PEMBUATAN MEDIA PERTUMBUHAN MIKROBA DAN TEKNIK PEMINDAHAN SECARA ASEPTIK I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Setiap mikroorganisme melakukan metabolisme untuk tumbuh dan berkembang biak. Hal ini menyangkut nutrisi yang berasal dari lingkungan dan memproses nutrisi tersebut sesuai dengan kebutuhan. Nutrisi yang tersedia bagi mikroba dapat dijumpai di tanah, sampah, air, dan bahan makanan sehingga di tempat tersebut mikroba dapat tumbuh. Di laboratorium, mikroba memperoleh nutrisi dari medium yang merupakan campuran bahan untuk menumbuhkan mikroba tersebut. Medium merupakan suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrien atau zat makanan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme mikroba. Medium yang digunakan sesuai dengan kebutuhan mikroorganisme. Untuk dapat tumbuh dengan baik mikroorganisme membutuhkan nutrien yang meliputi air, sumber energi, sumber karbon, sumber akseptor elektron, sumber mineral, faktor pertumbuhan, dan sumber nitrogen. Dengan mengetahui sifat, kebutuhan, makanan dari mikroorganisme maka kita dapat membuat medium yang cocok untuk menumbuhkan mikroorganisme tersebut secara laboratorium. Pembiakan mikroorganisme dalam laboratorium memerlukan medium yang berisi zat hara serta lingkungan pertumbuhan yang sesuai dengan mikroorganisme. 1.2 Tujuan Adapun tujuan dari praktikum kali ini adalah 1. Mengetahui cara pembuatan media pertumbuhan bagi mikroba. 2. Memahami teknik pemindahan secara aseptik dan berbagai sifat mikroba. 3. Mengamati pertumbuhan mikroorganisme secara visual. 1.3 Aplikasi Adapun aplikasi dari praktikum ini yaitu : a. Dapat mengembangbiakkan mikroba. b. Dapat menumbuhkan dan memperbanyak mikroba pada organisme lain. c. Digunakan untuk biodiesel dan untuk fermentasi etanol.
II. TINJAUAN PUSTAKA Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekulmolekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya.(1) Media digolongkan menjadi: 1. Berdasarkan bentuknya, terdiri dari media padat, media semi padat, dan media cair. 2. Berdasarkan susunan kimia, terdiri dari: a. Media sintetik/media siap saji, adalah media yang dibuat dari bahan-bahan yang diketahui dengan pasti yang biasanya banyak diproduksi oleh pabrik. b. Media non sintetik/media alami, adalah media yang dibuat dari bahanbahan alami yang susunan kimianya tidak diketahui dengan pasti. c. Media semi-sintetik adalah media yang tersusun oleh campuran bahanbahan alami dan bahan-bahan sintetis. 3. Berdasarkan fungsi, terdiri dari media penguji, media diperkaya, media selektif, media diferensial, media untuk menghitung mikroba dan media khusus. (1) Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media : 1. Agar Agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse untuk membuat media. Jika dicampur dengan air dingin, agar tidak akan larut. Untuk melarutkannya harus diasuk dan dipanasi, pencairan dan pemadatan berkalikali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar, terutama pada ph yang asam
2. Peptone peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai. 3. Meat extract Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak, limpa, plasenta dan daging sapi. 4. Yeast extract Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin ( B complex ). 5. Karbohidrat Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunakan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll. Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%. (1) Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg dan unsur pelikan/trace element. 1. Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau anorganik sesuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam organik. 2. Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea 3. Vitamin-vitamin. (1) Adapula persyaratan tertentu bagi media, agar mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembangbiak di dalam media tersebut, yaitu: 1. Dalam keadaan steril ( tidak ditumbuhi mikroorganisme lain ) 2. Harus mengandung unsur hara yang dibutuhkan untuk pertumbuhan dan perkembangan mikroorganisme. 3. Mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan ph yang sesuai dengan kebutuhan mikroorganisme. (1)
Mikroorganisme terdapat dimana-mana, oleh karena itu mikroorganisme lain yang tidak dikehendaki dapat masuk kedalam biakan murni melalui aliran udara, kontak tangan yang tercemar, atau melalui tersentuhnya media atau permukaan tabung bagian dalam oleh benda yang belum disterilkan.biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri dari satu spesies tunggal Sehingga untuk mencegah mikroorganisme lain yang tidak dikehendaki perlu digunakan teknik aseptik, dimana semua peralatan maupun media pertumbuhan yang akan digunakan pada teknik ini harus dalam keadaan steril/aseptik. (1) Ada beberapa metode untuk memindahkan biakan murni dari satu wadah ke wadah yang lain secara aseptik, yaitu : 1. Metode streak/gores Metode memindahkan mikroorganisme dengan cara menggoreskan ujung jarum ose loop pada permukaan media. 2. Metode spread/sebar Metode memindahkan mikroorganisme dengan cara meneteskan biakan bakteri lalu disebarkan dengan alat spread dari gelas bentuk L secara merata. 3. Metode pour plate/cawan tuang Metode memindahkan mikroorganisme dengan cara meneteskan biakan bakteri kemudian menuangkan larutan nutrient. 4. Metode tusuk Metode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan ujung jarum ose yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke dalam media. (2) Ada beberapa macam media yang digunakan untuk inokulasi yaitu : 1. Mixed culture : berisi dua atau lebih spesies mikroorganisme. 2. Plate culture : media padat dalam petridish. 3. Slant culture : media padat dalam tabung reaksi. 4. Stap culture : media padat dalam tabung reaksi, tetapi penanamannya dengan cara penusukan. 5. Liquid culture : media cair dalam tabung reaksi. 6. Shake culture : media cair dalam tabung reaksi yang penanamannya dikocok. (2)
Beberapa media yang sering digunakan secara umum dalam mikrobiologi, yaitu : 1. Lactose Broth Lactose broth digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran koliform dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (preenrichment broth) untuk Salmonellae dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri pada umumnya. 2. EMBA (Eosin Methylen Blue Agar) Media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti S. aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella. 3. Nutrient Agar Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. 4. Nutrient Broth Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Intinya sama dengan nutrient agar. 5. MRSA (demann Rogosa Sharpe Agar) MRSA merupakan media yang diperkenalkan oleh De Mann, Rogosa, dan Shape (1960) untuk memperkaya, menumbuhkan, dan mengisolasi jenis Lactobacillus dari seluruh jenis bahan. 6. Potato Dextrose Agar (PDA) PDA digunakan untuk menumbuhkan atau mengidentifikasi yeast dan kapang 7. VRBA (Violet Red Bile Agar) VRBA digunakan untuk perhitungan kelompok bakteri Enterobactericeae. (3)
III. PROSEDUR PERCOBAAN 3.1 Alat Dan Bahan ALAT 1. Autoclave : pensteril alat dan media 2. Petridish : media tempat pembiakan 3. Tabung reaksi : tempat biakan mikroba 4. Kapas dan kasa : untuk menutup tabung reaksi 5. Alumunium foil : untuk menutup medium 6. Magnetic Stirer : pengaduk 7. Kaca arloji : wadah untuk menimbang bahan 8. Jarum ose : memindahkan bakteri ke medium 9. Lampu spritus : membakar jarum 10. Erlenmeyer : wadah 11. Spatula : pengaduk 12. Hot plate : pemanas BAHAN 1. Ekstrak Daging : sumber protein 2. Kentang : sumber karbohidrat 3. Saccharomyces cereviceae : jamur yang akan dibiakkan 4. E.Coli : bakteri yang akan dibiakkan 5. Aquadest : pelarut 6. Agar : pemadat 7. Dextrose : sumber mineral dan carbon
3.2 Skema Kerja A. Pembuatan Medium Nutrient Agar ( NA ) Miring 1,5 gram daging ekstrak daging medium panas medium steril - Dipotong kecil - Dimasukkan ke dalam beaker gelas 250 ml - + 125 ml aquadest - Dipanaskan hingga mendidih - Disiapkan erlenmeyer 250 ml berisi 3 g agar dan 2,5 g kentang - Disaring dengan kain kasa - + 125 ml aquadest - Diaduk sampai homogen dan mendidih - Dituang 5 ml medium ke dalam tabung reaksi dan 10 ml ke dalam pentridish - Disterilkan dengan autoclave selama 20 menit pada suhu 120 0 C, termasuk medium sisa. - Tabung reaksi berisi 5 ml medium diletakkan pada posisi miring dalam entkas - Medium 10 ml dituang dalam pentridish - Dibiarkan dingin dan padat Medium Nutrient Agar ( NA ) Miring
B. Pembuatan Medium Potatoes Dextrose Agar (PDA) 30 gram kentang - Dipotong kecil - Dimasukkan ke dalam beaker gelas 250 ml - + 150 ml aquadest - Dipanaskan hingga mendidih - Disiapkan erlenmeyer 250 ml berisi 3 g ekstrak kentang medium panas medium steril agar dan 3 g dextrose - Disaring dengan kain kasa - + 125 ml aquadest - Diaduk sampai homogen dan mendidih - Dituang 5 ml medium ke dalam tabung reaksi dan 10 ml ke dalam pentridish - Disterilkan dengan autoclave selama 20 menit pada suhu 120 0 C, termasuk medium sisa. - Tabung reaksi berisi 5 ml medium diletakkan pada posisi miring dalam entkas - Medium 10 ml dituang dalam pentridish - Dibiarkan dingin dan padat Medium Potatoes Dextrose Agar (PDA)
C. Teknik Pemindahan Mikroorganisme Secara Aseptik Tabung agar berisi biakan mikroba dan medium agar miring yang steril Biakan murni Media steril - Pegang dengan tangan kiri - Ambil jarum ose dengan tangan kanan - Pijarkan jarum ose pada lampu spiritus hingga merah - Diangkat, sumbat dengan kelingking tangan kanan - Angkat, sumbat dengan jari manis tangan kanan - Panaskan mulut tabung ( tabung biakan Biakan mikroba ngan murni dan tabung medium steril ) - Ambil dengan jarum ose dan di inokulasikan ke media steril dengan cara zig-zag Amati pertumbuhan koloni - Panaskan mulut tabung dan tutup tabung dengan jari kanan - Perlakuan sama utuk tabung berikutnya
Medium pentridis,tabung berisi biakan - Pegang dengan tangan kanan - Buka tutup dan panaskan - Pijarkan jarum ose dan ambil biakan Tabung berisi biakan dengan cara zig-zag dan tutup pentridis - 1 ml air steril, digoyangkan dan dituang dalam pentridis - Tambah medium Amati pertumbuhan koloni - Inkubasi dalam enkas
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Percobaan A. PDA untuk bakteri Saccharomyces cereviceae B. NA untuk bakteri E.Coli
4.2 Pembahasan Pada praktikum kali ini pembuatan media pertumbuhan mikroba dan teknik pemindahan secara aseptik dilakukan pengamatan selama 3 hari. Dimana mikroba yang sudah di didapatkan hasil : 1. Pada biakan miring, bakteri yang tumbuh kurang baik pada NA (Nutrient Agar) karena penggoresan yang kurang sempurna dan mungkin juga terkontaminasi oleh mikroba lainnya. 2. Pada media petridish didapatkan mikroba yang cukup baik pada NA dan sangat baik pada PDA (Potatoes Dextrose Agar). Ini ditandai dengan terbentuknya mikroba pada medium yang berkelompok dan berkoloni. NA (Nutrien Agar) dibuat dari ekstrak daging yang berguna sebagai sumber protein. NA disini berfungsi sebagai media pertumbuhan E.Coli. Selain NA, media pertumbuhan padat lainnnya yaitu PDA (Potatoes Dextrose Agar) yang dbuat dari ekstrak kentang yang berfungsi sebagai sumber karbohidrat dan media untuk pertumbuhan Saccharomyches cereviceae. Sebelum menggunakan media, terlebih dahulu disterilkan dalam autoclave selama 15 menit pada suhu 121 0 C. Ini bertujuan mikroba yang tidak diinginkan tidak ikut tumbuh. Begitu juga pemindahan secara aseptik, harus dilakukan dengan steril. Pada praktikum ini, yaitu pembuatan media pertumbuhan mikroba dan teknik pemindahan secara aseptik, media yang digunakan adalah agar-agar. Agar-agar ini digunakan sebagai media semi padat. Sedangkan untuk pertumbuhan digunakan daging dan ekstrak kentang sebagai sumber protein dan karbohidrat bagi mikroba. Dimana mikroba tersebut diinkubasi selama beberapa hari yang dibuat pada medium dengan bentuk zig-zag. Bentuk zig-zag bertujuan memenuhi syarat aseptik dan juga bertujuan untuk memperpanjang jalur pertumbuhan mikroba sehingga mikroba yang tumbuh akan lebih banyak. Pertumbuhan mikroorganisme pada biakan miring digunakan untuk mendapatkan biakan murni. Sedangkan pertumbuhan mikroorganisme pada media petridish digunakan untuk mengembangbiakkan mikroorganisme sehingga dapat diperoleh dalam jumlah yang lebih banyak
V. KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Dari praktikum yang telah dilakukan,dapat disimpulkan sebagai berikut : a. Pada medium PDA jamur Saccharomyces cereviceae tumbuh dengan baik pada petridish dan tabung reaksi (biakan miring),sedangkan pada NA bakteri E.Coli tidak tumbuh dengan baik, yang di petridish maupun tabung reaksi. b. Mikroba yang tumbuh dengan baik jika berkelompok dan berkoloni. 5.2 Saran Untuk kelancaran praktiukum selanjutnya, disarankan sebagai berikut : a. Peralatan dan bekerja harus dalam keadaan steril b. Sewaktu penuangan media ke dalam petridish, usahakan cairan media menyebar merata menutupi permukaan petridish.
DAFTAR PUSTAKA 1. www.scribd.com. Jenis Media Pembuatan Pemindahan Mikroba. 2. Surbakti, Trianda. 2010. Inokulasi Mikroba. Universitas Padjadjaran : Jatinangor. 3. Partic, Li. 2008. Media Pertumbuhan Mikroorganisme. Dunia Mikro.
JAWABAN PERTANYAAN 1. Jenis-jenis media pertumbuhan, yaitu : a. Berdasarkan konsentrasi - medium padat - medium cair - medium semipadat b. Berdasarkan fungsi - medium diferensial - medium kering - medium selektif - medium khusus c. Berdasarkan susunan kimia - medium anorganik - medium organik - medium sintetik - medium non sintetik 2. Cara mengisolasi bakteri dan jamur di alam: a. metoda cawan gores b. metoda cawan tuang c. aseptik d. penyaringan e. sterilisasi dengan uap panas 3. Cara menghitung konsentrasi spora pada jamur a. Pengenceran [sel] = jumlah koloni pada cawan x pengenceran X = [sel] = 10 4, diencerkan 10 x = 10 5 b. Penggunaan perhitungan petrats transtes [sel] = jumlah sel 25 kotak x volume kotak x pengenceran 1 kotak = 1 mm 3 c. Penggunaan turbidimetri / nefelometri Menghitung kecepatan bakteri dalam larutan yang diberi cahaya