JURNAL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM IDENTIFIKASI MIKROBA METODE PEWARNAAN GRAM NAMA NIM KELOMPOK ASISTEN : CLAUDIA PERTIWI MALIK : G31116510 : III (TIGA) : MUHAMMAD IQBAL MUSTAFA LABORATORIUM MIKROBIOLOGI DAN BIOTEKNOLOGI PANGAN PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN DEPARTEMEN TEKNOLOGI PERTANIAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2017
IDENTIFIKASI MIKROBA METODE PEWARNAAN GRAM Claudia Pertiwi Malik 1), Muhammad Iqbal Mustafa 2) Abstrak Pewarnaan Gram adalah satu teknik pewarnaan untuk mengidentifikasi bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Tujuan pada praktikum ini adalah untuk mengetahui prinsip identifikasi mikroba metode pewarnaan Gram, mengetahui fungsi larutan dalam pewarnaan Gram, mengetahui penggunaan mikroskop cahaya dan mengetahui fungsi pewarnaan Gram. Prinsip pewarnaan Gram adalah dinding sel bakteri gram positif terdiri atas lapisan peptidoglikan yang tebal menjadikan afinitasnya tinggi terhadap kristal violet dan iod membentuk senyawa sukar larut dalam alkohol, sehingga tetap memegang kuat zat utama ( berwarna ungu). Bahan yang digunakan adalah media PCA yang ditumbuhi bakteri Lactobacillus casei. Metode pewarnaan Gram yaitu pemberian larutan Kristal violet untuk memberikan warna ungu pada mikroba sebagai pewarna primer, safranin untuk memberikan warna merah pada mikroba sebagai pewarna sekunder, iodine untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri, untuk membilas kristal violet,iodin dan safranin, dan alkohol untuk membilas larutan zat pewarna primer. Hasil yang didapatkan dilihat menggunakan mikroskop yaitu bakteri berdempetan atau terlalu dekat satu sama lain, terlihat juga berwarna ungu dan berbentuk batang yang berarti bakteri tersebut adalah Lactobacillus casei yang berbentuk basil dan merupakan bakteri Gram Positif. Kata kunci : Bakteri Gram positif, Bakteri Gram negatif, Identifikasi mikroba I. PENDAHULUAN I.1 Latar Belakang Identifikasi mikroba bertujuan untuk mengetahui secara detail karakter fisik, kimiawi, dan bologis mikroba sehingga dapat diketahui dan dimanfaatkan secara optimal. Sedangkan tujuan dari pewarnaan Gram adalah untuk mengidentifikasi mikroba (Waluyo, 2005). Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur. Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung (Dwidjoseputro, 2005). Bakteri Gram positif adalah adalah bakteri yang dinding selnya menyerap 1) Praktikan Mikrobiologi Umum 2) Asisten Mikrobiologi Umum warna violet dan memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal. Ciri ciri bakteri Gram positif yaitu homogen dan tebal (20-80 nm) sebagian besar tersusun dari peptidoglikan sebagian lagi terdiri dari polisakarida lain dan asam teikoat, bulat, batang atau filamen. Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang dinding selnya menyerap warna merah, dan memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis. Ciri - ciri bakteri gram negatif adalah memiliki dinding tidak terlalu tebal (peptidoglikan) yang mengandungasam tekoat, menghasilkan toksin bersifat endotoksin, dan tidak resisten terhadap pinisillin (Karmana, 2008). Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negative, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Tujuan dari pewarnaan Gram adalah untuk mengidentifikasi mikroba. Prinsip pewarnaan Gram adalah dinding sel bakteri
gram positif terdiri atas lapisan peptidoglikan yang tebal menjadikan afinitasnya tinggi terhadap kristal violet dan iod membentuk senyawa sukar larut dalam alkohol, sehingga tetap memegang kuat zat utama (berwarna ung). Metode tersebut diberi nama berdasarkan penemunya ilmuwan Denmark, Hans Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun 1884 untuk membedakan antara Pneumococcus dan bakteri Klebsiella pneumonia (Karmana, 2008). Metode pewarnaan Gram yaitu pemberian larutan Kristal violet, safranin, iodine, alkohol, dan. Pemberian larutan Kristal violet untuk memberikan warna ungu pada mikroba sebagai pewarna primer. Pemberian larutan safranin untuk memberikan warna merah pada mikroba sebagai pewarna sekunder. Pemberian larutan iodine untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Pemberian larutan alkohol untuk membilas larutan zat pewarna primer. Pemberian larutan untuk membilas kristal violet,iodin dan safranin (Waluyo, 2005). I.2 Tujuan dan Kegunaan Tujuan dari dilakukannya praktikum ini adalah : 1. Untuk mengetahui prinsip identifikasi mikroba metode pewarnaan gram 2. Untuk mengetahui fungsi larutan dalam pewarnaan gram 3. Untuk mengetahui penggunaan mikroskop cahaya 4. Untuk mengetahui fungsi pewarnaan Gram Kegunaan dari praktikum ini agar mahasiswa dapat mengetahui fungsi dan prinsip pewarnaan Gram dalam identifikasi mikroba. II. METODOLOGI PRAKTIKUM II.1 Waktu dan Tempat Praktikum ini dilaksanakan pada Selasa, 11 April 2017, pukul 08.30 12.00 WITA, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Pangan, Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan, Departemen Teknologi Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Hasanuddin, Makassar. II.2 Alat dan Bahan Alat - alat yang digunakan adalah kaca preparat, kaca objektif, tabung reaksi, pipet tetes, penjepit, ose bundar, mikroskop dan bunsen. Bahan - bahan yang digunakan adalah media PCA yang ditumbuhi bakteri Lactobacillus casei, kristal violet, iodin, safranin,, alkohol dan tissue. II.3 Prosedur Kerja Sterilisasi meja kerja menggunakan alkohol kemudian fiksasi kaca preparat. Ambil mikroba pada cawan petri yang telah di isolasi menggunakan ose bundar. Setelah itu goreskan koloni mikroba diatas kaca preparat, kemudian fiksasi dan tambahkan larutan Kristal violet sebanyak 2 tetes dan diamkan selama 1 menit. Setelah itu fiksasi dan bilas, tambahkan larutan iodine sebanyak 2 tetes dan diamkan selama 30 detik. Setelah itu bilas, lalu fiksasi dan tambahkan alkohol kemudian bilas kembali. Tambahkan larutan safranin sebanyak 2 tetes dan bilas. Setelah itu tempelkan kaca objektif diatas kaca preparat, kemudian diamati menggunakan mikroskop cahaya. III. HASIL DAN PEMBAHASAN III.1 Hasil Adapun hasil pengamatan dari identifikasi mikroba dapat dilihat pada gambar dibawah ini :
Gambar 03. Hasil Lactobacillus casei setelah pewarnaan Gram III.2 Pembahasan III.2.1 Bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif Bakteri Gram Positif adalah adalah bakteri yang dinding selnya menyerap warna violet dan memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal. Ciri ciri bakteri Gram positif yaitu homogen dan tebal (20-80 nm) sebagian besar tersusun dari peptidoglikan sebagian lagi terdiri dari polisakarida lain dan asam teikoat, bulat, batang atau filamen, bersifat lebih rentan terhadap penisilin, pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat zat warna seperti ungu kristal. Contoh bakteri Gram positif yaitu Actinomyces, Lactobacillus, Propionibacterium, Eubacterium dan Staphylococcus. Hal ini sesuai Dwidjoseputro (2005) yang menyatakan bahwa bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang sederhana, jumlah peptidoglikan yang banyak sehingga bereaksi positif terhadap pengecatan gram. Bakteri Gram Negatif adalah bakteri yang dinding selnya menyerap warna merah, dan memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis. Lapisan peptidoglikan pada bakteri Gram negatif terletak di ruang periplasmik antara membran plasma membran luar. Ciri - ciri bakteri gram negatif adalah memiliki dinding tidak terlalu tebal (peptidoglikan) yang mengandung asam tekoat, menghasilkan toksin bersifat endotoksin, dan tidak resisten terhadap pinisillin. Contoh bakteri Gram negatif yaitu Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, Azotobacter, Helicobacter pylori dan Haemophilus influenza. Hal ini sesuai Dwidjoseputro (2005) yang menyatakan bahwa bakteri Gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis. III.2.2 Lactobacillus casei Lactobacillus casei adalah salah satu jenis bakteri asam laktat yang banyak digunakan oleh industri pangan seperti yakult, keju, dan yogurt. Lactobacillus casei merupakan bakteri non-patogen dan sangat bermanfaat untuk melindungi tubuh manusia dari penyakit. Lactobacillus casei adalah jenis bakteri Gram-positif, fakultatif anaerob, non-motil dan tidak membentuk spora, berbentuk batang, memiliki ukuran sel 0,7-1.1 x 2.0 4.0 micrometer, heterofermentatif. Hal ini sesuai Karmana (2008) yang menyatakan bahwa Lactobacillus casei merupakan termasuk bakteri Gram positif karena berbentuk batang. III.2.3 Metode Pewarnaan Gram Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). Tujuan pewarnaan Gram adalah untuk mengidentifikasi mikroba. Bakteri yang diwarnai metode Gram ini dibagi menjadi dua kelompok yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Zat warna yang digunakan pada pengecatan Gram meliputi kristal violet, yodium, alkohol dan safranin. Metode pewarnaan Gram termasuk pewarnaan diferensial. Hal ini sesuai Subandi (2012) yang menyatakan bahwa pewarnaan digunakan untuk mengetahui bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. III.2.4 Kristal Violet Kristal violet adalah zat warna yang memberi warna ungu merupakan pewarna primer atau utama yang akan memberi warna pada mikroorganisme
target. Senyawa penyusun dari kristal violet adalah dimethylaniline, oksiklorida dan asam klorida. Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Kristal violet bersifat basa mengandung ion positif sehingga mampu berikatan sel bakteri yang bersifat asam (bakteri gram positif) yang membuat dinding sel bakteri yang mengandung asam nukleat (protoplasma) berikatan ion positif kristal violet begitu sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (Ungu). Hal ini sesuai Dwidjoseputro (2005) yang menyatakan bahwa ion kristal violet akan berikatan komponen negatif pada sel bakteri sehingga berwarna ungu. III.2.5 Safranin Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder yang berwarna merah. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel - sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan alkohol. Dengan kata lain, memberikan warna pada mikroorganisme. warna ungu dalam sel bakteri Gram negatif memudar maka akan digantikan warna safranin yang sebagai pengganti warna primer (warna ungu), bakteri Gram negatif akan menyerap safranin dan menggunakannya sebagai warna bakteri tersebut. Senyawa penyusunnya yaitu safranin o, etil alkohol, dan. Sifat kimiawi yaitu safranin bersifat asam yang mengikat sel bakteri Gram negatif yang bersifat basa. Karena dinding sel bakteri Gram negatif tersusun atas lipid yang tebal, saat diteteskan alkohol lapisan lipid akan larut sehingga pori pori dinding selnya akan terbuka lebar dan warna ungu kristal violet akan keluar selanjutnya pada pemberian safranin dinding sel bakteri Gram negatif menyerap warna merah pada safranin. Sifat fisiknya yaitu berwarna merah, tidak berasa dan tidak berbau. Hal ini sesuai Karmana (2008) yang menyatakan bahwa karena telah kehilangan warna ungu, bakteri Gram negatif akan berikatan safranin dan berwarna merah. Tapi bakteri Gram positif tetap berwarna ungu karena warna safranin tidak dapat masuk, terhalang oleh adanya kompleks kristal violet-iodin. III.2.6 Iodine Iodine merupakan zat yang digunakan dalam pewarnaan Gram, yaitu sebagai pewarna mordan. Pewarna mordan adalah pewarna yang berfungsi memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Sifat dari iodin yaitu tidak berbau, berwarna coklat, dan asam. Mekanisme kerjanya adalah iodine yang banyak dan kompleks zat iodine terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme Gram positif sedangkan lipid dari sel organisme Gram negatif pencucian alkohol dapat hilang dari sel. Senyawa penyusun dari iodin adalah larutan kalii (kalium iodin) dan (iodium). Hal ini sesuai Dwidjoseputro (2005) yang menyatakan bahwa iodine berfungsi untuk mengikat zat warna primer agar tidak keluar dari sel bakteri. III.2.7 Alkohol Alkohol digunakan untuk membilas larutan zat pewarna primer. Alkohol bersifat asam basa dan tidak berwarna Solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu bakteri akan tetap berwarna ungu dan bakteri menjadi tidak berwarna. Mekanisme kerjanya adalah dekolorisasi yaitu ketika sel bakteri sudah menyerap atau melepaskan kristal violet
(warna ungu) maka alkohol akan menghilakan warna yang tidak dibutuhkan oleh sel bakteri tersebut. Mekanisme dalam mengekstraksi lipid yang membuat permeabilitas dinding sel bakteri membesar dan menyebabkan warna sekunder (safranin) masuk dan terjebak diantara dinding sel dan lapisan membran sel bakteri Gram negatif. Alkohol bersifat merusak membran sel protein dari bakteri, sehingga terjadi denaturasi protein atau pengubahan struktur protein sehingga menjadi tidak aktif. Senyawa penyusun alkohol yaitu karbon, hidrogen, dan oksida. Hal ini sesuai Subandi (2012) yang menyatakan bahwa alkohol digunakan untuk melunturkan atau membilas zat warna ungu yang mengakibatkan bakteri akan tetap berwarna ungu atau tidak berwarna. III.2.8 Aquades Aquades berfungsi untuk membilas kristal violet, iodin dan safranin. Aquades bersifat basa, tidak berbau dan tidak berwarna. Senyawa penyusun yaitu hidrogen dan oksida. Aquades menghilangkan sisa zat zat pewarna. Mekanisme kerjanya akan menghilangkan sisa sisa larutan pewarnaan Gram yang telah digunakan agar tidak dapat mempengaruhi hasil. Hal ini sesuai Subandi (2012) yang menyatakan bahwa fungsi dan kegunaan dari yaitu sebagai pelarut saat melarutkan senyawa, sebagai penjelas warna pada indikator pp, dalam suatu pembuatan media. III.2.9 Fiksasi Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik menggunakan grutaldehid proses pembakaran. Fiksasi bertujuan untuk melekatkan bakteri diatas objek glass, membunuh mikroba secara tepat tidak merusak struktur selnya, membuat sel lebih kuat, merubah afinitas cat, dan mencegah mengkerutnya globula globula protein sel. Hal ini sesuai Karmana (2008) yang menyatakan bahwa fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya. III.2.10 Hasil Pengamatan Hasil dari praktikum ini adalah bakteri yang terlihat pada mikroskop itu berdempetan atau terlalu dekat satu sama lain dan berbentuk batang. Terlihat juga warnanya berwarna ungu yang berarti bakteri tersebut termasuk bakteri Gram positif. Karakteristik Lactobacillus casei adalah bakteri Gram-positif, anaerob, tidak memiliki alat gerak, tidak menghasilkan spora, berbentuk batang dan menjadi salah satu bakteri yang berperan penting dalam pencernaan. Lactobacillus casei adalah bakteri yang bisa memecah protein, karbohidrat, dan lemak dalam makanan, dan menolong penyerapan elemen penting dan nutrisi seperti mineral, asam amino, dan vitamin yang dibutuhkan manusia dan hewan untuk bertahan hidup Hal ini sesuai Subandi (2012) yang menyatakan bahwa ciri ciri L.casei yaitu Grampositif, fakultatif anaerob, non-motil dan tidak membentuk spora, berbentuk batang, memiliki ukuran sel 0,7-1.1 x 2.0 4.0 mikrometer, heterofermentatif. IV. PENUTUP IV.1 Kesimpulan Berdasarkan praktikum yang dilakukan dapat diambil kesimpulan : 1. Prinsip identifikasi mikroba metode pewarnaan Gram adalah mewarnai bakteri untuk mengetahui bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. 2. Fungsi larutan Kristal violet adalah sebagai pewarna primer yang berwarna ungu yang akan memberikan warna pada mikroorganisme target. Safranin adalah sebagai pewarna sekunder yang berwarna merah. Alkohol adalah untuk
membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri. Aquades adalah untuk membilas larutan. Iodine berfungsi untuk memperkuat warna. 3. Menggunakan cahaya sebagai sumber media dalam mengirimkan gambar ke mata. Mikroskop memiliki dua lensa yaitu lensa objektif dan lensa okuler. Lensa objektif adalah lensa yang dekat objek sedangkan lensa okuler berfungsi untuk memperbesar bayangan. 4. Untuk mengelompokkan dan mengidentifikasi bakteri berdasarkan komposisi dinding sel. IV. Saran Sebaiknya praktikan lebih teliti dalam memberikan zat warna karena kalau terlalu tebal tidak dapat bisa diamati. DAFTAR PUSTAKA Dwidjoseputro. 2005. Dasar- Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta. Karmana. 2008. Biologi. PT. Grafindo Media Pratama. Jakarta. Subandi, 2012. MikroBiologi. PT. Remaja Rosdakarya. Bandung. Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Umum. MM Press. Malang. LAMPIRAN Lampiran 22. Diagram Alir Pewarnaan Gram Menfikasi kaca preparat Menggoreskan koloni mikroba diatas kaca preparat Menfikasasi kaca preparat kristal violet iodin alkohol safranin Mengamati mikroskop