BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan waktu penelitian Penelitian ini dilakukan pada Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi pada bulan Februari sampai Mei tahun 2012. 3.2 Alat-alat Alat alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat instrumen KCKT lengkap (Shimadzu) dengan pompa, degasser, penyuntik mikroliter (50µl), kolom Shimadzu VP-ODS (250 x 4,6 mm), detektor UV-Vis, wadah fase gerak, vial, Sonifikator (Branson 1510), pompa vakum (Gast DOA P604 BN), neraca analitik (Mettler Toledo), membrane filter PTFE 0,5 µm dan 0,2 µm, cellulose nitrate membran filter 0,45 µm. 3.3 Bahan-bahan Bahan-bahan yang digunakan adalah metanol grade for HPLC (E.Merck ), akuabides (Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi USU), cefadroxil BPFI, cefadroxil baku pabrik, kapsul cefadroxil 500 mg (PT Dexa Medica), kapsul cefadroxil 500 mg (PT Hexpharm Jaya), kapsul cefadroxil 500 mg (PT Bernofarm), kapsul cefadroxil 500 mg (PT Sanbe Farma), kapsul Longcef 500 mg (PT Dankos), kapsul Librocef 500 mg (PT Hexpharm Jaya), kapsul Alxil 500 mg (PT Bernofarm), kapsul Cefat 500 mg (PT Sanbe Farma).
3.4 Pengambilan Sampel Menurut Sudjana (2005), pengambilan sampel dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan satu tempat dengan tempat yang lain karena semua sampel dianggap homogen. Pengambilan sampel di Apotek K-24 dan Apotek Serdang Farma Medan. 3.5 Prosedur Penelitian 3.5.1 Pembuatan Fase Gerak Metanol 500 ml disaring dengan menggunakan membran filter PTFE 0,5 µm dan diawaudarakan selama 30 menit. Akuabides 500 ml disaring dengan menggunakan cellulose nitrate membrane filter 0,45 µm dan diawaudarakan selama 30 menit. 3.5.2 Prosedur Analisis 3.5.2.1 Penyiapan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Masing-masing unit diatur, kolom yang digunakan Shimadzu VP-ODS (250 x 4,6 mm), detektor UV-Vis dan dideteksi pada panjang gelombang 264 nm. Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa dijalankan dan fase gerak dibiarkan mengalir selama 30 menit dengan laju alir 1 ml/menit sampai diperoleh garis alas yang datar, menandakan sistem tersebut telah stabil. 3.5.2.2 Penentuan Perbandingan Fase Gerak yang Optimum Pada kondisi kromatografi komposisi fase gerak divariasikan untuk mendapatkan hasil analisis yang optimum. Perbandingan fase gerak metanol:air yang divariasikan adalah 50:50, 60:40, 70:30 dengan laju alir 1 ml/menit. Kondisi kromatografi yang memberikan tailing faktor paling kecil dan theoretical plate paling besar yang akan dipilih dan digunakan dalam penelitian ini.
3.5.3 Analisis Kualitatif Menggunakan KCKT 3.5.3.1 Uji Identifikasi cefadroxil menggunakan KCKT Sampel cefadroxil dengan konsentrasi 10 µg/ml diinjeksikan sebanyak 20 µl, dianalisis pada kondisi KCKT dengan perbandingan fase gerak metanol:air (60:40) dan laju alir 1 ml/menit serta panjang gelombang 264 nm. Selanjutnya untuk identifikasi, pada larutan sampel cefadroxil tersebut ditambahkan sedikit larutan cefadroxil BPFI (spiking) kemudian diinjeksikan dan dianalisis kembali pada kondisi KCKT yang sama. Diamati kembali luas area dan dibandingkan antara kromatogram hasil spiking dengan kromatogram larutan sampel sebelum spiking. Sampel dinyatakan mengandung cefadroxil, jika terjadi peningkatan tinggi puncak dan luas area pada kromatogram hasil spiking. 3.5.4 Analisis Kuantitatif 3.5.4.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Cefadroxil BPFI Ditimbang seksama sejumlah 50,0 mg cefadroxil BPFI, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, dilarutkan dan diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 500 µg/ml (LIB I). 3.5.4.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi Cefadroxil BPFI Dipipet LIB I sebanyak 0,1 ml; 0,2 ml; 0,3 ml; 0,4 ml; 0,5 ml; dan 0,6 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml, diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda. Kocok sehingga diperoleh konsentrasi 5 µg/ml, 10 µg/ml, 15 µg/ml, 20 µg/ml 25 µg/ml, dan 30 µg/ml. Kemudian masing-masing larutan disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µm, dan diinjeksikan ke sistem KCKT sebanyak 20 µl dan dideteksi pada panjang gelombang 264 nm. Dari luas area yang diperoleh pada kromatogram dibuat kurva kalibrasi kemudian dihitung persamaan garis
regresi dan faktor korelasinya. 3.5.4.3 Penetapan Kadar Sampel Ditimbang 20 kapsul untuk masing-masing jenis kapsul, kemudian digerus homogen dan ditimbang seksama sejumlah serbuk setara dengan 500 mg cefadroxil, lalu dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dan dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 10000 µg/ml, dikocok ± 5 menit, kemudian disaring dengan kertas saring, ± 5 ml filtrat pertama dibuang. Dipipet 0,05 ml filtrat, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, dan dicukupkan hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 10 µg/ml. Dikocok ± 5 menit lalu disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µm. Diinjeksikan sebanyak 20 µl ke sistem KCKT dan dideteksi pada panjang gelombang 264 nm dengan perbandingan fase gerak metanol:air (60:40), laju alir 1 ml/menit. Dilakukan sebanyak 6 kali perlakuan untuk setiap sampel. Kadar dapat dihitung dengan mensubstitusikan luas area sampel pada Y dari persamaan regresi : Y = ax + b. 3.5.4.4 Analisis Data Penetapan Kadar Secara Statistik Data perhitungan kadar dianalisis secara statistik menggunakan uji t. Menurut Harmita (2004), rumus yang digunakan untuk menghitung Standar Deviasi (SD) adalah : ( X X ) SD = n 1 2 Kadar dapat dihitung dengan persamaan garis regresi dan untuk menentukan data diterima atau ditolak digunakan rumus:
t hitung = X X SD / n Dengan dasar penolakan apabila t hitung t tabel, pada taraf kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = n 1. Keterangan : SD X X n = Standar deviasi = Kadar dalam satu perlakuan = Kadar rata-rata dalam satu sampel = Jumlah perlakuan Menurut Wibisono (2005), untuk mencari kadar sebenarnya dapat digunakan rumus: µ = X ± t 1 ( 1/ 2α ) dk SD x n Keterangan: μ = Kadar sebenarnya X = Kadar sampel n = Jumlah perlakuan t = Harga t tabel sesuai dengan derajat kepercayaan dk= Derajat kebebasan 3.5.5 Validasi Metode 3.5.5.1 Akurasi (kecermatan) Ditimbang 20 kapsul cefadroxil yang mengandung kadar zat berkhasiat 500 mg/kapsul kemudian ditentukan pada rentang spesifik 80%, 100%, dan 120%. Ditimbang serbuk yang mengandung 70% analit dari kadar zat berkhasiat lalu dilakukan prosedur yang sama seperti pada penetapan kadar sampel. Ditimbang
lagi serbuk yang mengandung 70% analit dari kadar zat berkhasiat dan 30% bahan baku lalu dilakukan prosedur yang sama seperti pada penetapan kadar sampel. Dilakukan 3 kali replikasi untuk masing-masing rentang spesifik tersebut. Menurut Harmita (2004), hasil dinyatakan dalam persen perolehan kembali (% recovery). Persen perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus: % Perolehan kembali = CF C C * A A x 100 % Keterangan : C F = konsentrasi total sampel yang diperoleh dari pengukuran (µg/ml) C A = konsentrasi sampel sebenarnya (µg/ml) C* A = konsentrasi analit yang ditambahkan (µg/ml) 3.5.5.2 Presisi (keseksamaan) Untuk menguji data presisi (RSD), diambil rata-rata dari data % perolehan kembali (9 kali replikasi) kemudian dihitung standar deviasi. Setelah itu, dihitung % RSD dengan cara standar deviasi dibagi rata-rata dari % perolehan kembali kemudian dikali 100%. Menurut Gandjar dan Rohman (2007), nilai RSD dirumuskan dengan: SD RSD = x100% X Keterangan: RSD = Relatif Standar Deviasi (%) SD X = Standar deviasi = Kadar rata-rata sampel Sementara itu, nilai SD dihitung dengan :
SD = ( X X ) ( n 1) 2 Dimana : X X n = nilai dari masing-masing pengukuran = rata-rata (mean) dari pengukuran = banyaknya data 3.5.5.3 Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ) Nilai batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) dihitung dari persamaan regresi yang diperoleh dari kurva kalibrasi. Menurut Ephstein (2004), Batas Deteksi (Limit Of Detection/ LOD) dan Batas Kuantitasi (Limit Of Quantitation/ LOQ) dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut : ( Y Yi) Sy / x = n 2 3x Sy / x LOD = Slope 10 x Sy / x LOQ = Slope Keterangan: 2 Sy/x = Standar Deviasi Slope = Derajat Kemiringan
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Penentuan komposisi fase gerak untuk mendapatkan kondisi kromatogra fi yang optimal Pada awal penelitian ini dilakukan optimasi untuk mendapatkan kondisi kromatografi yang optimal. Adapun perbandingan fase gerak yang dioptimasi adalah metanol:air dengan perbandingan 50:50, 60:40, 70:30, pada laju alir 1 ml/menit, deteksi dilakukan pada panjang gelombang 264 nm. Dari hasil optimasi menggunakan kolom Shimadzu VP-ODS (250 x 4,6 mm) diperoleh perbandingan fase gerak yang terbaik yaitu pada perbandingan metanol:air (60:40). Pemilihan fase gerak yang terbaik ini didasarkan pada faktor tailing yang paling kecil dan nilai theoretical plate yang paling besar. Hubungan antara pengaruh komposisi fase gerak terhadap parameter kromatogram dapat dilihat pada Tabel 1 dibawah ini. Kromatogram dapat dilihat pada Lampiran 1. Tabel 1 Pengaruh Komposisi Fase Gerak terhadap Parameter Kromatogram Perbandingan Fase Gerak Metanol:Air Waktu Retensi (menit) Area Theoretical plate Tailing factor 50:50 3,235 2663879 3699,270 1,460 60:40 3,174 306853 5700,789 1,128 70:30 3,155 84218 4456,366 1,206 4.2 Analisis Kualitatif Dari hasil optimasi pada penentuan kondisi kromatografi yang terbaik untuk cefadroxil diperoleh komposisi fase gerak metanol:air 60:40, laju alir 1 ml/menit. Untuk mengetahui bahwa sampel yang dianalisis mengandung
cefadroxil maka dilakukan spiking yaitu menambahkan bahan baku ke dalam sampel pada kondisi kromatografi yang sama. Hal ini dilakukan dengan cara: Pertama, dilakukan proses kromatografi sampel tanpa penambahan baku. Kedua, sampel dengan penambahan bahan baku dilakukan proses kromatografi. Hasil kromatogram dapat dilihat pada Gambar 1 dan Gambar 2 di bawah ini. Gambar 4 Kromatogram kapsul cefadroxil secara KCKT menggunakan kolom Shimadzu VP-ODS (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak metanol:air (60:40) dan laju alir 1 ml/menit, volume penyuntikan 20 µl dan deteksi pada panjang gelombang 264 nm.
Gambar 5 Kromatogram hasil spike secara KCKT menggunakan kolom Shimadzu VP-ODS (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak metanol:air (60:40) dan laju alir 1 ml/menit, volume penyuntikan 20 µl dan deteksi pada panjang gelombang 264 nm. Dari kromatogram diatas dapat dilihat bahwa terjadi peningkatan luas area dan tinggi puncak pada kromatogram setelah penambahan baku dibandingkan dengan sebelum penambahan bahan baku maka dapat diidentifikasi bahwa sampel mengandung cefadroxil (Johnson dan Stevenson, 1991). 4.3 Analisis Kuantitatif 4.3.1 Penentuan Kurva Kalibrasi Penentuan kurva kalibrasi cefadroxil BPFI ditentukan berdasarkan luas area pada konsentrasi 5, 10, 15, 20, 25, 30 µg/ml, diperoleh hubungan yang linier dengan koefisien korelasi, r = 0,9996 dan persamaan regresi Y = 25204,99429 X + 24450,59993. Nilai r 0,995 menunjukkan adanya korelasi linier yang
menyatakan adanya hubungan antara X dan Y (Moffat, dkk., 2005). Hasil penentuan kalibrasi dapat dilihat pada Gambar 3 di bawah ini. Gambar 6 Kurva kalibrasi Cefadroxil BPFI secara KCKT menggunakan kolom Shimadzu VP-ODS (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak metanol:air (60:40) dan laju alir 1 ml/menit, volume penyuntikan 20 µl dan deteksi pada panjang gelombang 264 nm. 4.3.2 Penetapan Kadar Analit dalam Sampel yang dianalisis Hasil penetapan kadar cefadroxil dalam sediaan kapsul dengan nama dagang dan generik dapat dilihat pada Tabel 2 di bawah ini.
Tabel 2 Hasil penetapan kadar cefadroxil dalam sediaan kapsul dengan nama dagang dan generik Nama Sediaan Kadar Cefadroxil (%) 1 Kapsul Cefadroxil (PT Dexa Medica) 118,06 ± 1,51 2 Kapsul Cefadroxil (PT Hexpharm Jaya) 117,56 ± 0,97 3 Kapsul Cefadroxil (PT Bernofarm) 114.41 ± 1,34 4 Kapsul Cefadroxil (PT Sanbe Farma) 118,87 ± 0,64 5 Kapsul Longcef (PT Dankos) 96,25 ± 0,58 6 Kapsul Librocef ( PT Hexpharm Jaya) 102,94 ± 1,57 7 Kapsul Alxil (PT Bernofarm) 116,03 ± 1,24 8 Kapsul Cefat (PT Sanbe Farma) 110,88 ± 1,62 Dalam perdagangan, sediaan kapsul cefadroxil dengan nama dagang mempunyai harga yang bisa 5 sampai 10 kali lebih mahal dibandingkan dengan nama generik. Dari hasil analisis, diperoleh bahwa sediaan kapsul cefadroxil baik nama dagang maupun nama generik yang ditentukan kadarnya berdasarkan luas area, keseluruhannya memenuhi persyaratan yang ditetapkan dalam USP Edisi 30 tahun 2007 yaitu mengandung cefadroxil tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 120,0% dari jumlah yang tertera pada etiket. Namun, terdapat satu jenis sediaan kapsul cefadroxil yang mempunyai kadar yang paling mendekati batas minimal yang ditetapkan dalam USP Edisi 30 Tahun 2007. 4.4 Hasil Uji Validasi Pada penelitian ini dilakukan uji validasi metode dengan metode standar adisi terhadap sampel kapsul Librocef (PT Hexpharm Jaya) yang meliputi uji akurasi dengan parameter % recovery dan uji presisi dengan parameter RSD
(Relative Standard Deviasi), LOD (Limit of Detection) dan LOQ (Limit of Quantitation). Uji akurasi dengan parameter % recovery dilakukan dengan membuat tiga konsentrasi analit dengan rentang spesifik 80%, 100%, dan 120%, masingmasing dengan tiga replikasi dan setiap rentang spesifik mengandung 70% analit dan 30% baku pembanding (Harmita, 2004). Data hasil uji validasi, parameter akurasi dan presisi cefadroxil dengan metode adisi standar dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3 Hasil Pengujian Validasi, dengan parameter Akurasi, Presisi, Batas Deteksi (LOD), Batas Kuantitasi (LOQ) Cefadroxil pada Kapsul Libro cef ( PT Hexpharm Jaya) dengan Menggunakan Metode Adisi Standar N o Rentang Spesifik (%) Baku yang ditambahkan ( µg/ml ) Sebelum Penambah an Luas Area Konsentrasi ( µg/ml ) Sesudah Penambah an Sebelum Penambaha n Setelah Penambaha n Recovery ( % ) 1 80 2,3815 190671 250185 6,5947 8,9559 99,15 2 80 2,3815 191920 250962 6,6443 8,9868 98,36 3 80 2,3815 194298 254171 6,7386 9,1141 99,75 4 100 2,9769 226923 301968 8,0330 11,0104 100,02 5 100 2,9769 231778 307053 8,2256 11,2122 100,33 6 100 2,9769 232275 307263 8,2454 11,2205 99,94 7 120 3,5723 243132 332493 8,6761 12,2215 99,25 8 120 3,5723 243855 334905 8,7048 12,3172 101,12 9 120 3,5723 250770 341527 8,9791 12,5799 100,79 Kadar rata rata (%) Recovery = 99,86 Standar Deviasi = 0,8558 Relative Standar Deviasi (%) = 0,86 Batas Deteksi (LOD) (µg/ml) = 0,8974 Batas Kuantitasi (LOQ) (µg/ml) = 2,9915 Dari tabel di atas diperoleh hasil pengujian akurasi dengan kadar rata-rata % recovery 99,86%. Hasil ini dapat diterima karena memenuhi syarat uji akurasi, bahwa rentang rata-rata % recovery ialah 98-102%. Maka dapat disimpulkan bahwa metode ini mempunyai akurasi yang baik (Epshtein, 2004).
Hasil uji presisi dengan parameter RSD (Relative Standard Deviasi) diperoleh 0,86%, persyaratan nilai RSD yang ditentukan adalah < 2%. Maka dapat disimpulkan bahwa metode analisis mempunyai presisi yang baik (Harmita, 2004). Batas deteksi dan batas kuantitasi dihitung dari persamaan regresi yang diperoleh dalam kurva kalibrasi. Dari hasil perhitungan diperoleh nilai LOD 0,8974 µg/ml dan nilai LOQ 2,9915 µg/ml.
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Penetapan kadar Cefadroxil dalam sediaan kapsul dapat dilakukan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) menggunakan kolom Shimadzu VP- ODS (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak metanol:air (60:40), laju alir 1 ml/ menit, dan dideteksi pada panjang gelombang 264 nm. Kadar cefadroxil dalam kapsul yang dianalisis dari sediaan kapsul yang terdapat di pasaran dengan kondisi kromatografi yang terpilih diperoleh hasil yang memenuhi persyaratan kadar pada USP edisi 30 Tahun 2007 yaitu mengandung cefadroxil tidak kurang dari 90,0 % dan tidak lebih dari 120,0 % dari jumlah yang tertera pada etiket. 5.2 Saran Disarankan kepada industri farmasi dan Badan Pengawasan Obat dan Makanan (BPOM) untuk menggunakan perbandingan fase gerak ini sebagai fase gerak alterrnatif dalam menetapkan kadar cefadroxil.