dalam 5 ml akuades. assa 5 ml albumin telur adalah 575 mg, sehingga konsentrasi albumin telur adalah: g [ kasein ] mg ml Konsentrasi kasein pada masing-masing tabung reaksi dapat dihitung dengan menggunakan rumus pengenceran yaitu = Tabung I, ml mg,43 mg,43 mg 6,993mL / mg Tabung II,5 ml mg,74 mg,74 mg,4ml / mg Tabung III, ml mg,48 mg,48 mg, / mg Tabung I 3,mL mg 4,86 mg 4,86 mg,34 ml / mg Tabung 5,mL mg 7,43 mg 7,43 mg,39 ml / mg Untuk mengetahui pada masingmasing tabung dapat diturunkan dari persamaan berikut. Absorbansi dirumuskan sebagai berikut. A bc dengan εb merupakan suatu konstanta sehingga εb = k. Oleh karena itu, A = k.c 6
dimana A merupakan absorbansi dan C adalah konsentrasi. Berdasarkan persamaan tersebut, maka A ~ C, kecepatan dirumuskan sebagai [ C] t karena A ~ C, maka A t Karena t adalah tetap (t = menit dan t = menit), maka = A sehingga A Harga A, A, /A dan /[S] dapat disajikan pada pada table Berdasarkan data pada tabel, dapat dibuat kurva hubungan / terhadap /[S]. Tabel 3. Nilai A, A, /A dan /[S] No Tabung A A /A /[S] I t = menit,6 t = menit,4, 83,333 6,993 II t = menit, t = menit,, 5,,4 III t = menit,5 t = menit,3, 83,333,7 t = menit,4 I,68 4,75,34 t = menit,74 t = menit,,5,,39 / 9 8 7 6 5 4 3 4.75 83.333 5 83.333 y = 3.8x +.95 R² =.34 4 6 8 /[S] Gambar 4. Kurva Hubungan / terhadap /[S] Kurva yang dihasilkan antara / dengan /[S] menghasilkan garis lurus dengan persamaan y = 3,8x +,93.. () Persamaan ketika diidentikkan dengan persamaan yang dinyatakan Lineweaver-Burk yaitu K o [S] 7
Berdasarkan persamaan (), harga merupakan harga saat x =, sehingga y = 3,8x +,93 y = 3,8. +,93 y =,93 dengan demikian,93 max,436mol / menit,93 Sedangkan titik potong pada sumbu adalah - K [S], nilai ini sama artinya dengan harga saat y =, sehingga, y = 3,8x +,93 = 3,8x +,93 3,8x = -,93 x = -,744 dengan demikian - = -,744 K K =,744 =,343 mg/ml Jadi harga adalah sebesar,436 μmol/menit dan K m adalah,343 mg/ml. 4. SIPULAN Berdasarkan uraian pembahasan di atas maka dapat disimpulkan harga K dan untuk reaksi enzimatis dengan enzim tripsin dan substrat kasein dengan t = menit dan t = menit berturut-turut adalah,436 mg/ml dan,343 μmol/menit. 5. UCAPAN TERIA KASIH Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. I Nyoman Tika,.Si., sebagai dosen pengampu mata kuliah Praktikum Biokimia, Kadek Dewi Wirmandianthi, S.Pd,.Si, selaku asisten dosen, dan I Dewa Subamia selaku laboran di Jurusan Pendidikan Kimia atas masukan dan sarannya sehingga percobaan ini dapat dilaksanakan dengan baik. 6. REFERENSI Tika, I Nyoman.. Penuntun praktikum Biokimia. Singaraja: Universitas Pendidikan Ganesha Chairil Anwar, dkk. 994. Pengantar Praktikum Kimia Organik. Yogyakarta: Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Thenawijaya, aggy. 98. Dasar-Dasar Biokimia jilid. Jakarta: Erlangga Redhana.. Penuntun Pratikum Biokimia. Singaraja: Universitas Pendidikan Ganesha Frieda Nurlita, dkk.. Kimia Organik II. Singaraja : Institut Keguruan dan Ilmu Pendidikan Negeri Singaraja. Girindra, Aisyah dan Titin Supriyanti. 994. Dasar dasar Biokimia. Jakarta ; Universitas Indonesia. Ismono. 978. Cara-cara Optik Dalam Analisis Kimia. Diktat. Bandung: Jurusan Kimia ITB. 8