MODUL 2 Sterilisasi dan Pembuatan Medium POKOK BAHASAN : 1. Sterilisasi alat, medium/bahan, dan area kerja 2. Pembuatan medium tumbuh bakteri TUJUAN PRAKTIKUM : 1. Mengenal persiapan dan pengerjaan teknik sterilisasi alat, bahan, dan area kerja untuk pekerjaan mikrobiologi, 2. Mengenal persiapan, pengerjaan, dan jenis-jenis medium tumbuh bakteri laut TINJAUAN PUSTAKA : 1. STERILISASI ALAT, MEDIUM/BAHAN, DAN AREA KERJA Sterilisasi mikrobiologi adalah suatu proses mematikan mikrorganisme yang mungkin ada pada atau di dalam benda. Secara umum ada empat teknik yang biasa digunakan untuk sterilisasi. Pemilihan teknik sterilisasi didasarkan pada sifat bahan dan alat yang akan disterilisasi. Pada teknik aseptis digunakan cara pembakaran dan bahan kimia. Cara lain adalah dengan menggunakan panas dan penyaringan. Sterilisasi dengan menggunakan panas dan kombinasi dengan uap air disebut sterilisasi panas basah/lembab. Sebaliknya jika tanpa air disebut sterilisasi kering. Termasuk dalam jenis sterilisasi kering jika digunakan sinar UV atau gas tertentu untuk sterilisasi. Autoklaf (Autoclave) Autoklaf merupakan alat sterilisasi yang sering digunakan. Alat ini bekerja dengan sistem sterilisasi basah. Secara prinsip, cara kerja alat ini adalah sterilsasi dengan menggunakan uap air pada suhu 121 0 C selama 15 menit pada tekanan 1 atm. Atau lebih tergantung ketinggian tempat terhadap permukaan air laut. Sterilisasi uap ini tergantung pada ; (1) sifat bahan atau alat, harus dapat ditembus atau terkena uap secara merata tanpa mengalami kerusakan agar proses Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 1
sterilisasi berlangsung efektif, (2) kondisi sterilisasi harus bebas udara (vacuum), (3) suhu yang terukur harus mencapai 121 0 C dan dipertahankan selama 15 menit. Gambar : Proses Sterilisasi dengan Autoclave Oven Oven bersuhu tinggi (160-170 0 C) biasa digunakan untuk sterilisasi kering. Karakteristik sterilisasi kering adalah suhu tinggi dan waktu sterilisasi yang lama (1-3 jam). Bahan atau alat yang akan disterilisasi kering harus tahan panas dan tidak mengalami kerusakan pada suhu yang digunakan dan disterilkan dengan cara membungkus, menyumbat atau meletakkannya dalam wadah tertutup untuk mencegah kontaminasi ketika dikeluarkan dari oven. Sterilisasi dengan Bahan Kimia Bahan yang tidak tahan panas seperti plastik dapat disterilsasi dengan menggunakan gas etilen oksida atau bahan kimia asam perasetat, formaldehid, dan glutaraldehid alkalin pada suhu kamar selama 2-18 jam. Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam sterilisasi kimiawi ini adalah : (1) Bahan yang digunakan sebagai sterilisator harus benar-benar dihilangkan sebelum Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 2
alat digunakan dan biasanya memerlukan waktu yang cukup lama, (2) daya bakar bahan kimia sterilisator, (3) persyaratan peralatan dan biaya pelaksanaan. Penyaringan Penyaringan merupakan teknik sterilisasi bahan cair pada suhu ruang dengan menggunakan penyaring yang memiliki pori-pori kurang dari 0,45 atau 0,22 µm. beberapa bahan yang umum disterilisasi dengan teknik ini adalah cairan serum, antibiotik, enzim, toksin larutan bikarbonat dan medium sintetik tertentu. Gambar : Perangkat Sterilisasi dengan Penyaringan 2. MEDIUM TUMBUH BAKTERI Medium tumbuh mikroorganisme adalah bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di atas atau di dalamnya. Komposisi medium tumbuh bervariasi tergantung mikrorganisme target yang diinginkan untuk tumbuh. Akan tetapi, secara umum ada kebutuhan-kebutuhan dasar yang sama yaitu air, karbon, energi, mineral dan faktor tumbuh. Air Air merupakan komponen utama karena organisme bersel tunggal membutuhkan air sebagai penyusun utama protoplasma dan wahana bagi masuknya nutrien ke dalam sel dan keluarnya Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 3
sekresi dan eksresi dari dalam dan luar sel. Air juga membantu berlangsungnya reaksi-reaksi enzimatik di dalam sel. Untuk media pertumbuhan air biasa digunakan adalah air suling atau air hasil distilasi. Air sadah kaya ion kalsium dan magnesium yang dapat mengikat ion fosfat yang terdapat pada medium yang mengandung pepeton atau ekstrak daging. Sumber Karbon (Carbon/C Sources) Sumber karbon untuk pertumbuhan dapat berupa karbon organik maupun karbon dioksida. Organisme yang menggunakan karbon dioksida sebagai sumber karbonnya disebut organisme autotrof sedangkan organisme yang menggunakan sumber karbon organik disebut organisme heterotrof. Sumber Nitrogen (Nitrogen/N Sources) Sumber nitrogen bagi organisme dapat dibagi menjadi nitrogen anorganik dan nitrogen organik. Organisme autotrofik menggunakan karbon anorganik sedangkan organisme heterotrof menggunakan karbon anorganik berupa asam amino atau senyawa-senyawa protein intermediet seperti peptida, proteosa dan pepton. Micro-nutrients Organisme juga memerlukan unsur mikro berupa logam agar pertumbuhannya normal. Beberapa logam yang diperlukan di antaranya natrium (Na), kalium (K), magnesium (Mg), mangan (Mn), besi (Fe), seng (Zn), tembaga (Cu), fosfor (P), dan kobalt (Co). Derajat Keasaman (ph) Derajat keasaman media atau ph medium juga sangat menentukan pertumbuhan mikrorganisme. Umumnya mikrorganisme hidup pada kisaran ph netral (7) akan tetapi, mikroroganisme patogen biasanya hidup pada ph alkalin. Medium pertumbuhan mikroorganisme dapat dibagi menjadi dua jenis, medium sintetik dan medium komplek. Pembagian tersebut didasarkan pada komposisi kimiawi medium. Medium sintetik dibuat dari campuran bahan kimia dengan kemurnian tinggi dan jumlah diketahui Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 4
dengan pasti. Medium kompleks dibuat dari bahan-bahan organik kompleks seperti ekstrak daging dan pepton. Ditinjau dari tujuan penggunaannya, medium juga dapat diklasifikasikan menjadi medium serbaguna (sebagian besar bakteri dapat tumbuh), medi selektif (hanya mikrorganisme tertentu yang diinginkan dapat tumbuh) dan medium diferensial (untuk klasifikasi berbagai tipe bakteri). Mikroorganisme juga dapat ditumbuhkan dalam medium berbentuk cair, setengah padat atau medium padat. Bahan padat medium yang umum digunakan adalah agar-agar, selain itu dapat juga digunakan untuk gelatin atau silika gel. PROSEDUR PELAKSANAAN PRAKTIKUM : 1. STERILISASI ALAT, MEDIUM/BAHAN, DAN AREA KERJA Alat : Autoclave Oven Bunsen Botol Semprot Alcohol Cawan Petri Erlenmeyer Tabung Reaksi Pipet Volumetrik Mortar Keramik Prosedur : Bahan : Aquadest Alcohol Aseptis (70%) Spiritus Kertas Pembungkus/Al-Foil Kapas Kasa Tissue Plastik Tahan Panas Karet Gelang Kertas Label 1. Bungkus rapi alat-alat gelas yang akan disterilisasi dengan kertas pembungkus/al-foil; 2. Khusus untuk sterilisasi dengan Autoclave, tempatkan alat dan/ medium yang akan disterilisasi ke dalam plastik tahan panas; 3. Sterilisasi dengan Autoclave : (1) Buka tutup autoclave, (2) Masukkan aquadest ke dalam Autoclave hingga penanda batas air, (3) Tempatkan alat dan/ medium ke dalam Autoclave, susun rapi, (4) Tutup Autoclave, (5) Nyalakan Autoclave dan tunggu hingga suhu mencapai 121 0 C dan Tekanan sebesar 1 atm/ 15 lb (Kondisi Sterilisasi), jangan lupa menutup katup uap Autoclave, (6) Mulai sterilisasi selama 15 20 menit, (7) Setelah selesai, Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 5
matikan Autoclave dan buka katup uap Autoclave, (8) Tunggu hingga tekanan turun hingga 0 atm (suhu agak dingin), (9) Buka secara hati-hati penutup Autoclave, (20) Keluarkan alat dan/ medium dari dalam Autoclave. 4. Sterilisasi dengan Oven : (1) Buka pintu Oven, (2) Tempatkan alat ke dalam Oven dengan susunan yang rapi, (3) Tutup pintu Oven, (4) Setting suhu Oven : 160 170 0 C, waktu : 60 menit, (5) mulai sterilisasi, (6) Setelah selesai, matikan Oven, (8) Keluarkan alat dari dalam Oven. 5. Sterilisasi Area Kerja : (1) Bersihkan meja kerja dari alat/bahan yang ada di atasnya, (2) Usap bersih dengan menggunakan tissue, (3) Semprot merata dengan Alcohol 70%, (4) ratakan dengan tissue bersih, (5) Tunggu hingga kering, (6) Nyalakan Bunsen. 2. PEMBUATAN MEDIUM TUMBUH Alat : Erlenmeyer Gelas Ukur Timbangan Analitik Spatula Batang Pengaduk Kaca Hot-Plate with Magnetic Stirrer Besi Magnet Stirrer Prosedur : Bahan : Serbuk Nutrient Agar (NA) Serbuk Nutrient Broth (NB) Air Laut CMC Susu Skim (Skim Milk) Kalium Kromat (K2CrO4) Kertas Lakmus Kapas Kasa Tissue Plastik Tahan Panas Karet Gelang Kertas Label 1. Timbang serbuk NA dan/nb sesuai dengan takaran dengan Timbangan Analitik; 2. Timbang bahan tambahan (CMC/ Skim Milk/ Kalium Kromat) sesuai dengan takaran yang ditentukan dengan Timbangan Analitik; 3. Masukkan Serbuk Medium dan Bahan Tambahan ke dalam Erlenmeyer; 4. Masukkan Air Laut (sesuai volume takaran) ke dalam Erlenmeyer yang sudah berisi Serbuk Medium dan Bahan Tambahan; Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 6
5. Aduk dengan menggunakan batang pengaduk kaca; 6. Stirring (di-stir) dengan bantuan Besi Magnet Stirer di atas Hot-Plate with Magnetic Stirre, ukur ph sesuai yang ditentukan (adjusting ph dengan HCl/ NaOH), panaskan hingga mendidih, 7. Sterilisasi dengan menggunakan Autoclave selama 15 menit. 8. Ketentuan Komposisi Medium sebagai berikut : No Keperluan Pengujian Bakteri Jenis Medium Komposisi 1 Sakarolitik Padat/Agar Nutrient Agar (NA) + 2% CMC 2 Proteolitik Padat/Agar Nutrient Agar (NA) + 2% Skim Milk 3 Absorbsi Logam Berat Cair/ Broth Nutrient Broth (NB) + 2 ppm K2CrO4 4 Kitinase Padat/Agar Nutrient Agar (NA) + koloidal kitin PARAMATER YANG DIAMATI : 1. STERILISASI ALAT, MEDIUM/BAHAN, DAN AREA KERJA Sterilisasi Autoclave No Jam Mulai Menyalakan Alat Jam Mulai Sterilisasi Suhu ( 0 C) Tekanan (lb) Alat/ Bahan yang disterilisasi Sterilisasi Oven No Jam Mulai Menyalakan Alat Jam Selesai Sterilisasi Suhu ( 0 C) Waktu (menit) Alat yang disterilisasi 2. PEMBUATAN MEDIUM TUMBUH No Nama Medium Komposisi Medium Volume Akhir (ml) Serbuk Medium Bahan Tambahan Air Laut (mg) (mg) (ml) ph Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 7