LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI BLOK INFEKSI TROPIS UJI IDENTIFIKASI BAKTERI Disusun Oleh : Alexander Dicky 1218011008 Andhika Razannur H. 1218011014 Asoli Giovano 1218011024 Bobi K. Hartanto 1218011028 Fairuz Rabbaniyah 1218011048 Galih Prasetio 1218011056 Kautsar Ramadhan 1218011090 M. Arya Laksa 1218011098 PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS LAMPUNG Desember 2013
BAB I HASIL PRAKTIKUM Pada tanggal 10, 12, dan 13 Desember 2013 kami melakukan praktikum mikrobiologi mengenai beberapa uji identifikasi kultur yang meliputi hal-hal berikut: 1. Teknik pewarnaan, yakni pewarnaan gram, dan pewarnaan negatif 2. Kultur bakteri, yakni dengan media agar darah, dan media agar Macconkey 3. Uji biokimia yakni TSIA (Triple Sugar Iron Agar), dan SIM (Sulfur Indol Motility), serta 4. Uji resistensi antimikroba Bakteri yang kami identifikasi adalah sampel bakteri dalam tabung reaksi dengan label C Dari praktikum yang telah kita lakukan, didapatkan data yaitu: 1. Teknik Pewarnaan Jenis Pewarnaan Hasil Pewarnaan Negatif basil berkapsul Pewarnaan Gram basil gram (-) 2. Kultur Bakteri Media Kultur Agar Darah Agar Macconkey Hasil koloni sedang, abu-abu, smooth, anhaemolytic koloni sedang, merah bata, smooth, sedikit cembung, berkabut
3. Uji Biokimia Jenis Uji Biokimia TSIA SIM Hasil warna kuning pada dasar dan lereng tabung, terbentuk rongga berisi udara/gas fermentasi glukosa, sukrosa, dan laktosa (+) tidak membentuk warna kehitaman H 2 S (-) penetesan reagen kovacs menghasilkan cincin merah pada permukaan medium indol (+) sedikit gelembung di sekitar daerah inokulasi motilitas (+) tidak membentuk warna kehitaman H 2 S (-) 4. Uji Resistensi Antimikroba Suspensi bakteri C yang terstandar 0.5 McFarland yang digoreskan pada permukaan petri agar MH (Mueller Hinton) tidak terlalu memenuhi seluruh permukaan petri, sehingga tidak didapatkan hasil uji resistensi yang seharusnya. Maka dapat disimpulkan bahwa bakteri tersebut adalah Escherichia coli dengan rincian karakterisitik sebagai berikut. Jenis Identifikasi Hasil Pewarnaan Gram basil gram (-) Pewarnaan Negatif basil berkapsul Agar Darah koloni sedang, abu-abu, smooth, anhaemolytic Agar Macconkey koloni sedang, merah bata, smooth, sedikit cembung, berkabut TSIA fermentasi glukosa, sukrosa, laktosa (+), H 2 S (-) SIM indol (+), motilitas (+), H 2 S (-)
BAB II PEMBAHASAN Dalam percobaan praktikum pembiakan kultur bakteri yang dilakukan pada tanggal 10, 12, dan 13 Desember 2013, kami melakukan praktikum dengan urutan: - Hari pertama = Pewarnaan gram dan negatif bakteri + Pembiakan kultur - Hari kedua = Uji biokimia yakni TSIA (Triple Sugar Iron Agar), dan SIM (Sulfur Indol Motility), serta Uji resistensi antimikroba - Hari ketiga = Pengamatan serta pengambilan data Berdasarkan hasil praktikum yang telah kami lakukan, didapatkan bahwa kultur bakteri berlabel C yang kami dapat berkemungkinan besar adalah bakteri Esceherichia coli, terlebih apabila telah dilakukan tes Simmon s Citrate (SC) dengan hasil negatif. Namun, dalam praktikum kali ini kami tidak melakukannya, karena terbatasnya reagen. Tetapi dari hasil praktikum yang telah kita lakukan selama 3 hari tersebut kami mendapatkan beberapa karakteristik yang HARI PERTAMA Pada hari pertama kita melakukan percobaan pewarnaan gram dan juga pewarnaan negatif untuk melihat jenis dari mikroorganisme yang akan kita pakai, apakah berupa bakteri gram negatif atau bakteri gram positif, juga melaksanakan percobaan kultur/perbenihan bakteri menggunakan media agar yaitu agar... dan agar darah. Percobaan ini dilakukan tidak hanya untuk melihat apakah bakteri tersebut adalah bakteri gram positif ataupun negatif, tetapi juga untuk dapat mengetahui media yang cocok untuk pertumbuhan koloni bakteri. Pewarnaan Gram Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya(counterstain) berupa zat warna safranin atau air fuchsin.
Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853 1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Teknik pewarnaan gram Alat dan bahan - Kultur bakteri (berumur 24-48 jam pada media cair) - Pewarna kristal violet - Metil alkohol - Pewarna safranin - Lampu bunsen - Mikroskop cahaya - Gelas objek - Ose bulat - Minyak emersi, kertas lensa Prosedur pewarnaan 1. Siapkan alat dan bahan 2. Beri label dan bersihkan objek glass 3. Bakar ose bulat diatas bunsen sampai membara 4. Ambil kultur bakteri menggunakan ose bulat didekat lampu bunsen 5. Oleskan bakteri pada ose bulat secara merata pada objek glass 6. Bakar lagi ose bulat sampai membara dan simpan 7. Fiksasi bakteri pada objek glass dengan cara di panaskan diatas bunsen 8. Teteskan kristal violet pada objek glass, tunggu sekitar 1-3 menit setelah itu bilas dengan air 9. Fiksasi bakteri pada objek glas menggunakan metil alkohol, sampai warna birunya hilang setelah itu bilas dengan air 10. Teteskan safranin tunggu sekitar 1-2 menit setelah itu bilas dengan air 11. Teteskan minyak emersi pada objek glass 12. Lihat dibawah mikroskop cahaya
Hasil Berdasarkan hasil praktikum, didapatkan gambaran mikroskop bahwa spesimen berwarna kemerahan yang mengindikasikan bahwa bakteri yang berlabel C tersebut adalah bakteri gram negatif. Pada perbesaran 100x diketahui bahwa bentuk bakteri gram negatif ini adalah batang yang pendek yang menyerupai kokus (kokobasil). Sehingga dapat disimpulkan bakteri berlabel C ini adalah bakteri gram negatif dengan bentuk kokobasil. Berikut ini merupakan bakteri-bakteri gram negatif yang kami duga sebagai bakteri berlabel C yang dimaksud : 1. Escherichia coli 2. Salmonella Sp. 3. Bakteri Aerobacter aerogenes 4. Serratia marcescens 5. Pseudomonas aerogenosa 6. Klebsiella pnuemonia 7. Proteus mirabilis Pewarnaan negatif (tinta India) Zat warna asam tunggal digunakan untuk mewarnai latar belakang sekitar sel disebut pewarnaan negatif. Terdapat dua keuntungan pewarnaan negatif, yaitu (1) didapatkan bentuk dan ukuran sel yang lebih akurat karena prosedur pewarnaan tidak membutuhkan pemanasan atau pewarnaan pada sel (yang dapat menyebabkan sel mengkerut) dan (2) memudahkan pengamatan mikroskopik pada sel bakteri yang sulit untuk diwarnai seperti spirilli dan spirochaeta. Teknik pewarnaan negatif (tinta India) Alat dan bahan - Kultur bakteri (berumur 24-48 jam pada media cair) - Zat warna: tinta India - Mikroskop cahaya - Lampu bunsen - Gelas objek - Ose bulat
- Minyak emersi, kertas lensa Prosedur pewarnaan 1. Letakkan 1 tetes tinta India pada bagian tepi gelas objek yang bersih 2. Secara aseptic ambil 1 ose kultur cair Klebsiella pneumoniae 3. Letakkan pada tetesan tinta India pada gelas objek, campur kultur dengan tetesan. Selalu membakar ose sebelum dan sesudah digunakan 4. Ratakan tinta seperti dalam membuat apusan darah tepi 5. Amati menggunakan mikroskop cahaya Hasil Berdasarkan hasil praktikum, didapatkan gambaran mikroskop dengan perbesaran 100x, terlihat daerah kecil transparan berbentuk batang pendek (kokobasil) dengan perbatasan yang amat tegas, sementara daerah lainnya berwarna lebih gelap (kehitaman karena tinta india). Kultur Bakteri Kultur bakteri (pertumbuhan bakteri pada media pertumbuhan) sangat penting pada proses isolasi dan identifikasi bakteri. Media kompleks yang mengandung berbagai nutrient organik dapat menumbuhkan berbagai spesies bakteri. Pada saat kultur bakteri tunggal ditumbuhkan pada berbagai bentuk media (cair, miring, dalam, dan plate), akan memperlihatkan berbagai bentuk pola pertumbuhan bakteri yang bersifat khas untuk masing-masing spesies, dan merupakan karakteristik kultur untuk bakteri tersebut. Karakteristik kultur suatu organisme dan membantu dalam membedakannya dengan organisme lain. Meskipun bermanfaat, namun karakteristik kultur saja tidak cukup digunakan dalam identifikasi berbagai spesies bakteri. Karakteristik kultur tersebut harus dikombinasikan dengan hasil reaksi pewarnaan dan pemeriksaan biokimia. Pada praktikum kali ini, kami menanamkan kultur bakteri tunggal berlabel C tersebut pada agar darah/blood Agar Plate (BAP) dan agar Macconkey (MC).
a. Agar Darah (Blood Agar) Agar darah merupakan media diferensial, bukan media selektif. Darah agar memungkinkan membedakan bakteri berdasarkan kemampuan mereka untuk melisiskan sel-sel darah merah. Tiga jenis hemolisis adalah sebagai berikut : 1. Beta hemolisis, yang merupakan lisis lengkap sel darah merah dan hemoglobin. Darah secara lengkap digunakan oleh mikroba. Media yang ada koloninya menjadi tidak berwarna. 2. Alfa hemolisis mengacu pada lisis parsial/lisis sebagian dari sel darah merah dan hemoglobin. Hal ini menghasilkan perubahan warna di sekitar koloni menjadi abu-abu kehijauan. 3. Gamma hemolisis, yaitu tidak terjadi hemolisis, dimana tidak ada perubahan warna dalam medium. Media agar darah disebut media universal karena dapat digunakan untuk menumbuhkan beragam jenis bakteri. Media Agar Darah juga dapat membedakan bakteri hemolitik dan bakteri non hemolitik, yang ditandai oleh adanya zona (halo) disekitar koloni. Media BAP (Blood Agar Plate) digunakan sebagai media isolasi bakteri coccus Gram (+). b. Agar Macconkey (MC) Merupakan media selektif dan diferensial yang mempunyai keistimewaan memilah bakteri enteric gram negatif dari campuran bakteri yang memfermentasikan laktosa, karena dalam MacConkey agar ini terdapat laktosa, crystal violet dan neutral red bile salt. Sehingga media ini dapat membedakan bakteri yang memfermentasi laktosa berupa koloni berwarna merah muda dan non-fermentasi yang tidak berwarna. Kemampuan E. coli memfermentasi laktosa menyebabkan penurunan ph, sehingga mempermudah absorpsi neutral red untuk mengubah koloni
menjadi merah bata. Koloni lain (S. aureus, P. aeruginosa, dan Salmonella), bila tumbuh tidak akan berwarna karena tidak mampu memfermentasi laktosa. Mikroba lain yang dapat tumbuh pada media ini antara lain Enterobacter, Proteus, Salmonella, Shigella, Aerobacter, Enterococcus. Untuk dapat membedakan genus dan spesies bakteri-bakteri yang dapat tumbuh dalam agar Macconkey, kita dapat mengidentifikasinya berdasarkan ciri khas bentuk koloni yang tumbuh dalam agar plate ini. Berikut beberapa contoh pertumbuhan koloni pada Mac Conkey Agar : Salmonella dan Shigella : serupa media Escherichia coli : merah bata dikelilingi zona keruh Enterobacter dan Klebsiella : merah muda dan mukoid Enterococcus dan Staphylococcus : kecil dan tidak terang tembus Hasil A. Agar Darah Berdasarkan hasil praktikum didapatkan bahwa koloni bakteri tunggal yang digoreskan pada BAP menghasilkan koloni sedang, abu-abu keruh, smooth (halus), anhaemolytic. Kami dapat menyimpulkan bahwa jenis bakteri ini merupakan bakteri gram negatif basil yang tidak memiliki kemampuan untuk menghemolisiskan darah, tidak terjadi perubahan warna pada daerah di dekat koloni bakteri tersebut, tidak terdapat zona lisis yang terbentuk di sekitarnya. Kemungkinan besar bakteri berlabel C yang dimaksud ini adalah bukan dari golongan bakteri gram (+) kokus karena kebanyakan bakteri gram (+) adalah bakteri yang hemolitik, sedangkan pada praktikum didapatkan tidak nampak sama sekali adanya perubahan warna koloni maupun daerah lisis di sekitar koloni (tampak seperti tidak tumbuh). B. Agar Macconkey Berdasarkan hasil kultur praktikum, didapatkan koloni bakteri yang tumbuh berukuran sedang, berwarna merah bata yang dikelilingi oleh zona yang sedikit keruh, cembung, halus, dan agak berkabut. Kemungkinan besar
karakteristik koloni yang tumbuh tersebut merupakan koloni E.coli dalam agar Mac Conkey. E.coli dalam kultur agar Macconkey memperlihatkan perubahan warna menjadi merah bata menyala dengan zona disekelilingnya yang sedikit lebih keruh. Perubahan warna yang terjadi, disebabkan karena E.coli mampu memfermentasi laktosa sehingga ph menjadi turun dan mempermudah absorpsi neutral red yang membuat warna menjadi merah. Sementara itu, hasil fermentasi laktosa berupa asam akan bereaksi dengan garam empedu yang dikandung dalam agar Macconkey dan akan membentuk endapan keruh disekitarnya. Sehingga dapat disimpulkan bahwa bakteri berlabel C ini memfermentasi laktosa. HARI KEDUA Pada hari kedua kita menggunakan kultur bakteri yang telah kita biakkan pada hari pertama di agar darah dan agar macconkey untuk melakukan praktikum uji biokimia yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri secara tepat dan efektif dalam memberikan informasi identifikasi bakteri dan juga pengujian suceptibilitas bakteri terhadap antimikrobial untuk mengetahui resistansi bakteri terhadap antimikroba. Uji Biokimia Untuk dapat menentukan genus dan spesies bakteri yang dimaksud dalam koloni bakteri berlabel C, maka perlu dilakukan uji biokimia untuk melihat karakteristik metabolik isolat bakteri tersebut. Setelah sejumlah uji biokimia dilakukan, kombinasi hasilnya akan memperlihatkan pola biokimia untuk suatu isolat yang membedakannya dengan jenis isolat bakteri lainnya. Kemudian hasil dari uji biokimia tersebut dicocokan dengan uji identifikasi yang sebelumnya dilakukan melalui pewarnaan gram, pewarnaan negatif, dan karakteristik kultur yang ditumbuhkan.
Terdapat banyak uji biokimia yang digunakan di laboratorium Mikrobiologi, yang sering digunakan antara lain: 1. Uji Katalase 2. Uji koagulase 3. Produksi 4. Produksi Indol 5. Fermentasi laktosa dan gula-gula lainnya 6. Uji motilitas 7. Uji methyl red 8. Uji Citrat Berdasarkan hasil pewarnaan gram, pewarnaan negatif, dan juga kultur agar Macconkey, didapatkan petunjuk bahwa bakteri yang dimaksud adalah bakteri gram negatif berkapsul berbentuk kokobasil, tidak menghemolisis darah, tetapi dapat memfermentasi laktosa. Jika didapatkan bakteri gram positif, maka uji biokimia yangt dilakukan adalah uji katalase, uji koagulase, dan uji DNA-ase. Sedangkan yang kami dapat adalah bakteri gram negatif yang dibuktikan melalui pewarnaan gram dengan warna merah muda dan tumbuhnya koloni bakteri tunggal dalam agar Macconkey. Sehingga dapat dilanjutkan untuk uji biokimia, yakni uji TSIA dan uji SIM. a. TSIA (Triple Sugar Iron Agar) Uji TSIA bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri yang berasal dari kelas enterobacteriaceae. Uji ini biasa juga digunakan untuk membedakan gram negatif antara yang mampu mengkatabolisme glukosa, laktosa, sukrosa, dan mampu membebaskan H 2 S atau tidak. Media ini terdiri dari 0,1% glukosa, 1% sukrosa, 1% laktosa, ferri sulfat untuk mendeteksi produksi H 2 S, protein dan indikator phenol red. Hasil positif ditandai dengan munculnya warna kuning dan merah. Warna kuning muncul karena adanya fermentasi bakteri terhadap glukosa, sukrosa, ataupun laktosa dalam konsentrasi tinggi sedangkan dalam konsentrasi gula yang rendah hanya nampak warna merah. Sedangkan hasil positif adanya H 2 S ditandai dengan adanya warna hitam.
Hasil Berdasarkan hasil praktikum, didapatkan hasil inkubasi TSIA yang didapat adalah timbulnya perubahan warna menjadi kuning pada dasar dan lereng tabung, terbentuk rongga berisi udara/gas. Hal ini menandakan bahwa koloni bakteri yang dimaksud mampu memfermentasi glukosa, laktosa, dan sukrosa sehingga dihasilkan asam yang memberikan reaksi pada indikator phenol red. Gas yang terbentuk merupakan hasil dari proses fermentasi tersebut. Sementara itu, tidak terjadi perubahan warna kehitaman pada media TSIA sehingga dapat dikatakan bakteri yang dimaksud tidak memproduksi H 2 S. b. SIM (Sulfur Indol Motility) Media SIM adalah perbenihan semi solid yang dapat digunakan untuk mengetahui pembentukan H 2 S, indol dan motility dari bakteri. Media SIM mengandung nutrisi (salah satunya pepton yang mengandung asam amino termasuk Triptofan), Iron, dan Natrium thiosulfat. Bakteri dapat mereduksi sulfur menjadi H 2 S, maka H 2 S akan bereaksi dengan zat besi (Iron) menjadi ferric sulfide yang mengendap berwana hitam (uji produksi H 2 S). Suatu bakteri yang memiliki enzim triptofanase akan mampu menghidrolisis triptofan menjadi produk-produk metabolik seperti indol, asam piruvat, dan ammonia. Keberadaan gugus indol dapat dideteksi dengan menggunakan reagent Kovacs. Indol yang bereaksi dengan reagen Kovacs akan menghasilkan cincin warna merah pada permukaan medium (uji indol). Sementara itu motilitas bakteri juga dinilai dalam uji SIM ini, bakteri yang memiliki flagel akan menunjukan motilitas (+) jika tampak adanya pelebaran atau gelembung udara di sekitar daerah inokulasi bakteri, sedangkan bakteri dengan motilitas (-) atau tidak berflagel tidak menunjukan adanya perubahan di sekitar daerah inokulasi Hasil Berdasarkan hasil praktikum, dapat terlihat bahwa bakteri yang dimaksud tidak memproduksi H 2 S karena tidak terlihat adanya endapan berwarna kehitaman yang terbentuk pada media SIM. Pada daerah di sekitar inokulasi, didapatkan sedikit gelembung udara yang menandakan bahwa bakteri tersebut motil, memiliki flagel. Kemudian, ketika diteteskan reagen Kovacs pada permukaan media SIM, didapatkan cincin berwarna merah. Hal ini menandakan bahwa bakteri yang dimaksud memiliki enzim triptofanase yang menghidrolisis triptofan menjadi indol, asam piruvat, dan amonia yang apabila bereaksi dengan reagen Kovacs memberikan warna merah.
Uji Resistensi Antimikroba Suspensi bakteri C yang terstandar 0.5 McFarland yang digoreskan pada permukaan petri agar MH (Mueller Hinton) tidak terlalu memenuhi seluruh permukaan petri, sehingga tidak didapatkan hasil uji resistensi yang seharusnya. Koloni bakteri yang seharusnya tumbuh pada permukaan agar MH tidak sama sekali tumbuh. Selain hal di atas, beberapa hal yang menyebabkan tidak tumbuhnya koloni bakteri pada permukaan agar MH adalah suspensi koloni bakteri yang digoreskan dengan kapas lidi steril terlebih dahulu mati akibat kontaminasi yang terlalu lama dengan lampu bunsen, media agar MH yang digunakan terlalu tipis, sehingga mudah terbawa oleh goresan kapas lidi steril, kultur bakteri dalam agar Mac Conkey yang digunakan sebelumnya tidak terlalu banyak dilarutkan dalam suspensi atau sudah lama mati. Uji resistensi dilakukan berdasarkan metode difusi atau uji Kirby Bauer. Suspensi bakteri terstandar 0,5 McFarland digoreskan pada permukaan petri agar MH dan cakram kertas yang berisi satu konsentrasi dari masing-masing bahan antimikrobial diletakkan pada permukaan yang telah diinokulasi. Setelah inkubasi satu malam, dilakukan pengukuran terhadap pertumbuhan bakteri (luas tidaknya zona hambat). Kemudian dilakukan interpretasi dari isolat, apakah susceptibel, intermediet, atau resisten terhadap suatu antimikrobial. Berdasarkan literatur, didapatkan bahwa 100% isolat bakteri E.coli resisten terhadap lincomycin dan danofloxacin, 80% untuk amoxyicillin dan ampicillin, 60% untuk streptomycin, 40% untuk doxycyclin, dan 20% untuk erythromycin.
BAB III KESIMPULAN Berdasarkan uji identifikasi bakteri di atas, mulai dari pewarnaan negatif hingga uji biokimia, bakteri yang dimaksud adalah E.coli dengan spesifitas sebagai berikut : 1. Pewarnaan negatif dan pewarnaan gram, didapatkan bakteri gram negatif kokobasil berkapsul 2. Kultur media agar darah, didapatkan bakteri tersebut tidak menghemolisis darah 3. Kultur media agar Mac Conkey, didapatkan bakteri tersebut memfermentasi laktosa dengan karakteristik kultur berukuran sedang, berwarna merah bata, halus, agak cembung, dan berkabut 4. Uji TSIA, didapatkan bakteri memfermentasi glukosa, laktosa, dan sukrosa, tidak memproduksi H 2 S, dan memproduksi gas CO 2 sebagai hasil reaksi fermentasi 5. Uji SIM, didapatkan bakteri tidak memproduksi H 2 S, memiliki flagel, dan memiliki enzim triptofanase 6. Uji resistensi antimikroba memerlukan ketelitian yang tinggi saat melakukan inokulasi pada permukaan agar MH, agar koloni bakteri dapat tumbuh dan dapat diinterpretasikan hasil uji resistensi yang sesuai