Laporan Praktikum Nama : Ganis Andriani Mikrobiologi NIM : J3L111144 Hari/tanggal : Rabu / 7 Desember 2012 Waktu : 13.00-16.20 WIB Kelompok : 4 (besar) / 7 (kecil) Asisten : Ebta Genny PJP : M. Arif Mulia, S.Pi IDENTIFIKASI BAKTERI ( Karakteristik Sifat Biokimia dan Fisiologis Bakteri) Data dan Hasil Pengamatan Tabel 1 Hasil pengujian identifikasi bakteri Escherichia coli Hasil No Jenis Uji Pengamatan Keterangan (+/-) 1. Uji oksidase - Tidak menghasilkan enzim oksidase 2. Uji oxidative + Dapat memecah karbohidrat dalam suasana aerob 3. Uji fermentative + Dapat memecah karbohidrat dalam suasana anaerob 4. Uji katalase - Tidak menghasilkan enzim katalase 5. Uji motilitas + Terjadinya pembebasan ikatan sulfide dan pergerakan bakteri (motilitas) 6. Uji gelatin + Terjadi hidrolisis gelatin dan menghasilkan enzim gelatinase
Oxidative Fermentative Gambar 1 Hasil uji gelatin pada E.coli Gambar 2 Hasil uji oxidative dan fermentative pada E.coli Gambar 3 Hasil uji SIM pada E.coli Tabel 2 Hasil pengujian identifikasi bakteri dengan KIT API 20E Gambar Gambar 4 Hasil identifikasi KIT API 20E Hasil Pengamatan Significant taxa : 1. Escherichia coli 2. Serratia liquefaciens 3. Aeromonas hydrophila/ caviae/ sobria 2 4. Aeromonas hydrophila/ caviae/ sobria 1 5. Serratia marcescens
Pembahasan Identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan cara konvensional dan cara KIT identifikasi. Cara konvensional meliputi fisiologis maupun biokimia. Ciri fisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang penting di dalam identifikasi spesies bakteri yang tak dikenal karena secara morfologis biakan ataupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organik yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan.. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media memproduksi tipe metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi mikroba dengan reagen test yang mana menghasilkan perubahan warna reagen (Murray 2005). Biokimia bertujuan untuk memahami bagaimana interaksi biomolekul satu dengan lainnya. Uji fisiologi biasanya identik dengan uji biokimia. Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri atau mikroorganisme yang antara lain uji katalase, koagulase, uji nitrit, hidrolisis gelatin, uji hidrolisis kanji, uji hidrogen sulfit. Pengujian biokimia merupakan salah satu hal yang sangat penting dalam dunia mikrobiologi (Lim 1998). Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri atau mikroorganisme yaitu antara lain adalah uji koagulase, uji katalase, uji MRVP, uji nitrit, hidrolisis gelatin, uji H 2 S (Dwidjoseputro1994). Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob obligat dan digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme untuk menguraikan hydrogen peroksida dengan menghasilkan enzim katalase. Bakteri yang memerlukan oksigen menghasilkan hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) yang sebenarnya beracun bagi bakteri sendiri. Namun bakteri tersebut dapat tetap hidup dengan adanya antimetabolit tersebut karena menghasilkan enzim katalase yang dapat mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen dengan reaksi sebagai berikut : 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 (Volk dan Wheeler 1993). Mekanisme enzim katalase memecah H 2 O 2 yaitu saat melakukan respirasi, bakteri menghasilkan berbagai macam komponen salah satunya H 2 O 2. Bakteri yang memiliki kemampuan memecah H 2 O 2 dengan enzim katalase maka segera membentuk suatu sistem pertahanan dari toksik H 2 O 2 yang dihasilkannya sendiri. Bakteri katalase positif akan memecah H 2 O 2 menjadi H 2 O dan O 2 dimana parameter yang menunjukkan adanya aktivitas katalase tersebut adalah adanya gelembung-gelembung oksigen seperti pada percobaan yang telah dilakukan. Dengan enzim katalase, H 2 O 2 diurai seperti pada Gambar 5.
Gambar 5 Reaksi penguraian dengan enzim katalase (Dwidjoseputro 1998) Bakteri katalase negatif tidak menghasilkan gelembung-gelembung. Hal ini berarti H 2 O 2 yang diberikan tidak dipecah oleh bakteri katalase negatif, sehingga tidak menghasilkan oksigen. Bakteri katalase negatif tidak memiliki enzim katalase yang menguraikan H 2 O 2. Dalam percobaan ini bakteri Escherichia coli negatif pada uji katalase dengan dibuktikan tidak adanya gelembung oksigen pada bakteri. Uji oksidase ditujukan untuk membedakan bakteri berdasarkan aktivitas sitokrom oksidase. Enzim-enzim oksidase memainkan peran yang vital dalam pelaksanaan sistem transport elektron pada respirasi aerob. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidase dari sitokrom yang tereduksi oleh oksigen molecular (O 2 ), menghasilkan pembentukan H 2 O atau H 2 O 2. Bakteri-bakteri aerob, sebagaimana juga beberapa bakteri anaerob fakultatif dan mikro aerofil, memiliki aktivitas oksidase. Uji oksidase merupakan alat untuk membedakan antara anggota-anggota dalam genus Neisseria dan Pseudomonas, yang merupakan oksidase positif, dan Enterobacteria atau Escherichia coli yang merupakan oksidase negatif. Kemampuan bakteri untuk menghasilkan sitokrom oksidase dapat ditunjukkan dengan penambahan pereaksi uji, p-aminodimetilanilin oksalat, terhadap kolonikoloni yang ditumbuhkan pada suatu media agar lempeng. Pereaksi ini berperan sebagai substrat buatan, memberikan elektron dan karenanya akan teroksidasi menjadi senyawa berwarna kehitaman dan oksigen bebas. Setelah penambahan pereaksi uji, terjadinya warna merah muda, kemudian merah maroon, dan akhirnya berwarna kehitaman pada permukaan koloni menandakan dihasilkannya sitokrom oksidase dan menunjukkan hasil positif. Tidak terjadinya perubahan warna,atau warna merah muda cerah pada koloni, menandakan tidak adanya aktivitas oksidase, menunjukkan hasil uji yang negatif. Gambar 6 Reaksi uji oksidase (Rehm & Reed 1987)
Media SIM (Sulfida Indo Motility) merupakan salah satu media yang digunakan untuk pengujian fisio-metabolisme suatu bakteri yaitu untuk mengetahui kemampuan membentuk indol (produk hasil degradasi protein), ikatan sulfide dan motilitas atau pergerakan bakteri. Data dan hasil pegamatan menunjukkan bahwa reaksi berlangsung positif artinya bakteri Escherichia coli yang diujikan termasuk ke dalam bakteri motil. Bakteri motil ialah bakteri yang bergerak dengan menggunakan flagel atau silia. Hal tersebut disebabkan karena setelah diinokulasikan ke dalam media SIM dan diinkubasi selama 2x24 jam, bakteri yang berkoloni tumbuh pada permukaan media serta tumbuh pada bekas tusukan jarum inokulasi yang berujung runcing. Motalitas merupakan salah satu ciri penting pengkarakterisasian bakteri. Sifat ini diakibatkan oleh adanya flagella sehingga sel bakteri dapat berenang didalam lingkungan air. Motilitas sebagaian besar jenis bakteri motil pada suhu relatif rendah 15-25 0 Cdan mungkin tidak motil pada suhu 37 0 C. Struktur bakteri yang berflagel itu kaku dan dilengkapi dengan gelendong yang berbentuk spiral. Gelendong spiral tersusun atas protein yang disebut dengan flagelin yang merupakan unit dasar penyusun flagella (Gross 1995). Gerak bakteri yang bersifat motil diakibatkan oleh adanya struktur atau organ sel bakteri yang berbentuk benang yang flagelia. Flagella panjang dan ramping. Gelatin adalah protein yang diperoleh dari hidrolisa kalogen yitu zat pada jaringan penghubung dan tendon dari hewan. Gelatin akan terurai oleh jasad renik yang mempunyai enzim proteolitik. Larutan gelatin bersifat cair pada suhu ruang atau suhu kamar dan padat apabila berada dalam lemari es. Bila gelatin telah dihidrolisa oleh jasad renik akan tetap bersifat cair meskipun berada dalam lemari es (Hadioetomo 1993). Berdasarkan data dan hasil pengamatan menunjukkan bahwa uji gelatin menghasilkan uji positif, sehingga Escherichia coli termasuk kedalam bakteri proteolitik, yaitu bakteri yang dapat mendegradasi gelatin menjadi gliserol dan mengandung enzim proteolitik. Hal tersebut dibuktikan dengan media gelatin setelah dicampurkan sampel (kultur murni E.coli ) dan dimasukkan ke dalam lemari es, hasilnya akan tetap berbentuk cair. Gelatin adalah suatu zat yang meleleh pada atau di atas 28 o C, sehingga harus dibudidayakan di suhu 25 o C (suhu kamar). Hidrolisis gelatin terjadi karena bakteri menghasilkan gelatinase untuk menghidrolisis polimer protein, gelatin, untuk asam amino. Gelatin protein merupakan polimer besar asam amino yang terlalu besar untuk masuk ke dalam membrane sel. Dalam rangka memanfaatkan gelatin, exoenzim proteolitik bakteri mensekresi gelatinase dan peptidase untuk mencerna gelatin luar sel (Pramono 2007). Media O/F merupakan salah satu media yag digunakan untuk pengujian fisio-metabolisme suatu bakteri yaitu untuk mengetahui kemampuan memecah karbohidrat (glukosa) dalam suasana aerobic (oksidatif) dan anaerobic (fermentative). Berdasarkan data dan hasil pengamatan menunjukkan bahwa uji tersebut merupakan uji positif baik dengan penambahan parafin maupun tanpa
parafin, artinya bakteri Escherichia coli dapat memecah glukosa atau karbohidrat dalam keadaan aerob maupun anaerob. Hal tersebut ditunjukkan dengan perubahan warna hijau menjadi kuning baik pada tabung reaksi dengan penambahan maupun tanpa penambahan paraffin setelah dilakukan inkubasi selama 2x24 jam. Bakteri aerob adalah salah satu penggolongan bakteri berdasarkan kebutuhan bakteri terhadap oksigen. Bakteri aerob merupakan jenis bakteri yang memerlukan oksigen bebas untuk kelangsungan hidupnya. Bakteri yang tergolong bakteri aerob hidupnya mutlak memerlukan oksigen dalam keadaan bebas. Ada pula yang kebutuhan akan oksigennya bersifat tidak mutlak, yaitu bakteri aerob fakultatif (Pelczar 2006). Identifikasi bakteri juga dilakukan dengan menggunakan software KIT API 20E. KIT API 20E merupakan software yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri yang lebih spesifik, yaitu Enterobacteriaceae. Berdasarkan percobaan yang dilakukan, hasil bakteri yang didapatkan tidak hanya menghasilkan taxon Escherichia coli, tetapi menghasilkan pula beberapa kemungkinan taxon lainnya seperti Serratia liquefaciens, Aeromonas hydrophila/ caviae/ sobria 2, Aeromonas hydrophila/ caviae/ sobria 1, dan Serratia marcescens. Hal tersebut dikarenakan adanya kontaminasi dari kerja yang tidak aseptik. Simpulan Berdasarkan percobaan, bakteri Escherichia coli termasuk bakteri yang dapat memecah karbohidrat secara aerob maupun anaerob, memiliki alat gerak atau flagella sehingga terjadi motilitas bakteri, dan dapat menghidrolisis gelatin serta mengandung enzim proteolitik. Identifikasi KIT API 20E tidak menghasilkan taxon yang murni Enterobacteriaceae, tetapi beberapa taxon lainnya. Daftar Pustaka Dwijoseputro. 2003. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan. Gross.1995. Introgductary Microbiology. London : Chaswaan Hall University and Profesional Hadioetomo RS. 1993.Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek, Teknik Dan Prosedur Dasar Laboratorium.Jakarta:PT Gramedia Pustaka Lim, D. 1998. Microbiology. Missouri : McGraw-Hill Murray RK, DK Granner, PA Mayes and VW Rodwell. 2000. Biokimia Harper. Edisi 25. Buku Kedokteran. EGC. Jakarta. Pelczer M. 2006. Mikrobiologi Dasar. Jakarta : Universitas Indonesia Press. Pramono H. 2007. Penggolongan Mikroba. Bandung: Kurnia. Rehm H. J dan G. Reed. 19987. Biotechnology. Vol 8: enzyme Technology. VCH Verlags gessell schaff, mbh, Weinhaim. Volk, 1988. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Erlangga.