BAB III METODE PENELITIAN Secara garis besar, langkah-langkah yang dilakukan dalam penelitian ini adalah: pengumpulan sampel; lisis terhadap sampel mtdna yang telah diperoleh; amplifikasi daerah HVI mtdna sampel dengan menggunakan teknik PCR; pendeteksian hasil PCR dengan elektroforesis gel agarosa; sekuensing terhadap hasil PCR yang menunjukkan hasil positif pada saat elektroforesis dengan gel agarosa; serta data mining menggunakan program SeqMan DNASTAR. 3.1. Bagan Alir Penelitian Berikut adalah bagan alir secara garis besar keseluruhan tahap penelitian yang dilakukan. Gambar 3.1. Bagan alir penelitian. 17
3.2. Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cotton bud, pinset, kertas label, kotak sampel, sarung tangan, pipet mikro, sprayer, plastik tempat obat (sebagai tempat sampel), water bath, gelas kimia, termometer, tabung eppendorf 200 µl dan 1,5 ml, microsentrifuge, set alat PCR, labu erlenmeyer, microwave, set alat elektroforesis, dan lampu UV. Adapun bahan-bahan yang digunakan adalah sel folikel akar rambut (sebagai sampel), etanol teknis, buffer lisis (500 mm Tris HCl ph 8,5 (Pharmacia Biotech), 10 mm EDTA ph 8 (J.T. Baker), dan 5% Tween 20 (Merck)), enzim proteinase K 10 mg/ml, ddh 2 O, primer M 1 (20 pmol/µl), primer M 2 (20 pmol/µl), buffer PCR 10 x (Amersham life science: 500 mm KCl, 100 mm Tris-HCl ph 9,0 pada suhu 25 C, 1,0% Triton X-100, 15 mm MgCl 2 ), enzim Taq DNA Polymerase (5 unit/µl, Amersham life science), campuran dntp 10 mm (Amersham life science), agarosa, buffer TAE 1 x, larutan EtBr 10 µg/ml (Merck), loading buffer (Merck: sukrosa 50%, EDTA 0,1 M ph 8,0, bromfenol biru 0,1% ph 8,0), dan marker puc19/hinfi. 3.3. Metode Penelitian 3.3.1. Pengumpulan Sampel mtdna Manusia Pada tahap ini dilakukan pengumpulan sampel mtdna dari populasi Nusa Tenggara Barat. Sampel yang diambil berupa helaian rambut yang memiliki akar sehingga pada tahap berikutnya bisa dilakukan isolasi mtdna pada sel folikel akar rambut tersebut. Pengambilan sampel dilakukan sebanyak dua kali. Pengambilan sampel pertama dilakukan pada akhir bulan Mei 2007 terhadap 18
24 individu, sedangkan pengambilan sampel kedua dilakukan pada hari Rabu, 21 Mei 2008 terhadap 12 individu yang juga telah diambil sampelnya pada pengambilan pertama. Selanjutnya, sampel dari tiap individu disimpan dalam plastik obat dan diberi kode mulai dari NB-001 sampai NB-024. Dari sampelsampel tersebut diambil dua sampel untuk dijadikan objek dalam penelitian ini yaitu NB-007 dan NB-008. 3.3.2. Lisis (Penyiapan Templat) Sampel rambut dipotong bagian akarnya (±1 cm) dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf ukuran 1500 µl. Kemudian ditambahkan 20 µl buffer lisis (500 mm Tris HCl ph 8,5 (Pharmacia Biotech), 10 mm EDTA ph 8 (J.T. Baker), dan 5% Tween 20 (Merck)), 10µL enzim proteinase K 10 mg/ml (USB Corporation). Selanjutnya ditambahkan ddh 2 O hingga volume total mencapai 200 µl. Kemudian tabung eppendorf yang berisi campuran reaksi dibungkus dengan parafilm dan diinkubasi selama satu jam pada waterbath dengan suhu 55 C. Setelah itu dilakukan proses deaktifasi enzim proteinase K pada suhu 95 C selama 10 menit. Setelah proses deaktifasi tersebut, campuran reaksi kemudian disentrifugasi selama tiga menit pada 14000 rpm kemudian supernatannya diambil sebanyak 150 µl dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang baru untuk selanjutnya digunakan sebagai templat untuk reaksi PCR. 19
3.3.3. Amplifikasi mtdna Manusia Secara in vitro dengan Teknik PCR Proses amplifikasi fragmen daerah HV1 mtdna manusia dilakukan menggunakan primer M 1 dan M 2. Campuran reaksi PCR disimpan dalam tabung eppendorf 200 µl, terdiri atas 5 µl templat mtdna hasil lisis, 0,5 µl primer M 1 (20 pmol/µl), 0,5 µl primer M 2 (20 pmol/µl), 2,5 µl buffer PCR 10 x (Amersham life science: 500 mm KCl, 100 mm Tris-HCl ph 9,0 pada suhu 25 C, 1,0% Triton X-100, 15 mm MgCl 2 ), 0,2 µl enzim Taq DNA Polymerase (5 unit/µl, Amersham life science), 0,5 µl campuran dntp 10 mm (Amersham life science), dan ditambah ddh 2 O steril hingga volumenya mencapai 25 µl. Adapun urutan rinci nukleotida primer M 1 dan M 2 dapat dilihat pada tabel 4.1. Tabel 3.1. Urutan nukleotida primer M 1 dan M 2. Primer Urutan 5 ke 3 Ukuran M 1 (L15.997) -CACCATTAGCACCCAAAGCT- 20 nukleotida M 2 (H16.401) -TGATTTCACGGAGGATGGTG- 20 nukleotida Urutan nukleotida primer M 1 dan M 2 yang digunakan dalam amplifikasi fragmen D-loop mtdna manusia yang berukuran 0,4 kb dengan teknik PCR. L dan H masing-masing merujuk pada pita light dan heavy, dengan nomor posisi untuk masing-masing primer merujuk kepada nomor posisi nukleotida 3 (Anderson et al. dalam Siti, 2005). Proses PCR dilakukan dengan mesin GeneAmp PCR System 2700 sebanyak 30 siklus. Tahap awal dari proses PCR adalah tahap denaturasi awal yang dilakukan pada suhu 94 C selama lima menit, kemudian masuk ke program siklus PCR dengan masing-masing siklus terdiri dari tiga tahap yaitu tahap denaturasi yang dilakukan pada suhu 94 C selama satu menit, tahap annealing yang dilakukan pada suhu 50 C selama satu menit, dan tahap extention atau polimerisasi pada suhu 72 C selama satu setengah menit. Pada akhir semua siklus dilakukan tambahan proses polimerisasi pada suhu 72 C selama empat menit. 20
DNA hasil PCR kemudian disimpan pada suhu -20 C. Skema siklus yang dilakukan pada proses PCR ini dapat dilihat pada Gambar 3.2. Gambar 3.2. Skema siklus PCR yang dilakukan. 3.3.4. Analisis Hasil PCR Hasil amplifikasi dari proses PCR yang telah dilakukan sebelumnya kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v). Proses ini dilakukan dengan menggunakan set alat elektroforesis yang ada di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI. Komposisi gel agarosa dibuat dengan melarutkan 0,3 g agarosa dalam 30 ml buffer TAE 1 x. Larutan tersebut kemudian dipanaskan hingga agarosanya larut semua, lalu didinginkan hingga suhu larutan mencapai 50-60 C. Sebelum dituangkan ke dalam cetakan gel yang memiliki sisir sebagai pembentuk sumur gel, ditambahkan larutan EtBr 10 µg/ml (Merck) sebanyak 2 µl. Pada masingmasing sumur gel dimasukkan 10 µl sampel hasil PCR yang telah dicampur dengan 3 µl loading buffer (Merck: sukrosa 50%, EDTA 0,1 M ph 8,0, bromfenol biru 0,1% ph 8,0) (Sambrook et al. dalam Siti dkk., 2007). 21
Proses elektroforesis dilakukan dalam buffer TAE 1x sebagai media penghantar arus pada tegangan 80 volt selama 40 menit. Marker atau penanda yang digunakan adalah puc19/hinfi. Hasil elektroforesis kemudian divisualisasi dengan lampu UV. Penentuan konsentrasi DNA dapat dilakukan dengan cara membandingkan intensitas pita yang dianalisis terhadap pita-pita dari marker yang konsentrasinya telah diketahui sebelumnya. 3.3.5. Sekuensing Sekuensing DNA merupakan tahapan akhir dalam menentukan urutan nukleotida fragmen hasil amplifikasi dengan PCR. Sekuensing dilakukan oleh Macrogen Inc. berdasarkan prinsip sekuensing metode Dideoksi Sanger menggunakan Automatic DNA Sequencer. Data yang diperoleh berupa elektroforegram dalam bentuk abi file. Selain itu juga diperoleh urutan nukleotida lengkap dalam bentuk arsip teks. 3.3.6. Pembacaan Elektroforegram Hasil Sekuensing Pembacaan hasil sekuensing dilakukan dengan melihat data dari elektroforegram. Pada elektroforegram tersebut, masing-masing basa memperlihatkan warna dan tinggi puncak yang berbeda. Basa adenine (A) berwarna hijau, basa guanine (G) berwarna hitam, basa cytosine (C) berwarna biru, dan basa Thymine (T) berwarna merah (Perkin Elmer dalam Siti dkk., 2007). 3.3.7. Analisis Urutan Nukleotida mtdna Hasil Sekuensing Analisis urutan nukleotida pada daerah HVI mtdna manusia hasil sekuensing dilakukan dengan menggunakan program SeqMan DNASTAR. Setiap 22
sampel dianalisis homologinya terhadap urutan nukleotida standar yang ada yaitu urutan Cambridge yang telah direvisi Andrew et al. pada tahun 1999 (rcrs). 23