1 BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit infeksi yang masih menjadi masalah kesehatan masyarakat yang utama di dunia. Mycobacterium tuberculosis, agen penyebab TB yang masih merupakan masalah global. Sepertiga dari populasi dunia diperkirakan telah terinfeksi Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) dan jumlah kasus baru yang timbul menyebabkan gangguan kesehatan di antara jutaan orang setiap tahunnya. Berdasarkan data WHO, pada tahun 2012 diperkirakan 8,6 juta orang penderita TB dan 1,3 juta orang meninggal akibat penyakit ini, termasuk 320.000 kematian dengan HIV positif. Kasus terbanyak dilaporkan dari Asia Tenggara, Afrika, dan daerah Pasifik Barat (WHO, 2013). Asia Tenggara dan wilayah Pasifik Barat secara kolektif menyumbang 58% dari kasus TB di dunia pada tahun 2012. Wilayah Afrika memiliki seperempat dari kasus TB di dunia dengan tingkat tertinggi kasus dan kematian dibandingkan dengan rasio jumlah penduduk. India dan China dilaporkan dengan jumlah kasus terbesar, Afrika Selatan dan Swaziland memiliki tingkat insiden tertinggi per kapita. Indonesia sendiri dilaporkan terdapat 331.424 kasus TB dari 247 juta populasi, dan 2.676 kasus TB dengan HIV positif berdasarkan data WHO tahun 2012. Data kasus tersebut menempatkan Indonesia pada peringkat keempat untuk kasus TB di dunia (WHO, 2013; WHO, 2014). 1
2 World Health Organization telah menerbitkan laporan tahunan pada kontrol global TB setiap tahun sejak 1997 yang bertujuan untuk memberikan informasi komprehensif berdasar penilaian terbaru terhadap epidemi TB dan kemajuan dalam perawatan dan pengendalian TB pada tingkat regional, negara dan global. Kemajuan menuju target Global yang ditetapkan untuk tahun 2015 diberikan perhatian khusus, termasuk target MDGs (Millennium Development Goals) bahwa kejadian TB harus diselesaikan pada tahun 2015. Beberapa strategi pengendalian TB dilakukan untuk eliminasi dan meminimalisir kasus TB secara global. Program DOTS (Directly Observed Treatment Shortcourse) dan penggunaan vaksin BCG memiliki sedikit dampak terhadap kejadian TB dan memburuk dalam beberapa kasus. Meskipun WHO memperkirakan bahwa aplikasi luas pengobatan dengan pengawasan dan pemantauan secara langsung, strategi DOTS jangka pendek dapat mengurangi beban TB global sebesar 50% dalam waktu 10 tahun (WHO, 2010; Murphy et al., 2007). Penggunaan vaksin BCG paling banyak diberikan dari semua vaksin dan memiliki cakupan tertinggi dari setiap vaksin pada program imunisasi WHO, akan tetapi tampaknya BCG memiliki dampak epidemiologi yang kecil pada TB (WHO, 2010). Sebagai upaya, penelitian besar sedang dilakukan untuk mengembangkan vaksin TB baru. Penelitian banyak ditujukan untuk meningkatkan pemahaman tentang imunopatogenesis TB dengan mempelajari interaksi organisme penyebab infeksi dan host manusia. Para peneliti telah mengurutkan genom lengkap dari M. tuberculosis, yang akan memberikan kesempatan untuk menjawab pertanyaan mengenai virulensi, patogenesis, dan 2
3 persisten. Pada saat yang sama, kandidat vaksin baru sedang dikembangkan dan diuji pada hewan model misalnya, vaksin subunit, vaksin DNA, dan strain mikobakteri hidup yang dilemahkan (MMWR, 1998). Vaksin saat ini telah diperkenalkan lebih dari 80 tahun yang lalu adalah vaksin hidup yang dilemahkan M. bovis Bacillus Calmette-Geurin (BCG). Bacillus Calmette-Geurin diketahui melindungi anak-anak terhadap bentuk parah dari TB namun tidak efisien dan konsisten melindungi orang dewasa terhadap bentuk paling umum dari penyakit ini, pada TB paru dilaporkan perlindungan BCG berkisar 0% sampai 80%, selain itu BCG tidak memberi perlindungan terhadap pembentukan TB laten dan reaktivasi TB berikutnya (Zvi et al., 2008). M. tuberculosis dan BCG dikenali oleh APC (Antigen Presenting Cell) pada sebagian besar makrofag dan sel dendritik yang mempresentasikan antigen melalui jalur MHC II dan menghasilkan stimulasi sel T CD4. Sel T CD8 yang distimulasi oleh MHC I diketahui juga berperan dalam kekebalan terhadap infeksi M. tuberculosis. Bukti terbaru menunjukkan bahwa M. tuberculosis menginduksi apoptosis pada sel yang terinfeksi yang pada gilirannya menghasilkan pembentukan vesikel yang membawa antigen Mycobacterium yang dapat dikenali oleh APC. Antigen tidak hanya menstimulasi MHC I dan sel T CD8, tetapi juga melewati mekanisme imunosupresif terhadap sel yang terinfeksi. Bacillus Calmette-Geurin (BCG) diketahui hanya menginduksi apoptosis dan stimulasi sel T CD8 yang lemah (Grode et al., 2005). 3
4 Vaksinasi BCG melindungi bayi baru lahir dari isolat Mycobacterium konvensional, tetapi tampaknya BCG telah kehilangan efikasi vaksin terhadap isolat yang baru muncul, terutama dari famili M. tuberculosis Beijing atau genotipe W. Penelitian vaksin rekombinan BCG dengan murine aerosol menggunakan dua jenis TB yang berbeda, strain laboratorium H37Rv dan isolat klinis famili genotipe Beijing/W, penelitian menunjukkan rbcg menginduksi perlindungan yang sama terhadap kedua strain Mycobacterium (Grode et al., 2005). Pada prinsipnya strategi vaksinasi TB saat ini yang diduga terdiri dari vaksin profilaksis yang ditujukan untuk pencegahan penyakit, dan vaksin BCG dengan atau tanpa rekombinan antigen yang disekresikan oleh bakteri pada saat replikasi dan dikenali selama tahap awal infeksi misalnya ESAT-6 atau Ag85A/B, atau mutan pelindung. Vaksin TB lainnya yang dikembangkan antara lain vaksin hidup dilemahkan pengganti BCG, dan vaksin yang belum teridentifikasi pasca infeksi ditujukan untuk peningkatan efektivitas BCG yang bertujuan untuk eliminasi TB laten dan pencegahan reaktivasi TB. Pengembangan vaksinasi TB berlanjut dengan dikembangkan bentuk vaksin yang terdiri dari vaksin profilaksis dengan subunit protein, vektor virus atau vaksin berbasis DNA, berdasarkan induksi stadium antigen dalam tahap aktif, seperti pada transisi dari replikasi ke non-replikasi, antigen latensi, atau tahap resusitasi atau reaktivasi, harus memiliki dampak maksimum pada semua tahap infeksi M. tuberculosis (Zvi et al., 2008). Beberapa tahun terakhir telah terjadi terobosan penting dalam pengembangan peningkatan vaksin TB profilaksis. Kandidat vaksin, sebagian 4
5 besar terpilih sebagai produk single gene, meliputi: vaksin rbcg, misalnya rbcg30-mengekspresikan Ag85B, vaksin rekombinan berbasis virus, misalnya MVA85A Rv3804c diekspresikan dalam virus vaccinia, strain MTB hidup dilemahkan, dan vaksin subunit yang terdiri dari antigen sekresi (secreted antigen) dominan yang dapat meningkatkan respon imun tubuh setelah diawali dengan BCG, misalnya Mtb72F, fusi Ag85B dan ESAT-6 (Zvi et al., 2008). Protein sekretoris (Secreted Protein) dan protein permukaan dinding sel adalah antigen besar yang dikenali oleh komponen sistem imun terhadap infeksi M. tuberculosis dan M. bovis. Pada penelitian dengan tikus dan kelinci, percobaan menunjukkan imunisasi dengan seluruh filtrat kultur, sumber kaya protein ekstraseluler dapat melindungi hewan coba sampai batas tertentu terhadap infeksi berikutnya dengan basil tuberkel (Zvi et al., 2008). Sebuah fraksi utama dari protein ekskretori filtrat kultur M. tuberculosis dan M. bovis BCG adalah kompleks Ag85. Protein antigen 85 (Ag85) yang disekresikan terdapat pada permukaan dinding sel Mycobacterium. Ekspresi protein Ag85 diperlukan untuk kelangsungan hidup M. tuberculosis dalam makrofag dan dianggap sebagai faktor virulensi. Tiga anggota protein Ag85 dengan berat molekul 30 32 kda, meliputi Ag85A, Ag85B dan Ag85C, ketiga protein ini memiliki aktivitas enzimatik mycolyl-transferase yang diperlukan untuk biogenesis faktor penghubung (trehalosa-dymycolate). Protein yang disandi oleh tiga gen paralogus fbpa, fbpb dan fbpc, terletak di daerah yang berbeda dari genom bakteri. Kebanyakan studi imunologis telah difokuskan pada Ag85A dan Ag85B, sedikit yang diketahui 5
6 tentang protein ketiga ini, Ag85C (Kuo et al., 2013). Kedua Ag85A dan Ag85B adalah kandidat yang menjanjikan untuk vaksin tuberkulosis di masa depan. Banyak penelitian pada hewan model menunjukkan bahwa vaksinasi dengan rekombinan Ag85A atau protein Ag85A dapat menginduksi respon imun yang kuat dengan sekresi sitokin Th1 yang signifikan, antara lain IL-2 dan IFN-γ yang penting dalam mengatur sejumlah sel-sel imun dan menginduksi sel sitotoksik (Wang et al., 2010). Antigen 85A (Ag85A) Mycobacterium, yang dikodekan pada gen fibronectin binding protein-a (fbp-a) dengan ukuran nukleotida 1017 bp dan penyandi protein dengan berat molekul 32 kda, merupakan salah satu protein yang disekresikan oleh M. tuberculosis dan M. bovis. Antigen 85A memiliki kemampuan induksi proliferasi sel T yang kuat dan produksi IFN-γ di sebagian besar orang sehat yang terinfeksi M. tuberculosis, M. leprae dan tikus yang divaksinasi BCG, namun induksi tidak terjadi pada pasien Tuberkulosis atau kusta lepromatosa. Gangguan gen yang menyandi Ag85A pada M. tuberculosis, fbpa, menghasilkan strain yang gagal untuk memanipulasi makrofag manusia atau tikus, hasil ini menunjukkan bahwa Ag85A mungkin memainkan peran kunci terhadap patogenesis M. tuberculosis (Wang et al., 2010; Kuo et al., 2013). Bukti bahwa beberapa protein ekskretoris M. tuberculosis berperan penting terhadap patogenesis penyakit dan peran imunostimulan yang secara langsung berinteraksi dengan sistem imun host yang menunjukkan kandidat sebagai potensi target vaksin, termasuk Ag85A dan Ag85B yang sering digunakan sebagai antigen dalam tahap pengembangan vaksin TB saat ini pada uji klinis. Keduanya 6
7 diekspresikan selama tahap awal infeksi M. tuberculosis dan berperan dalam sintesis dan perakitan komponen dinding sel. Bila tingkat pertumbuhan menurun, maka sintesis mycolyl transferase kurang dibutuhkan dan ekspresi protein Ag85A akan berkurang. Oleh karena itu, langkah diambil untuk menuju identifikasi target vaksin yang memiliki profil ekspresi yang lebih konstitutif dan kemudian uji efektivitas dilakukan untuk perlindungan dari vaksin TB. Salah satu langkah yang dapat dilakukan dengan penggunaan protein rekombinan untuk memproduksi protein Ag85A dalam skala besar (Kuo et al., 2013; Zvi et al., 2008). Protein rekombinan adalah suatu protein yang dikode oleh urutan DNA spesifik yang telah mengalami rekombinasi dan disebut protein rekombinan. Rekombinasi DNA adalah segmen-segmen DNA target yang bergabung dengan DNA vektor kloning yang terdapat di dalam bakteri. Penggunaan protein rekombinan dipilih karena produksi protein rekombinan dapat dibuat dalam skala besar dalam waktu yang singkat karena produksi protein dibantu oleh bakteri sehingga dapat digunakan untuk uji imunogenisitas sebagai evaluasi vaksin (Snustad et al., 2003; Sambrook et al., 2001). Produksi Ag85A yang dilakukan dengan teknologi rekombinan menggunakan bantuan bakteri E. coli sebagai inang. Teknologi rekombinan dapat dilakukan melalui tahap amplifikasi, kloning, dan ekspresi protein rekombinan. Amplifikasi Ag85A adalah salah satu prosedur yang menentukan keberhasilan pembuatan protein rekombinan. Amplifikasi Ag85A bertujuan untuk memperbanyak fragmen DNA yang dilakukan secara in vitro dengan metode PCR dan menggunakan primer spesifik Ag85A sehingga reaksi amplifikasi DNA 7
8 terjadi pada target DNA. Fragmen DNA yang mengandung gen target dan berhasil diamplifikasi, penyisipan dilakukan ke dalam vektor yang berperan sebagai pembawa gen yang akan ditransformasikan ke sel inang (Xie et al., 2002; Sambrook et al., 2001). Berbagai aplikasi teknik DNA rekombinan dilakukan dan tidak hanya membuat molekul DNA rekombinan, tetapi juga perlunya memilih desain vektor kloning yang tepat untuk memasukkan urutan gen atau DNA yang diklon. Desain vektor dan pemilihan inang ekspresi yang tepat merupakan salah satu pendekatan yang penting untuk memaksimalkan produksi protein rekombinan. Sebagian besar vektor kloning yang umum digunakan berasal dari plasmid atau kromosom bakteriophage (Snustad et al., 2003). Salah satu contoh vektor kloning adalah vektor pet yang mempunyai kemampuan menghasilkan protein dalam skala besar dengan melibatkan lac promoter T7. Salah satu contoh vektor pet adalah pet SUMO yang didesain untuk memfasilitasi proses kloning dari produk PCR langsung, regulasi ekspresi dalam E. coli dan pemurnian protein target. Oleh karena itu, peneliti tertarik untuk melakukan kloning dan ekspresi molekuler Ag85A M. tuberculosis dengan menggunakan pet SUMO vektor dan ditransformasi ke dalam E. coli sebagai host untuk mengetahui ekspresi protein Ag85A M. tuberculosis. 8
9 B. Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang yang menjelaskan tentang strategi pengendalian TB melalui program DOTS dan penggunaan vaksin BCG yang masih memiliki sedikit dampak terhadap kejadian TB. Beberapa penelitian besar sedang dilakukan untuk mengembangkan vaksin TB baru sebagai upaya pengendalian TB. Bukti bahwa beberapa protein ekskretoris M. tuberculosis berperan penting terhadap patogenesis penyakit dan peran imunostimulan yang secara langsung berinteraksi dengan sistem imun host yang menunjukkan kandidat sebagai potensi vaksin, termasuk Ag85A dan Ag85B yang sering digunakan sebagai antigen dalam vaksin TB saat ini. Keduanya terutama diekspresikan selama tahap awal infeksi M. tuberculosis berperan dalam sintesis dan perakitan komponen dinding sel. Banyak penelitian pada hewan model menunjukkan bahwa vaksinasi dengan rekombinan Ag85A atau protein Ag85A dapat menginduksi respon imun yang kuat dengan sekresi sitokin Th1 yang penting dalam mengatur sejumlah sel-sel imun dan menginduksi sel sitotoksik sehingga Ag85A ditargetkan menjadi kandidat vaksin TB. Antigen 85A (Ag85A) Mycobacterium tuberculosis, yang dikodekan pada fibronectin binding protein-a (fbp-a) merupakan salah satu protein yang disekresikan oleh M. tuberculosis. Ekspresi Ag85A diperlukan untuk kelangsungan hidup bakteri di dalam makrofag dan dianggap sebagai faktor virulensi. Bila tingkat pertumbuhan menurun, maka sintesis mycolyl transferase kurang dibutuhkan dan ekspresi protein Ag85 akan berkurang. Salah satu langkah yang dapat dilakukan untuk identifikasi target vaksin adalah dengan penggunaan teknologi DNA rekombinan untuk 9
10 memproduksi protein Ag85A yang stabil. Teknologi rekombinan dapat dilakukan melalui tahap amplifikasi, kloning, dan ekspresi protein rekombinan. Desain vektor dan pemilihan inang ekspresi yang tepat merupakan salah satu pendekatan yang penting untuk memaksimalkan produksi protein rekombinan. Salah satu contoh vektor kloning adalah vektor pet yang mempunyai kemampuan menghasilkan protein dalam skala besar dengan melibatkan lac promoter T7. Salah satu contoh vektor pet adalah pet SUMO yang didesain untuk memfasilitasi proses kloning dari produk PCR langsung, regulasi ekspresi dalam E. coli dan pemurnian protein target. Berdasarkan data tersebut, maka permasalahan yang dapat diangkat pada penelitian ini antara lain: 1. Bagaimana amplifikasi gen penyandi Ag85A M. tuberculosis dengan menggunakan primer spesifik Ag85A yang dirancang sendiri dari genom strain M. tuberculosis H37Rv? 2. Bagaimana hasil kloning dan ekspresi protein Ag85A M. tuberculosis? C. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan: 1. Melakukan amplifikasi gen penyandi Ag85A M. tuberculosis dengan menggunakan primer spesifik Ag85A yang dirancang sendiri dari genom M. tuberculosis strain H37Rv. 2. Memperoleh klon E. coli BL21 yang dapat mengekspresikan Ag85A M. tuberculosis. 10
11 D. Keaslian Penelitian Penelitian mengenai kloning dan ekspresi molekuler Ag85A M. tuberculosis telah dilakukan oleh Xie et al., pada tahun 2002 di China meliputi kloning dan ekspresi imunodominan protein Ag85A M. tuberculosis strain H37Rv. Hasil menunjukkan bahwa gen penyandi Ag85A M. tuberculosis strain H37Rv berhasil diamplifikasi dengan menggunakan PCR. Plasmid rekombinan stabil dan mengekspresikan protein rekombinan Ag85A dengan berat molekul 32 kda. Penelitian oleh Lakey et al., pada tahun 2000 melakukan kloning dan ekspresi Ag85A dan Ag85B, dengan menggunakan ptrchisb vektor dan E. coli TOP10 sebagai ekspresi host untuk ekspresi rekombinan protein. Perbedaan penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah vektor kloning yang digunakan pada penelitian ini yakni pet SUMO vektor. Penelitian kloning dan ekspresi Ag85A M. tuberculosis di Indonesia belum pernah dilakukan. E. Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai kloning dan ekspresi gen penyandi Ag85A M. tuberculosis yang dapat dimanfaatkan sebagai pengembangan ilmu kedokteran dan kesehatan serta sebagai salah satu sumber informasi untuk melakukan penelitian lebih lanjut. 11