3 selama 1 menit, dan elongasi pada suhu 72 0 C selama 1 menit. Tahap terakhir dilakukan pada suhu 72 0 C selama 10 menit. Produk PCR dielektroforesis pada gel agarosa 1 % (b/v) menggunakan tegangan 70 volt selama ±30-40 menit. Proses selanjutnya ialah purifikasi produk PCR dari gel menggunakan Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit (Geneaid Biotech. Ltd., Taiwan). Kloning Domain KS dan Domain A ke dalam Sel E. coli DH5α. Amplikon diligasi ke dalam vektor kloning pgemt- Easy. Ligasi fragmen pengkode DNA domain KS dan domain A ke plasmid pgemt-easy dilakukan dengan mencampurkan berturut-turut 5 µl 2x Rapid Ligation Buffer (Promega), 2 µl (60 ng domain KS dan 72 ng domain A) DNA sisipan, 1µl (3 Weiss units/µl) enzim T4 DNA ligase (Promega), 1 µl (50 ng) vektor kloning pgemt-easy. Campuran kemudian dilarutkan dengan ddh 2 O hingga volume reaksi 10 µl dan diinkubasi semalam (±24 jam) dengan suhu 4 O C. Proses transformasi hasil ligasi dilakukan ke dalam E. coli DH5α, yang terlebih dahulu disiapkan menjadi sel kompeten. Pembuatan sel kompeten dilakukan dengan mengkulturkan satu koloni E. coli ke media LB selama 16 jam. Kemudian kultur diambil 500 µl dan dikulturkan kembali ke dalam media LB baru selama 2 jam. Hasil kultur E. coli diambil sebanyak 1,5 ml dan diinkubasi di dalam es selama 10 menit. Setelah itu disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm (372,29 g) selama 10 menit, kemudian pelet sel E. coli diresuspensi dengan Transformation Buffer (TFB) sebanyak 250 µl (Lampiran 2). Hasil resuspensi diinkubasi ke dalam es selama 20 menit. Proses resuspensi dengan TFB diulang kembali dan diinkubasi kembali ke dalam es selama 10 menit. Plasmid DNA rekombinan sebanyak 10 µl dicampur dengan E. coli dan diinkubasi kembali ke dalam es selama 45 menit. Campuran diberi perlakuan renjatan panas (heat shock). Proses renjatan panas dilakukan dengan memasukan campuran ke dalam penangas air yang bersuhu 42 0 C selama 45 detik dan segera dimasukkan ke dalam es selama 5 menit. Kemudian campuran ditambahkan TFB sebanyak 100 µl dan diinkubasi dalam penangas air dengan suhu 37 0 C selama 45-60 menit. Setelah itu campuran disebar dalam media luria agar (LA) yang di dalamnya terkandung ampisilin, X-gal, dan IPTG kemudian diinkubasi dengan suhu 37 O C selama 16 jam (Lampiran 2). Koloni putih yang tumbuh dikulturkan dalam media LA yang mengandung ampisilin sebagai simpanan dan dikulturkan juga ke media LB. Kultur dalam media luria broth (LB) diisolasi plasmid rekombinannya. Plasmid rekombinan (pgemt-easy- KS dan pgemt-easy-a) yang telah diisolasi selanjutnya dipotong dengan menggunakan enzim restriksi EcoRI. Visualisasi hasil restriksi dilakukan dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1 % (b/v). Plasmid rekombinan selanjutnya disekuen dan dilakukan analisis bioinformatika. Analisis Bioinformatika. Sekuen dari domain KS dan domain A pada plasmid rekombinan dianalisis dengan menggunakan program Bioedit dan BLAST dari National Center for Biotechnology Information (NCBI). Sekuen dicari homologinya dengan sekuen domain KS yang sudah dipublikasi dengan menggunakan CLUSTAL W (ncbi.nlm.nih.gov). HASIL Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antibakteri Sebanyak 18 isolat bakteri yang berasosiasi dengan Iso act 6 spons diuji aktivitas antibakterinya terhadap bakteri uji, baik yang patogen (S. aureus, V. harveyi, P. aeruginosa, dan EPEC K-11) maupun nonpatogen (B. subtilis dan E. coli). Hasil dari penapisan bakteri didapatkan beberapa isolat bakteri yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji. Hal ini ditandai dengan zona bening di sekitar goresan bakteri pada permukaan media yang mengandung bakteri uji (Tabel 1). Bakteri endofit dapat menghambat sekitar 2-4 bakteri uji. Bakteri uji yang dapat dihambat bakteri endofit ialah B. subtilis, E. coli, S. aureus, dan P. aeruginosa. Bakteri permukaan dapat menghambat sekitar 2-5 bakteri uji. Bakteri uji yang dapat dihambat bakteri permukaan ialah B. subtilis, E. coli, S. aureus, V. harveyi, dan P. aeruginosa. EPEC merupakan bakteri uji yang tidak dapat dihambat pertumbuhannya, sedangkan bakteri uji V. harveyi hanya dapat dihambat oleh satu bakteri permukaan.
4 Iso 8 (a) Iso 8 (b) Iso 95 40, Iso 46, Iso 8, Iso 47, Iso 67, Iso 95,Iso act 1, Iso act 16, Iso act 2, Iso 53, Iso 20, Iso 23, Iso 100, dan Iso 10). Demikian pula bakteri permukaan HAA 02 dan HAA 06 hanya dapat menghambat pertumbuhan C. albicans. Baik bakteri endofit ataupun bakteri permukaan tidak ada yang dapat menghambat pertumbuhan C. tropicalis. (Gambar 2, Tabel 1). Iso 23 Iso 10 c) (d) HAA 06 Gambar 1 Zona hambatan di sekitar koloni bakteri pada pengujian dengan (a) S. aureus, (b) V. harveyi, (c) P. aeruginosa, dan (d) EPEC. Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antifungi Hasil penapisan bakteri yang dapat menghambat pertumbuhan Candida albicans yaitu bakteri endofit (HAL 87, Iso act 6, Iso Iso 10 (a) (b) Gambar 2 Zona hambatan di sekitar koloni bakteri pada pengujian dengan (a) C. albicans, dan (b) C. tropicalis. Berdasarkan uji aktivitas antimikrob didapatkan 12 isolat bakteri yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri Tabel 1 Hasil penapisan bakteri yang berasosiasi dengan spons yang memiliki aktivitas antibakteri dan antifungi Isolat Bakteri Uji Fungi Uji B. subtilis E. coli EPEC P. aeruginosa S. aureus V. harveyi C. albicans C. tropicalis HAA 02 + + + + + + - + + + + + + + - + + + - Iso act 6 + + + - - + + + + + + - + + + - Iso 40 + + + - - - - - - - Iso 46 - - - - - - - - Iso 8 - + + + - + + + + + + - + + + - Iso 47 - - - - - - - - Iso 67 - - - - - - - - Iso 95 + + + + + + - - - + + - - iso act 1 - - - + + + + + + - - - Iso act 16 - - - - - - - - Iso act 2 - + + + - + + + + + + - + + + - Iso 53 - - - - - - - - HAA 06 - - - + + + + + + - + + + + - Iso 20 - - - + + + + + + - + + + - HAL 87 - + + + - - - - - - Iso 23 - + ++ - + + + + + + - + + + + - Iso 100 - - - - - - - - Iso 10 - + + + - + + + + + + - + + + + - Keterangan ukuran zona bening = (+): 1-5 mm, (++): 5-10 mm, (+++): 10-15 mm, (++++): 15-20 mm; (-): tidak menunjukkan adanya aktivitas HAA : Isolat yang diisolasi dari permukaan Iso, HAL : Isolat yang diisolasi dari endofit
5 uji dan fungi uji yang lebih baik. Isolatisolat bakteri tersebut ialah HAA 02, Iso act 6, Iso 8, Iso act 2, Iso 95, Iso act 1, Iso 40, HAA 06, HAL 87, Iso 23, Iso 20, dan Iso 10. Amplifikasi Domain KS dan Domain A DNA genom dari 12 isolat bakteri diamplifikasi dengan proses polymerase chain reaction (PCR). Hasil amplifikasi domain KS dan domain A pada gel agarosa 1% (b/v) menunjukkan pita berukuran sekitar 700 pb untuk domain KS (Gambar 3) dan sekitar 1000 pb untuk domain A (Gambar 4). Hasil amplifikasi domain KS dan domain A dari 12 isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons tersebut menunjukkan bahwa ke-12 isolat tersebut memiliki domain KS dan domain A. L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 3000 pb 1000 pb 750 pb domain KS (700 pb) Gambar 3 Elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) hasil amplifikasi domain KS untuk 12 isolat yang berasosiasi dengan spons Haliclona sp. Ket: (L) 1 Kb Ladder, (1) HAA 02, (2) Iso act 6, (3) Iso 8, (4) Iso act 2, (5) Iso 95, (6) Iso act 1, (7) Iso 40, (8) HAA 06, (9) HAL 87, (10) Iso 23, (11) Iso 20, (12) Iso 10. L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 3000 pb 1000 pb domain A (1000 pb) Gambar 4 Elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) hasil amplifikasi domain A untuk 12 isolat yang berasosiasi dengan spons Haliclona sp. Ket: (L) 1 Kb Ladder, (1) HAA 02, (2) Iso act 6, (3) Iso 8, (4) Iso act 2, (5) Iso 95, (6) Iso act 1, (7) Iso 40, (8) HAA 06, (9) HAL 87, (10) Iso 23, (11) Iso 20, (12) Iso 10.
6 Koloni putih Kloning Domain KS dan Domain A Dalam Sel E. coli DH5α Dua isolat dipilih untuk proses pengklonan domain KS dan domain A ke dalam sel E.coli DH5α, yaitu isolat Iso 10 dan HAA 02. Iso 10 menjadi contoh dari bakteri endofit dan HAA 02 menjadi contoh dari bakteri permukaan. Keduanya memiliki aktivitas antimikrob. Selain itu Iso 10 dan HAA 02 juga memiliki domain KS dan domain A berdasarkan hasil verifikasi dengan elektroforesis. Hasil klon domain KS dari Iso 10 menunjukkan adanya koloni putih dan koloni biru (Gambar 5), sedangkan hasil klon dari domain A dari isolat Iso 10 tidak terdapat koloni putih dan biru. Hasil klon domain KS dan domain A dari isolat HAA 02 tidak menunjukkan adanya koloni putih. Hal ini menandakan proses pengklonan domain KS dan domain A dari isolat HAA 02 tidak berhasil. Gambar 5 Koloni putih E. coli DH5α pada isolat Iso 10 yang diduga membawa plasmid rekombinan. Verifikasi Hasil Kloning Domain KS dan Domain A Koloni putih dari Iso 10 untuk domain KS dipilih untuk proses isolasi plasmid. Plasmid rekombinan hasil isolasi plasmid dari beberapa koloni putih E.coli DH5α diduga ialah pgemt-easy-10-ks. Plasmid yang diduga rekombinan dipotong dengan enzim EcoRI dan menghasilkan dua pita dengan ukuran yang berbeda. Pita pertama berukuran 3000 pb yang menunjukkan ukuran pgemt-easy, sedangkan pita kedua berukuran 700 pb yang sesuai dengan ukuran domain KS berdasarkan Schirmer et al. (2005) (Gambar 6). Hal ini menunjukkan bahwa pengklonan domain KS Iso 10 berhasil disisipkan pada E. coli DH5α. Selain itu, plasmid rekombinan yang membawa domain KS tersebut telah terpotong oleh enzim EcoRI. Koloni biru 3000 pb 750 pb Gambar 6 Elektroforesis gel agarosa 1% dari pgemt-easy-10-ks yang dipotong dengan EcoRI. Analisis Bioinformatika Palsmid rekombinan dari isolat Iso 10 yang diduga membawa domain KS selanjutnya dilakukan sekuensi (Lampiran 3). Hasil analisis didapatkan sekuen Iso 10 KS tidak sesuai dengan domain KS. Berdasarkan hasil dari amplifikasi PCR dan verifikasi hasil restriksi Iso 10 sesuai dengan domain KS, sehingga sekuen Iso KS dihomologikan dengan sekuen dari uncultured bacteria yang telah dipublikasikan dan dinyatakan telah memiliki domain KS (Lampiran 4). Accesion number dari sekuen-sekuen uncultured bacteria tersebut, yaitu AAW84215, AAW84218, AAW84193, dan AAW84190. Proses ini digunakan untuk mendapatkan homologi antara sekuen Iso KS dengan sekuen domain KS lainnya. Hasil analisis didapatkan bahwa 49-51% dengan sekuen-sekuen domain KS lainnya (Tabel 2). pgemt-easy domain KS (700 pb)
7 Tabel 2 Analisis homologi sekuen Iso 10 KS terhadap sekuen domain KS asal GenBank Accesion Number Organisme Homologi (%) AAW84215 Uncultured bacteria 51 % AAW84218 Uncultured bacteria 50 % AAW84193 Uncultured bacteria 49 % AAW84190 Uncultured bacteria 49 % PEMBAHASAN Proses penapisan bakteri yang berasosiasi dengan Haliclona sp. dilakukan dengan menguji adanya aktivitas antibakteri dan antifungi. Penapisan dilakukan terhadap bakteri yang terdapat pada bagian endofit dan permukaan dari spons Haliclona sp. yang berasal dari Pulau Waigeo, wilayah Raja Ampat, Provinsi Papua Barat (Tokasaya 2010). Sebanyak dua isolat bakteri permukaan dan 16 isolat bakteri endofit yang digunakan dalam proses penapisan bakteri. Isolat bakteri endofit adalah bakteri yang berasal dari bagian mesohyl, yaitu lapisan yang luas dari jaringan ikat spons bagian dalam. Umumnya bakteri yang berasal dari mesohyl terdapat dalam jumlah yang berlimpah. Hal ini karena aliran air yang mengandung partikel makanan dialirkan ke dalam mesohyl oleh sel yang berflagella (choanocytes). Berlimpahnya nutrisi menjadikan mesohyl sebagai tempat tinggal komunitas bakteri yang padat (Taylor et al. 2007). Isolat bakteri endofit berbeda dengan bakteri yang terdapat pada bagian permukaan spons. Bakteri permukaan terdapat dalam jumlah yang lebih sedikit dibandingkan bakteri mesohyl. Ketersediaan nutrisi yang lebih sedikit pada bagian permukaan dibandingkan dengan bagian mesohyl dapat menjadi penyebabnya (Taylor et al. 2007). Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu P. aeruginosa adalah bakteri aerob, berbentuk batang, dan termasuk bakteri Gram negatif. Isolat ini termasuk dalam bakteri patogen oportunistik, yaitu bakteri yang dapat mengeksploitasi inang saat pertahanan inangnya melemah. Bakteri patogen yang lain yaitu S. aureus, adalah bakteri Gram positif yang sering ditemukan dalam bagian pernapasan manusia. Hal ini menjadikan S. aureus sebagai penyebab beberapa infeksi serius pada manusia seperti, pneumonia dan meningitis. Bakteri V. harveyi merupakan bakteri patogen terhadap udang dan ikan, sedangkan EPEC merupakan bakteri yang patogen terhadap manusia. EPEC dapat menyebabkan diare dan banyak ditemukan pada negara berkembang (Madigan et al. 2006). Fungi uji yang digunakan ialah C. albicans dan C. tropicalis, keduanya merupakan khamir patogen pada manusia. C. albicans menyerang bagian mulut, organ pencernaan, dan organ kelamin, sedangkan C. tropicalis menyerang kulit, bagian pencernaan, organ kelamin wanita, dan kerongkongan (Calderone & Fonzi 2001). Hasil uji aktivitas antibakteri, menunjukkan isolat-isolat bakteri dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji bakteri patogen (P. aeruginosa, S. aureus, dan V. harveyi) dan nonpatogen (B. subtilis dan E. coli). Zona bening di sekitar koloni yang merupakan zona hambatan berukuran rata-rata 10-15 mm (Gambar 1). Bakteri uji yang dapat dihambat bakteri endofit ialah B. subtilis, E. coli, S. aureus, V. harveyi, dan P. aeruginosa. Bakteri uji yang dapat dihambat bakteri permukaan ialah B. subtilis, E. coli, S. aureus, dan P. aeruginosa. Bakteri uji yang tidak dapat dihambat pertumbuhannya ialah EPEC, sedangkan bakteri uji V. harveyi hanya dapat dihambat oleh satu bakteri permukaan. Zona bening yang terdapat pada V. harveyi berukuran rata-rata 5-10 mm (Gambar 2). Seperti dilaporkan pada penelitian Abubakar (2009), isolat bakteri endofit yang berasosiasi dengan Jaspis sp. dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji lebih baik dibanding isolat bakteri permukaan. Hasil uji aktivitas antifungi menunjukkan, bakteri endofit hanya dapat menghambat pertumbuhan C. albicans. Baik bakteri endofit ataupun bakteri permukaan tidak ada yang dapat menghambat pertumbuhan C. tropicalis (Gambar 2). Seperti yang dilaporkan Tokasaya (2010), dalam penelitiannya menguji aktivitas antifungi, sebanyak 6 isolat dari 31 isolat bakteri endofit yang mampu menghambat pertumbuhan C. tropicalis. Selain itu, hanya 5 isolat dari 8 isolat bakteri permukaan yang mampu menghambat pertumbuhan C. tropicalis. HAL 87 merupakan isolat bakteri
8 endofit yang sama digunakan dalam penelitian ini dan dalam penelitian Tokasaya (2010). Hasilnya didapatkan bahwa HAL 87 memang tidak dapat menghambat pertumbuhan C. tropicalis. Selain itu, isolat bakteri permukaan yang digunakan dalam penelitian ini sama dengan penelitian Tokasaya (2010) ialah HAA 02 dan HAA 06. Namun hasil penelitian Tokasaya HAA 02 dan HAA 06 dapat menghambat pertumbuhan C. tropicalis, sedangkan dalam penelitian ini tidak. Diduga bahwa khamir C. tropicalis yang digunakan berasal dari galur yang berbeda. Hasil penapisan 18 isolat bakteri didapatkan 12 isolat (66,67%) yang memiliki potensi sebagai penghasil senyawa antimikrob (Tabel 1). Isolat-isolat bakteri tersebut memiliki aktivitas antibakteri dan antifungi dengan spektrum luas. Salah satu contoh isolat bakteri yang memiliki aktivitas antimikrob dengan spektrum luas ialah HAA 02. HAA 02 dapat menghambat pertumbuhan tiga bakteri uji dan satu fungi uji. Selain HAA 02, terdapat lima isolat bakteri lain yang dapat menghambat pertumbuhan tiga bakteri uji dan satu fungi uji. Isolat-isolat bakteri tersebut ialah Iso act 6, Iso 8, Iso act 2, Iso 23, dan Iso 10. Isolat bakteri lainnya hanya dapat menghambat pertumbuhan sekitar dua sampai tiga bakteri uji. Radjasa (2007) menyatakan bahwa, bakteri yang berasosiasi dengan Haliclona sp. memiliki spektrum aktivitas antimikrob yang luas. Sehingga bakteri asosiasi dengan Haliclona sp. dapat dimungkinkan sebagai sumber senyawa antimikrob untuk mengendalikan bakteri patogen. Senyawa bioaktif dari bakteri yang berasosiasi dengan spons laut mungkin memiliki gen biosintesis metabolit sekunder yaitu PKS dan NRPS. Proses PCR dapat dilakukan untuk melihat ada atau tidaknya gen PKS dan NRPS pada suatu bakteri. Metode PCR dapat menjadi suatu cara untuk memperkirakan kekayaan produsen metabolit sekunder hasil asosiasi dengan spons Haliclona sp. dan mempelajari keragaman gen bakteri pada spons lain (Radjasa et al. 2007). Sebanyak 12 genom dari isolat bakteri diuji dengan PCR. Primer PCR dirancang secara khusus untuk domain KS dan domain A. Primer degeneratif tersebut diacu berdasarkan Schirmer (2005). Hasil amplifikasi domain KS dan domain A pada gel agarosa 1% (b/v) menunjukkan pita berukuran sekitar 700 pb untuk domain KS (Gambar 3) dan sekitar 1000 pb untuk domain A (Gambar 4). Hal ini menunjukkan bahwa 12 isolat tersebut memiliki domain KS dan domain A. Hal ini memungkinkan 12 isolat memiliki gen hibrid PKS-NRPS (Gambar 3 & 4). Hibrid PKS-NRPS dapat terjadi dengan kombinasi domain pada modul NRPS dengan domain pada modul PKS dalam satu open reading frame. Gen hibrid PKS-NRPS dapat menghasilkan senyawa bioaktif dengan struktur hibrid (Ansari et al. 2004, Zhu et al. 2009) Sebanyak dua isolat dipilih dari 12 isolat untuk pengklonan domain KS dan domain A ke dalam sel E. coli DH5α yaitu HAA 02 dan Iso 10. Isolat Iso 10 untuk domain KS menghasilkan koloni putih dan biru (Gambar 5). Isolat Iso 10 memiliki domain KS. Hal tersebut didukung dengan verifikasi hasil isolasi plasmid dan proses pemotongan plasmid (restriksi) dengan EcoRI. Hasil verifikasi mendapatkan dua pita dengan ukuran yang berbeda berukuran 3000 pb dan 700 pb (Gambar 6). Pengklonan domain A untuk Isolat Iso 10 dan HAA 02 tidak menghasilkan koloni putih dan biru. Hal ini diduga proses pengklonan domain A pada Iso 10 dan HAA 02 tidak berhasil. Hasil analisis dengan BLAST diidentifikasikan Iso 10 tidak memiliki domain KS. Iso 10 memiliki maximum identity sebesar 92% sebagai putative transcriptional regulator (Stenotrophomonas maltoph). Berdasarkan hasil amplifikasi PCR dan verifikasi hasil pemotongan plasmid (restriksi) didapatkan ukuran pita dari plasmid Iso 10 sesuai dengan domain KS. Hasil analisis didapatkan bahwa Iso 10 memiliki kemiripan sekitar 49-51% dengan sekuensekuen domain KS. Sekuen domain KS yang mirip merupakan organisme uncultured bacteria yang telah dipublikasikan (Lampiran 4). Seperti dilaporkan dalam penelitian Schirmer (2005), sebanyak 256 sekuen dari isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons memiliki tingkat homologi yang cukup rendah. Tingkat kehomologian untuk sekuen KS berdasarkan database yang ada termasuk rendah, yaitu sekitar 49-79%. Berdasarkan hal tersebut, isolat Iso 10 berhomologi dengan domain KS walaupun hanya 49-51%.