BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Jenis penelitian ini adalah eksperimental yaitu dengan mengamati kemungkinan diantara variabel dengan melakukan pengamatan terhadap kelompok eksperimental pada berbagai kondisi perlakuan dan membandingkan dengan kelompok kontrol, dengan menggunakan rancangan penelitian Randomised Block Design. B. Variabel Penelitian a. Variabel bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak etanol daun kumis kucing. b. Variabel tergantung Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah: 1. Volume udem kaki tikus. 2. Ketebalan udem telinga tikus. 3. Penurunan serapan plasma. 4. Waktu pendarahan tikus. c. Variabel terkendali Variabel terkendali pada penelitian ini adalah: 1. Pemilihan tikus: galur, kondisi, jenis kelamin, umur, berat badan tikus 2. Pemilihan herba: tempat tumbuh, waktu pemanenan, dan bagian tanaman yang digunakan. C. Definisi Variabel Operasional 1. Ekstrak etanol daun kumis kucing merupakan ekstrak yang diperoleh dari penyarian daun kumis kucing menggunakan etanol 70%.
2. Pengukuran uji aktivitas antiinflamasi dan antiagregasi platelet adalah pengukuran dengan menggunakan perhitungan volume udem kaki tikus, pengukuran ketebalan udem telinga tikus, penurunan serapan plasma, dan waktu pendarahan tikus. 3. Dosis ekstrak yang digunakan sebagai perlakuan yaitu 100 mg/kgbb, 500 mg/kgbb dan 2500mg/kgBB. 4. Galur tikus yang digunakan dalam penelitian ini yaitu jenis galur wistar. 5. Umur tikus yang digunakan dalam penelitian ini yaitu antara 2-3 bulan. 6. Bobot tikus yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 150-250 gram. 7. Tikus yang digunakan dalam penelitian yaitu tikus jantan. D. Bahan dan Alat 1. Bahan Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam penelitian adalah daun kumis kucing, natrium diklofenak (Phapros) dan aspirin (Phapros) sebagai kontrol positif. Bahan kimia yang digunakan meliputi :etanol 70% (Brataco),NaCl 0,9 % (Brataco), EDTA, CMC-Na, karagenin, asam arakhidonat(sigma, Singapore) dan tikus sebagai hewan uji. 2. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah alat-alat gelas laboratorium, maserator, pengaduk kaca, kain saring, cawan penguap, sudip, penangas air,pipet ukur, neraca analitik,pleistimograf, kertas saring whatman,microplate reader (Bio Red, Jepang). E. Cara Penelitian 1. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan pada bulan Januari sampai dengan Juni 2012 di Laboratorium Biologi Farmasi dan Laboratorium Farmakologi Universitas Muhamadiyah Purwokerto.
2. Langkah Kerja Penelitian a. Penyiapan dan Pengumpulan Bahan Tumbuhan Penyiapan bahan tumbuhan meliputi pengumpulan dan identifikasi bahan tumbuhan serta pembuatan simplisia. Pengumpulan bahan simplisia dilakukan tanpa membandingkan dengan tumbuhan serupa pada daerah lain. Bahan yang dibutuhkan sebagai sampel adalah daun kumis kucing yang didapat di daerah Kedung Banteng Purwokerto pada bulan Januari 2012.Determinasi dilakukan di Laboratorium Botani dan Genetika Universitas Muhammadiyah Purwokerto. b. Pembuatan Simplisia Daun Kumis Kucing Daun Kumis Kucing yang diperoleh, dikumpulkan,dibersihkan dari kotoran dan dicuci dengan air mengalir hingga bersih. Setelah itu ditiriskan, sebarkan diatas kertas hingga air meresap. Setelah itu dijemur dibawah sinar matahari, dengan ditutup kain hitam dansetelah kering serbukan dengan menggunakan blender.ukuran ayakan untuk serbuk adalah mesh 20/40. c. Pemilihan Hewan Uji 1. Pemilihan galur, jenis kelamin, umur dan bobot hewan uji yang akan digunakan dalam penelitian adalah tikus putih jantan galur wistar dengan umur 2-3 bulan, dengan berat badan 150-250 gram. 2. Hewan uji yang dipilih berdasarkan berbagai kriteria tersebut diberi perlakuan yang sama. Waktu pengadaptasian hewan uji dilakukan selama satu minggu sebelum hewan uji mendapat perlakuan. Kemudian diberi larutan ekstrak etanol daun kumis kucing selama tujuh hari berturut-turut dengan harapan senyawa yang berfungsi sebagai agen anti inflamasi telah terakumulasi dalam tubuh. d. Penentuan Panjang Gelombang Penentuan panjang gelombang dilakukan dengan tujuan agar didapatkan absorbansi yang maksimal. Bednar et al (1994), pada
penelitiannya tentang uji agregasi platelet dengan menggunakan microplate reader, digunakan panjang gelombang 632 nm. Mengacu pada penelitian tersebut, maka pada penelitian ini dilakukan orientasi langsung dengan panjang gelombang yang sama yaitu 632 nm. 3. Tahap Persiapan a. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Kumis Kucing Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi. Langkah pembuatan ekstrak etanol daun kumis kucing adalah sebagai berikut : Ekstrak dibuat dengan cara maserasi menggunakan etanol 70%. Satu bagian serbuk kering daun kumis kucing dimasukkan ke dalam maserator, ditambah 10 bagian etanol 70%, direndam selam 6 jam sambil sekali-kali diaduk, kemudian didiamkan sampai 24 jam. Maserat dipisahkan dan proses diulang sekali dengan jenis dan jumlah pelarut setengah dari pelarut semula. Semua maserat dikumpulkan dan diuapkan hingga diperoleh ekstrak kental. b. Penentuan Dosis Ekstrak Daun Kumis Kucing Daun kumis kucing yang mempunyai efek sebagai antiinflamasi pada tikus adalah490mg/kgbb (Prayoga, 2008) 1). Dosis ekstrak untuk tikus bobot 200 g (dosis 100mg/kgBB), x 0,2 kg=0,02 g Larutan ekstrak yang diberikan 0,02 g x =0,033 ml ~ 0,03 ml 2). Dosis ekstrak untuk tikus bobot 200 g (dosis 500 mg/kgbb) =, x 0,2 kg=0,1 g
Larutan ekstrak yang diberikan 0,1 g x =0,167 ml ~ 0,2 ml 3). Dosis ekstrak untuk tikus bobot 200 g (dosis 2500 mg/kgbb) =, x 0,2 kg=0,5 g Larutan ekstrak yang diberikan = 0,5 gx =0,833 ml ~ 0,8 ml c. Penetapan Dosis Karagenin Karagenin yang diberikan pada tikus harus mempunyai dosis yang pasti dan tepat. Septiawan (2011) menyatakan dosis karagenin yang di berikan15 mg/ kgbb cukup baik untuk digunakan. Mengacu pada penelitian tersebut maka penelitian ini dilakukan orientasi langsung pada dosis 15 mg/ kg BB dan diamati apakah benar pada dosis tersebut memberikan efek peradangan yang baik dan mudah diamati. d. Penentuan Dosis Natrium Diklofenak Dosis Natrium diklofenak untuk tikus perlakuan ditentukan berdasarkan faktor konversi dosis manusia dan dosis tikus menurut metode Laurance dan Baoharach. Perhitungan konversi dosis manusia dengan tikus adalah: Dosis pemakaian pada manusia (50kg) Konversi dosis manusia (70kg) pada tikus (200g) = 0,018 Dosis pemakaian pada manusia (70 kg) = 100 mg sehari = x100 mg 140mg Dosis untuk tikus (200 g) = 140 mg x 0,018 = 2,52 mg
Dosis untuk tikus 2,52mg 200gBB = 0,0126 mg/gram BB = 12,6 mg/ Kg BB Larutan suspensi natrium diklofenak 5 % yang diberikan =, x 1ml = 0,05 ml e. Penentuan Dosis Aspirin Dosis aspirin untuk tikus perlakuan ditentukan berdasarkan faktor konversi dosis manusia dan dosis tikus menurut metode Laurance dan Baoharach. Perhitungan konversi dosis manusia dengan tikus adalah: Dosis aspirin adalah 80-320 mg. Perhitungan dosis sehari yaitu 80 mg. Faktor konversi manusia (70 kg) ke tikus (200 g) = 0,018 Rata-rata berat manusia Indonesia adalah 50 kg, sehingga dosis aspirin yang digunakan x80 mg=112mg Dosis aspirin untuk tikus (200 g) = 0,018 x 112 mg = 2,02 mg Dosis aspirin untuk tikus = 2,02 mg/ 200 g BB Volume aspirin yang diberikan : = 0,01 mg/ g BB = 10 mg/ kg BB =, x100ml=0,202~0,2ml
f. Pembuatan Suspensi CMC-Na 1% Sebanyak 1 gram CMC Na ditaburkan merata ke dalam mortir yang berisi aquadest panas sebanyak 35 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh massa yang transparan, digerus hingga terbentuk gel kemudian diencerkan dengan sedikit air, dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, lalu ditambahkan air suling sampai garis tanda. g. Pembuatan Larutan Standar Ekstrak Daun kumis kucing 60% Sebanyak 30 g ekstrak ditimbang seksama dan dimasukkan ke dalam labu takar 50 ml, ditambahkan dengan CMC-Na 1% sampai tanda dan dikocok. h. Pembuatan Larutan Standar Natrium Diklofenak 5% Sebanyak 5 g natrium diklofenak ditimbang seksama dan dimasukkan dalam labu takar 100 ml, ditambahkan dengan CMC Na 1% sampai tanda dan dikocok homogen. i. Pembuatan Karagenin 1% Sebanyak 100mg karagenin ditimbang seksama dan dimasukkan dalam labu takar 10 ml, ditambahkan dengan NaCl 0,9% sampai tanda dan dikocok. j. Pembuatan Asam Arakhidonat Sebanyak 74,6 mg asam arakhidonat ditimbang seksama kemudian tambahkan 10µl etanol absolut dan ditambahkan NaCl 0,9 % (b/v) sebanyak 0,41 ml. k. Pembuatan Larutan Standar Aspirin 1% Ditimbang sebanyak 1g serbuk aspirin kemudian digerus dengan penambahan suspensi CMC-Na 1% sampai homogen, dimasukkan ke dalam
labu ukur 100 ml, dicukupkan sampai garis tanda dengan suspensi CMC-Na 1%. 4.Tahap Pelaksanaan Sebelum diberi perlakuan tikus ditimbang dengan bobot rata-rata tikus 200 g. Hewan uji di bagi menjadi 6 kelompok. Pada tiap tikus diberi dengan dosis yang berbeda. Adapun perlakuan terhadap hewan uji pada masing-masing kelompok, yaitu: 1. Kelompok I : Kelompok kontrol pelarut yaitu tikus diberikansuspensi CMC-Na 2% secara per oral selama 7 hari. 2. Kelompok II : Kelompok kontrol positif untuk uji udem yaitu tikus diberikan suspensi natrium diklofenak 12,6 mg/kgbb secara per oral 2 jam sebelum perlakuan. 3. Kelompok III : Untuk kontrol positif agregasi platelet menggunakanaspirin dengan dosis 10 mg/kgbb. 4. Kelompok IV : Kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak dosis 100 mg/kgbb secara per oral selama 7 hari. 5. Kelompok V : Kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak dosis 500 mg/kgbb secara per oral selama 7 hari. 6. Kelompok VI : Kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak dosis 2500mg/kgBB secara per oral selama 7 hari. Setiap tikus tetap diberi makan selama 7 hari. Kemudian pada hari ke-7 dilakukan uji sebagai berikut: 1). Uji udema pada telinga tikus Pengujian udema pada telinga tikus dilakukan pada telinga bagian kiri.sebelumnya dilakukan pengukuran ketebalan telinga tikus. Selanjutnya tiap tikus dioleskan asam arakhidonat kemudian ukur ketebalan telinga tikus tersebut diukur pada 0,5 ; 1 ; 1,5 ; 2 ; 3 dan 4jam
dengan menggunakan jangka sorong.pengukuran dilakukan replikasi sebanyak tiga kali. 2). Uji udema pada kaki tikus Uji udem kaki dilakuan dengan memberi tanda pada kaki tikus, kemudian kaki tikus dimasukan kedalam alat pleistimograf yang berisi cairan sampai andda batas. Angka dicatat sebagai Vo. Satu jam kemudian kaki tikus disuntik secara intraplanar dengan larutan karagenin 1%. Setelah 30 menitpengukuran dilkukan kembali dengan cara mecelupkan kaki tikus ke dalam alat pleistimograf yang berisi cairan sampai tanda batas. Angka dicatat sebagai Vt. Pengukuran dilakukan setiap 30 menit, selama 360 hari.pengukuran dilakukan replikasi sebanyak tiga kali. 3). Uji agregrasi platelet Tikus kelompok I, III, IV, V dan VI diambil darahnya dari ekor, ditempatkan dalam mikrotube.kemudian ditambahkan EDTA sebagai antikoagulan dan digoyang-goyangka.setelah itu darah disentrifuge dengan kecepatan 6000rpm selama 3 menit.supernatan dipisahkan dari endapan, dan ditempatkan dalam 96 well microplate. Sebanyak 293,5 µl supernatan ditambah dengan 6,5 µl asam arakhidonat hingga konsentrasi akhir 12,38mM. Kemudian dibaca absorbansi menggunakan microplate reader pada waktu 15 detik, 30 detik serta 1;2;3;4;5;6;7;8;9;10 menit dengan panjang gelombang 632 nm. 4). Uji waktu pendarahan ekor Uji waktu pendarahan dilakukan dengan memotong 5 mm ujung ekor tikus dan ekor ditotolkan pada kertas saring whatman setiap 30 detik sampai hasil penotolan tidak menunjukan bekas pada kertas.waktu pendarahan dihitung antara waktu pemotongan sampai waktu darah berhenti.
5). Perhitungan Volume Udem, Serapan, dan Waktu pendarahan a. Perhitungan Volume Udem Telinga Persen radang dapat dihitung dengan rumus Persen radang = x 100% Dimana : Kt = Ketebalan radang setelah setelah pemberian injeksi asam arakidonat Ko = Ketebalan radang sebelum injeksi asam arakidonat Persen inhibisi radang dihitung dengan rumus : Persen Inhibisi Radang : x100% Dimana : a = persen radang rata-rata kelompok kontrol b = persen radang rata-rata kelompok perlakuan hewan uji b. Perhitungan Udem kaki tikus Persen radang dapat dihitung dengan rumus : Persen radang = x 100% Dimana : Vt = volume radang setelah waktu pemberian injeksi karagenin Vo = volume awal sebelum injeksi karagenin Persen inhibisi radang dihitung dengan rumus : Persen Inhibisi Radang : x100% Dimana : a = persen radang rata-rata kelompok kontrol c. Agregasi platelet b = persen radang rata-rata kelompok perlakuan hewan uji Uji agregasi platelet ditunjukkan dengan perubahan penurunan serapan plasma.penurunan serapan plasma dihitung dengan menghitung selisih serapan plasma.
d. Perhitungan Waktu Pendarahan Ekor Tikus Perhitungan waktu perdarahan dihitung dari periode waktu amputasi sampai waktu pemberhentian perdarahan. F. Analisis Statistik Data yang diperoleh dianalisa secara statistik menggunakan program SPSS versi 16.Data persentase inhibisi radang diolah dengan menggunakan analisis anava dua arah.sedangkan untuk mengetahui perbedaan persen inhibisi antara udem kaki dan udem telinga digunakan analisis T-test.Data uji agregasi platelet dan waktu pendarahan, masing-masing dilakukan analisis dengan anava satu arah untuk melihat adanya perbedaan antar kelompok perlakuan.