LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI PEWARNAAN TAHAN ASAM Kamis, 12 Maret 2015 Kelompok II Senin, Pukul 10.00 13.00 WIB Nama NPM R.A Siti Nur Azizah 260110130013 LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN 2015 Nilai TTD ( Sani ) ( Casuarina )
PEWARNAAN TAHAN ASAM I. Tujuan Mengamati dua kelompok bakteri, yaitu bakteri tahan asam dan bakteri tak tahan asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam pewarnaan (Ziehl-Neelsen). Memahami setiap langkah dan reaksireaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut. II. Prinsip a. Pewarnaan tahan asam atau disebut juga pewarnaan ziehl Neelsen merupakan teknik pewarnaan yang digunakan untuk mewarnai bakteri golongan Mycrobacterium ( M. tuberculosis/ M. leprae ) dan Actinomycetes. b. Penetrasi zat warna merupakan mekanisme masuknya zat warna ke dalam dinding sel atau membrane sel, yang disebut juga sebagai difusi zat. c. Impermeabilitas dinding sel bakteri tahan asam memiliki sifat impermeable terhadap zat pewarna atau bahan kimia lainnya karena susunan dinding selnya yang terdiri dari lemak dengan arabinogalaktan dan peptidiglogikan di bawahnya. d. Pewarnaan dengan pemanasan pada dinding sel bakteri bertujuan untuk memuaikan dinding sel sehingga zat pewarna dapat masuk, pada pemanasan ini tidak terlalu panas karena akan menyebabkan dinding sel bakteri rusak. III. Teori Dasar Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk
mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Mastra, Nyoman, dkk. 2014). Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri yaitu berantai karbon (C) yang panjangnya 8 95 dan memiliki dinding sel yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA antara lain Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Nocandia meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae. Mycobacterium tuberculose adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan penyakit tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga digolongkan sebagai bakteri tahan asam (BTA). Penularan Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan pernafasan. Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol asam). Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan carbol fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna (Lay, 1994). Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada pemberian warna pertama, yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat mempertahankannya. Carbol fuchsin merupakan fuksin basa yang dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah pada sediaan dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu
pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasan untuk melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol fuchsin dapat masuk sewaktu BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat warna pertama tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menutup pori-pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat berwarna merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan zat warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru (Lay, 1994). Metode Ziehl-Neelsen digunakan karena cukup sederhana dan mempunyai sensitivitas serta spesifitas yang cukup tinggi. Spesifitas dan sensitivitas yang tinggi sebenarnya dimiliki oleh metode fluorokrom. Bakteri yang terwarnai menunjukkan warna yang kontras dengan lingkungannya dan tidak membutuhkan perbesaran sampai 1000x sehingga bisa mempercepat waktu. Akan tetapi, alat yang digunakan tidak ada yaitu mikroskop fluorescens (Martin.,2013). Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang lurus atau sedikit melengkung, tidak berspora dan tidak berkapsul. Bakteri ini berukuran lebar 0,3 0,6 mm dan panjang 1 4 mm. Dinding M. tuberculosis sangat kompleks, terdiri dari lapisan lemak cukup tinggi (60%) (Rinda, 2014 ). Penyusun utama dinding sel M. tuberculosis ialah asam mikolat, lilin kompleks (complex-waxes), trehalosa dimikolat yang disebut cord factor, dan mycobacterial sulfolipids yang berperan dalam virulensi. Asam mikolat merupakan asam lemak berantai panjang (C60 C90) yang dihubungkan dengan arabinogalaktan oleh ikatan glikolipid dan dengan peptidoglikan oleh jembatan fosfodiester. Unsur lain yang terdapat pada dinding sel bakteri tersebut adalah polisakarida seperti arabinogalaktan dan arabinomanan. Struktur dinding sel yang kompleks tersebut menyebabkan bakteri M. tuberculosisbersifat tahan asam, yaitu apabila
sekali diwarnai akan tetap tahan terhadap upaya penghilangan zat warna tersebut dengan larutan asam alcohol (Pearce Evelyn.,2009 ) Di samping ciri-ciri ini, kadar resap pewarna pada sel yang tahan asam adalah rendah dibandingkan dengan sel tak tahan asam. Ciri-ciri ini disebabkan oleh perbedaan komposisi kimia (secara kuantitatif dan kualitatif) bakteria tahan asam dan bakteria tak tahan asam. Mikobakteria yang tahan asam mempunyai karbohidrat, alkohol dan asam lemak (seperti asam mikolik) yang tersendiri. Oleh yang demikian, dalam tata cara ini object glass perlu dipanaskan sehingga uap keluar karena, dalam hal ini, pemanasan digunakan untuk terlaksananya pewarnaan dalam jangka waktu yang optimal (Syahrurachman, dkk, 1994 ). IV. Alat bahan 4,1 Bahan : - Aquadest - Asam Alkohol - Karbol Fuksin - Metilen Blue - Minyak Emersi - Suspensi bakteri Mycrobacterium tuberculosis 4.2 Alat : No. Nama Alat Gambar Alat 1. Bak pewarna
2. Botol semprot 3. Cawan petri 4. Kaca preparat 5. Kapas 6. Kertas saring 7. Mikroskop 8. Pembakar spiritus
9. Pipet tetes 10. Ose 1. Rak tabung V. Prosedur Disediakan kaca obyek yang bersih dan dibuat olesan dari suspensi bakteri, digenangi olesan bakteri dengan pewama karbol fuksin selama 5 menit, sambil dipanaskan di atas penangas air. Jaga jangan sampai terlalu panas, mendidih atau kering. dibuang zat wama yang berlebih, lalu dibilas dengan air suling. dibilas dengan zat pemucat alkohol-asam selama 15 detik atau sampai latar belakang olesan berwarna merah muda pucat. digenangi olesan dengan pewarna tandingan biru metilen selama 2 menit, dibuang zat warna yang berlebih, dibilas dengan air suling, lalu dikeringkan dengan kertas saring. diteteskan sedikit minyak imersi pada preparat, lalu diperiksa di bawah mikroskop. dimulai dengan obyektif berkekuatan terendah 10X, lalu diganti dengan lensa obyektif berkekuatan 100X. diamati dan digambarkan hasilnya. Bakteri tahan asam (ZN + ) akan berwarna merah dan bakteri tidak tahan asam (ZN -) akan berwarna biru.
VI. Data Pengamatan Perlakuan Ditambahkan karbol fuchsin sambil dipanaskan, dibilas dengan air dan keringkan. Ditambah asam alcohol,dibilas dengan air dan keringkan. Ditambah metilen blue, dibilas dengan air dan keringkan Ditambah minyak emersi Hasil VII. Pembahasan Pada praktikum ini dilakukan teknis aseptis, hal ini bertujuan untuk mencegah atau meminimaliskan adanya kontaminasi mikroorganisme baik pada sampel atau praktikan sendiri. Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasi dan mengamati bakteri yang bersifat tahan asam, bakteri ini disebut tahan asam karena akan mempertahankan zat warna perimer ketika ditambahkan larutan asam, bakteri ini memiliki rantai karbon 8-95 dan dinding selnya terdiri dari lapisan lilin, asam lemak mikolat, dan lipid sampai 60 % dari berat dinding selnya, sehingga dengan tebalnya kadar lipid pada dinding sel menyebabkan bakteri ini sulit untuk dilakukan dengan pewarnaan biasa dan perlu perwarnaan khusus. Pada praktikum ini menggunakan pewarnaan ziehl neelsen untuk identifikasi dan pengamatan bakteri tahan asam, karena metode ini merupakan salah satu metode pengujian bakteri tahan asam yang cukup sederhana dan memiliki spesipisitas dan sensitivitas yang cukup tinggi. Pada praktiknya hal yang pertama dilakukan adalah pengolesan sampel pada kaca preparat secar aseptis dalam hal ini sampel yang
digunakan merupakan Mycrobacterium tuberculosis, dengan mengambil kaca preparat yang terendam dalam etanol kemudian dikeringkan dengan kapas sampai benar-benar kering, perendaman kaca preparat ini bertujuan untuk membunuh bakteri dari praktikum sebelumnya yang masih melekat pada permukaan kaca preparat. Dimana etanol ini memiliki dua mekanisme dalam membunuh bakteri yakni dengan denaturasi protein dan pelarutan membrane lemak pada bakteri. Setelah kaca preparat kering selanjutnya dibuat pola lingkaran pada bagian belakang kaca preparat yang berfungsi sebagai tanda olesan bakteri atau sampel. Kemudiaan menyalakan api spiritus untuk melakukan fiksasi dan menjaga agar lingkungan pada proses pemindahan sampel dari cawan petri ke kaca preparat tetap dalam keadaan steril atau mencegah kontaminan lain masuk ke dalam sampel. Hal pertama yang dilakukan adalah fiksasi ose terlebih dahulu untuk mencegah adanya kontaminan yang menempel pada ose, fiksasi ose ini dilakukan dari ujung kawat dekat batang kaca ose menuju ujung loop ose, hal ini dilakukan agar panas yang dihantarkan merata serta jika ose dalam keadaan basah tentu sisa larutan pada ujung loop ose akan lebih efisien untuk dikeringkan dengan cara ini, selanjutnya ose dibiarkan dingin di tempat yang masih dekat dengan panas spiritus hal ini bertujuan agar ketika ose dimasukan ke dalam sampel tidak menyebabkan bakteri yang terkandung dalam sampel mati akibat panas dari ose. Selanjutnya mengambil sampel sebanyak satu loop ose dalam keadaan aseptis,dan oleskan ke atas kaca preparat, dimana teknik pengolesan sampel harus diperhatikan karena jika olesan terlalu tebal, maka sel-sel bakteri akan bertumpuk-tumpuk sehingga sulit untuk menentukan bentuk sel individu dan jika olesan terlalu tipis dapat menylulitkan pengamatan secara mikroskopis. Selanjutnya dilakukan fiksasi pada sampel, yang bertujuan untuk merekatkan sel bakteri pada preparat objek, setelah itu sampel yang telah difiksasi digenangi denga karbol fuksin selama 5 menit dan dilakukan pemanasan, lama waktu
yang dibutuhkan bertujuan untuk agar zat warna karbol fuksin ini dapat berpenetrasi secara sempurna ke dalam dinding sel bakteri, dan dimana karbol fuksin ini merupakan zat pewarna primer yang mengandung fucsin basa dan fenol, sehingga dengan adanya fenol pada karbol fuksin ini dapat berfungsi untuk melunakan lapisan lilin pada dinding sel bakteri sehingga cat warna fuksin dapat masuk ke dalam sel, hal ini tentu dibantu dengan proses pemanasan yang mengakibatkan terbukanya pori-pori lemak yang menutupi dinding sel bakteri sehingga fungsi fenol pada karbol fuksin dapat berjalan dengan baik, namun pada pemanasan ini sampel harus dijaga jangan sampai mengering atau terlalu panas karena akan menyebabkan bakteri mati dan tidak akan dapat teridentifikasi. Selanjutnya dilakukan pencucian dengan mengaliri aquadest pada sampel, hal ini bertujuan untuk mencegah adanya kelebihan zat warna pada sampel, kemudian ditambahkan asam alcohol selama 15 detik, penambahan ini diperlukan untuk melakukan pemucatan pada bakteri yang dimana hal ini akan menentukan bakteri tersebut tahan asam atau tidak dimana jika bakteri bersifat tahan asam, bakteri tersebut tidak akan melepaskan zat warna primer sebelumnya, namun jika non BTA maka bakteri akan melepaskan zat warna primernya. Penambahan asam alcohol ini tidak boleh dilakukan secara berlebihan karena akan menyebabkan overdekolorization sehingga BTA dan non BTA tidak dapat dipisahkan, namun jangan pula terlalu sedikit dalam penambahan asam alcohol pada bakteri karena akan menyebabkan underdecolorization yang dapat menyebabkan zat warna pada non BTA tidak seluruhnya terlepas yang mengakibatkan terjadinya ketidak akuratan dalam proses identifikasi dan pengamatan apda sampel. Selanjutnya dialiri aquadest untuk menutup pori-pori bakteri sehingga tidak terjadi lagi proses pemucatan oleh asam alcohol, dan dikeringkan dengan kertas saring untuk menyerap kelebihan aquadest pada sampel bakteri. Kemudian preparat sampel bakteri digenagi dengan metilen blue yang berfungsi
sebgai pewarna tandingan, dimana pewarna ini yang akan menunjukan adanya bakteri non tahan asam, karena bakteri ini akan melepaskan pewarna primer dan menyerap pewarna sekunder atau tandingan. Kemudian dibilas dengan aquadest yang berfungsi untuk mencegah adanya kelebihan zat warna pada sampel, selanjutnya dikeringkan dengan kertas saring yang erfungsi unuk menyerap kelebihan aquadest pada sampel, selanjutnya ditambahkan minya emersi karena cahaya yang datang dibiaskan melalui 2 medium yang berbeda, yaitu udara dan kaca. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu bahan yang mampu membiaskan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan pembiasan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan pembiasan yang mendekati garis normal adalah minyak emersi. Selain itu, minyak emersi juga mempunyai indeks bias yang mendekati atau identik dengan kaca,sehingga dapat memfokuskan sampel bakteri pada pengamatan mikroskop, Setelah ditambahkan minyak emersi dilakukan pengamatan dengan menggunakan mikroskop pada perbesaran 10 x 10 dan 10 x 100, berdasarkan hasil praktikum ini diperoleh hasil pengamatan latar belakang berwarna biru terang dan basil bakteri berwarna merah pucat, hal ini menunjukan adanya bakteri tahan asam pada sampel yakni berupa Mycrobacterium tuberculosis, bakteri ini bersifat pathogen di dalam tubuh baik pada manusia maupun hewan, dan bersifat kronis karena mebutuhkan waktu yang lama agar menimbulkan infeksi pada host nya, berbentuk batang langsing, lurus atau berbentuk filament. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora, non motil, tahan asam, dan merupakan bakteri gram positif.
VIII. Kesimpulan dan Saran 8.1 Kesimpulan 1. pewarnaan dengan teknik ziehl neelsen merupakan peawarnaan untuk melakukan identifikasi dan pengamatan bakteri tahan asam, dimana pada prosesnya menggunakan karbol fuksin sebagai zat pelunak dinding sel bakteri yang disertai pemnasan untuk memuaikan pori-pori sel bakteri, dan penambahan asam alcohol berfungsi sebgai zat pemucatan, serta metilen blue sebagai pewarna tandingan. 2. Perbedaan antara bakteri tahan asam ( BTA ) dan bakteri non tahan asam adalah dilihat dari hasil akhir pewarnaan, dimana pada BTA akan menghasilkan warna merah pucat atau warna zat primernya ssedangkan non BTA akan memiliki warna biru atau sesuai dengan pewarna tandingannya. 8.2 Saran Dalam praktikum ini, diharapkan seluruh praktikan menggunakan APD (Alat Pelindung Diri ),serta dapat meningkatkan dan ketelitian dan keterampilan dalam melakukan identifikasi dan pengamatan bakteri.
DAFTAR PUSTAKA Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga Grafindo Persada. Martin. 2013. Pewarnaan BTA. Tersedia online di : http://majour.maranatha.edu/index.php/jurnal-kedokteran/article/view/65/pdf [diakses pad 16-03-2015 ]. Mastra, Nyoman, dkk. 2014. Bakteriologi. Denpasar : Politektnik Kesehatan Denpasar Jurusan Analis Kesehatan. Pearce Evelyn. 2009. Anatomi dan Fisiologi untuk Paramedis. Yuliani Sri, penerjemah; Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama. Terjemahan dari: Anatomy and Physiology for Nurses. Rinda. 2014. Bakteri 1. Bakteri tahan Asam. Tersedia online di: http://rindachie.weng.com/menu/labs/bakteri-5.html [ diakses pad 16-03-2015 ]. Syahrurachman, dkk. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi. Jakarta: UI Press.