Sumardi Optimasi Produksi Enzim OPTIMASI PRODUKSI ENZIM β-mananase EKSTRASELULER DARI BAKTERI Geobacillus stearothermophilus L-07 ABSTRACT Sumardi Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung Jl. S. Brojonegoro No. 1, Bandar Lampung 35145 Email: mannanase@yahoo.com Diterima 21 Juni 2005, disetujui untuk diterbitkan 25 Juli 2005 Geobacillus stearothermophilus L-07 was tested for production of extracellular β-mannanase. The enzymes production was showed by clear zone from around colony after staining with congo red and destaining with NaCl solution. The enzymes were endohydrolases that catalyze random hydrolysis of β-1,4-mannosidic linkages in the main chain of galactomannan to mannooligosaccharide, and mannose. The β-mannanase activity was highest in culture medium, containing 0.65% (w/v) locust bean gum in ph 7.0 after 36 hours of cultivation at 60 o C. However, the highest β-mannanase activity was observed in culture medium after 12 hours of cultivation at 70 o C, respectively. Keywords: Geobacillus stearothermophilus L-07, β- mannanase 1. PENDAHULUAN Di alam, hemisellulosa adalah polisakarida kedua yang sangat melimpah setelah selulosa. Komponen utama hemiselulosa adalah hetero-1,4- β -D-xilan and hetero-1,4-β-d-manan (galaktoglukomanan, galaktomanan, dan glukomanan). Heteroxilan terutama ditemukan pada rumput-rumputan, biji sereal, dan kayu keras. Manan terutama terdapat pada endosperma kopra, kelapa sawit, kopi, dan locust bean 1. Organisme pemecah manan berupa bakteri, fungi, tanaman, aktinomisetes, dan moluska 2, 3 dengan menghasilkan enzim β-mananase (1,4-β-D manan manohidrolase [EC 3.2.1.78]). Enzim tersebut menghidrolisis ikatan β-(1,4)- dalam rangka utama polimer manan, yang kemudian menghasilkan rantai pendek manooligosakarida. Selanjutnya senyawa tersebut dipecah oleh kerja enzim β- manosidase (β-d-manosidase [EC 3.2.1.25]) dan α-galaktosidase (EC 3.2.1.22) menghasilkan manosa dan galaktosa 4. Enzim pemecah manan berperan banyak banyak aplikasi industri seperti pengolahan pangan, pakan ternak, deterjen, tekstil, dan kertas. Penggunaan enzim β-mananase termofilik sangat berguna dalam industri yang memerlukan proses aseptis bersuhu tinggi sehingga kontaminasi produk bisa dihindari. Beberapa makalah tentang karakterisasi β-mananase telah dipublikasikan. Bakteri Termotoga neopolitana menghasilkan mananase dengan aktivitas enzim 0,8 U/mg, aktif pada ph 7,1 dan suhu 90 o C 4. Sedangkan Rhodothermus marinus aktif pada ph 5,4 dan suhu 85 o C (5). Sedangkan Bacillus sp. Menghasilkan mananase yang aktif pada ph 7,0 dan suhu 70 o C 1. Dalam penelitian ini dilakukan optimasi produksi β-mananase ekstraseluler dari bakteri Geobacillus stearothermophilus L-07 yang telah berhasil diisolasi dari limbah cangkang sawit di Lampung. 2. METODE PENELITIAN 2.1. Organisme Bakteri G. stearothermophilus strain L-07 diisolasi dari limbah cangkang sawit dari Pabrik Minyak Kelapa Sawit di Rejosari, Natar, Lampung 6. 2.2. Media dasar Media untuk produksi β-mananase ekstraseluler dari G. stearothermophilus L-07 adalah medium cair modifikasi (1), yang terdiri atas : Ekstrak khamir 0,35% (b/v), tripton 0,35% (b/v), MgSO 4 0,03% (b/v), KH 2 PO 4 0,245% (b/v), (NH 4 ) 2 SO 4 0,25% (b/v), NaCl 0,2% (b/v) dan locust bean gum (LBG) 0,35% (b/v) pada ph 7,0. 66 2005 FMIPA Universitas Lampung
J. Sains Tek., Agustus 2005, Vol. 11, No. 2 2.3. Deteksi G. stearothermophilus L-07 penghasil β-mananase ekstraseluler G. stearothermophilus L-07 ditumbuhkan di medium yang dibuat dengan dua lapis di cawan Petri. Medium di lapisan bawah dengan komposisi ekstrak khamir 0,35% (b/v), tripton 0,35% (b/v), MgSO 4 0,03% (b/v), KH 2 PO 4 0,245% (b/v), (NH 4 ) 2 SO 4 0,25% (b/v), dan NaCl 0,2% (b/v). Sedangkan lapisan atas dengan komposisi MgSO 4 0,03% (b/v), KH 2 PO 4 0,245% (b/v), (NH 4 ) 2 SO 4 0,25% (b/v), NaCl 0,2% (b/v) dan locust bean gum (LBG) 0,35% (b/v). Setelah diinkubasi selama 14 jam pada suhu 60-70 o C, bakteri tersebut kemudian diwarnai dengan 0,1% Congo Red selama 15 menit dan selanjutnya dicuci dengan 1 M NaCl. G. stearothermophilus terdeteksi menghasilkan β- mananase apabila zona jernih terbentuk di sekeliling koloninya. 2.4. Seleksi konsentrasi Locust bean gum terbaik untuk produksi β-mananase G. stearothermophilus L-07 telah diketahui menghasilkan β-mananase, kemudian diuji untuk menemukan konsentrasi locust bean gum yang terbaik untuk produksi enzim. Penentuan konsentrasi substrat dengan cara mengatur konsentrasi locust bean gum di medium dasar produksi. Konsentrasi locust bean gum yang digunakan adalah 0,35%, 0,5%, 0,65%, dan 0,8%. Setelah diproduksi selama 24 jam dan suhu 60 o C supernatan diambil untuk diuji aktivitasnya. Uji aktivitas β-mananase dilakukan dengan menghitung gula pereduksi dengan metode DNS 7. 2.5. Penentuan ph Media terbaik untuk Produksi β-mananase Penentuan ph media untuk produksi optimum β- mananase L-07 dilakukan dengan cara menumbuhkan G. stearothermophilus L-07 di dalam media produksi dengan ph 4, 5, 6, 7, 8, 9, dan 10. Setelah inkubasi pada suhu 60 o C pada konsentrasi locust bean gum terbaik dan lama inkubasi 24 jam. Supernatan kemudian diambil untuk diuji aktivitas β-mananasenya. 2.6. Penentuan lama inkubasi terbaik untuk produksi β-mananase Untuk memperoleh produksi β-mananase yang maksimal dilakukan pembuatan kurva produksinya. Langkah pertama yang dilakukan pembuatan starter yaitu dengan mengambil satu lup biakan G. stearothermophilus L-07 dan diinokulasikan pada 25 ml medium mengandung 0,35% ekstrak khamir; 0,35% tripton; 0,035% MgSO 4 ; 0,245% KH 2 PO 4 ; 0,175% (NH 4 ) 2 SO 4, dan 0,2% NaCl. Biakan diinkubasi pada 60 o C dengan kecepatan 120 rpm selama 8 jam. Kemudian sebanyak 4% starter diinokulasikan ke medium dasar produksi (0,35% Ekstrak khamir; 0,35% tripton; 0,035% MgSO 4 ; 0,245% KH 2 PO 4 ; 0,175% (NH 4 ) 2 SO 4, dan 0,2% NaCl; 0,65% Locust bean gum. Bakteri diinkubasi pada suhu 60 o C dengan kecepatan 120 rpm. Percobaan yang sama juga dilakukan namun pada inkubasi 70 o C. Pengambilan sampel dilakukan setiap 4 jam sekali sebanyak 500 µl untuk diuji aktivitas β-mananase. Percobaan yang sama juga dilakukan namun pertumbuhan G. stearothermophilus L-07 pada suhu 70 o C. Uji aktivitas β-mananase dilakukan dengan menghitung gula pereduksi dengan metode DNS 7. 2.7. Pengujian Aktivitas β-mananase Pengujian enzim berdasarkan media modifikasi (8), campuran reaksi mengandung 0,5% larutan manan (locust bean gum) pada bufer sitrat 50 mm, ph 6 (900 µl substrat locust bean gum 0,55% dan 100 µl enzim). Sebanyak 1 ml total volume diinkubasi pada suhu optimalnya (75-80 o C) selama 30 menit. Selanjutnya ditambahkan 1 ml pereaksi DNS dan dipanaskan sampai mendidih dalam air selama 15 menit. Kemudian didinginkan pada air dingin selama 20 menit. Pembacaan dengan spektrofotometer diukur pada panjang gelombang 575 nm (7). Kadar manosa yang terbentuk karena aktivitas enzim merupakan kadar manosa hasil degradasi enzim setelah dikurangi kontrol. Satu unit aktivitas enzim adalah reaksi enzim yang dapat menghasilkan 1 µmol manosa per menit. 3. HASIL DAN PEMBAHASAN Dari hasil pengamatan diketahui bahwa G. stearothermophilus L-07 dapat menghasilkan zona jernih pada medium yang mengandung galaktomanan (locust bean gum) setelah dideteksi dengan congo red (Gambar 1). Hal tersebut berarti bakteri tersebut dapat memecah galaktomanan dengan bantuan reaksi kompleks enzim β-mananase yang menghasilkan manosa dan manooligosakarida. Congo red dapat berikatan dengan polisakarida yang mempunyai ikatan 1,4-β 9. Sedangkan locust bean gum mengandung polimer manan yang mempunyai ikatan 1,4-β manosidik dan terdapat galaktosa sehingga disebut galaktomanan. Setelah galaktomanan tersebut dipecah oleh β-mananase maka disekeliling koloni bakteri hanya terdapat sedikit ikatan 1,4-β manosidik, karena banyak dihasilkan manosa dan manooligosakarida. Dengan demikian warna congo red tidak banyak yang terikat oleh manosa dan manooligosakarida sehingga di sekeliling koloninya tampak menjadi lebih jernih. 2005 FMIPA Universitas Lampung 67
Sumardi Optimasi Produksi Enzim 3.1. Pengaruh konsentrasi locust bean gum sebagai substrat penumbuh terhadap produksi β-mananase G. stearothermophilus L-07 Gambar 1. Reaksi enzim β-mananase yang diproduksi oleh G. stearothermophilus L-07, ditunjukkan dengan zona jernih di sekeliling koloninya setelah diwarnai dengan larutan congo red dan peluntur NaCl Untuk mengetahui kondisi optimal produksi β- mananase oleh G. stearothermophilus L-07, perlakuan yang digunakan adalah konsentrasi locust bean gum yang berbeda yaitu 0,35%, 0,5%, 0,65%, dan 0,8% (Gambar 2). Makin tinggi konsentrasi locust bean gum makin tinggi pula aktivitas β-mananasenya. Aktivitas enzim tertinggi pada konsentrasi locust bean gum 0,65% yaitu sebesar 0,69 U/ml. Kenaikan konsentrasi di atas optimumnya (hingga 0,8%) malah justru menurunkan aktivitasnya. Pada konsentrasi substrat yang tinggi molekul β-mananase berinteraksi dengan substrat membentuk kompleks enzim dengan dobel substrat yang bersifat tidak produktif, sehingga tidak menghasilkan produk yang dikehendaki. Dengan demikian maka aktivitas enzim menjadi rendah. aktivitas mananase (U/ml) 0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 0.35 0.50 0.65 0.80 Konsentrasi LBG (%) Gambar 2. Pengaruh konsentrasi locust bean gum di medium pertumbuhan G. stearothermophilus L-07 terhadap produksi β-mananase 3.5 Aktivitas m ananase spesifik (U/m g) 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 4 5 6 7 8 9 10 ph media Gambar 3. Pengaruh ph medium G. stearothermophilus L-07 terhadap produksi enzim β-mananase 68 2005 FMIPA Universitas Lampung
J. Sains Tek., Agustus 2005, Vol. 11, No. 2 3.2. Produksi β-mananase pada Berbagai ph Media Perlakuan pengaruh ph medium untuk memproduksi β-mananase L-07 dilakukan pada substrat locust bean gum 0,65% (b/v). Dari hasil percobaan diketahui bahwa β-mananase L-07 diproduksi pada ph 5,0 sampai dengan ph 9,0. Pada ph 4,0 dan ph 10 produksi β-mananase sangat kecil (0,01 dan 0,03 U/mg). Dari perlakuan pengaruh ph medium diketahui bahwa ph optimum pertumbuhan diperoleh pada media ph 7,0 (3,1 U/mg) (Gambar 3). Hal itu sesuai sifat dari β-mananase L-07 bahwa kondisi terbaik pada ph 7,0 (6). Pada ph tersebut, ion negatif dan positif seimbang sehingga memungkin β-mananase L-07 dikeluarkan oleh G. stearothermophilus L-07 membentuk konformasi molekul enzim yang tepat untuk melakukan aktivitasnya. Dengan demikian G. stearothermophilus L-07 melakukan aktivitasnya secara maksimal pada ph 7,0. 3.3. Produksi β-mananase pada berbagai lama inkubasi Perlakuan pengaruh lama inkubasi untuk memproduksi β-mananase L-07 dilakukan pada substrat locust bean gum 0,65% (b/v) dan ph medium 7,0. Produksi β-mananase L-07 dinyatakan dalam satuan aktivitas enzim, karena konsentrasi enzim dengan aktivitas enzim berbanding lurus. Pada inkubasi suhu 60 o C, β- mananase L-07 diproduksi mulai pada jam ke-4 dengan aktivitas 0,5 U/mg, aktivitasnya terus naik dan tertinggi pada jam ke-36 dengan aktivitas 3.1 U/mg dan kemudian menurun aktivitasnya secara perlahan, sampai jam ke-48 sebesar 3,0 U/ml (Gambar 4). Namun hasil percobaan pengaruh lama inkubasi terhadap aktivitas β-mananase yang diproduksi oleh G. stearothermophilus L-07 pada suhu 70 o C mulai pada jam ke-6 dengan aktivitas 2,2 U/mg, terus naik aktivitasnya dan tertinggi pada jam ke- 12 dengan aktivitas 3,2 U/mg dan kemudian menurun aktivitasnya secara tajam, sampai jam ke- 24 sebesar 1,9 U/mg (Gambar5). Aktivitas tertinggi dari inkubasi suhu 60 o C dan 70 o C ternyata tidak menunjukkan perbedaan yang berarti. Dari hasil percobaan tersebut juga diketahui bahwa inkubasi pada suhu 70 o C lebih mempercepat produksi enzim, namun enzim tersebut kemudian banyak yang rusak. Pada suhu 60 o C enzim diproduksi dalam waktu yang lebih lama, namun enzim dapat terjaga aktivitasnya. Pada penelitian bakteri termofilik lain, dinyatakan bahwa kelompok β-mananase ekstraseluler pada bakteri 4. Thermotoga neopalitana dapat menghasilkan enzim sebesar 0,83 U/mg, aktif pada suhu 90 o C dan ph 7,1. Sedangkan β-mananase ekstraseluler dari Bacillus sp mempunyai aktivitas 12,5 U/mg aktif pada suhu 70 o C dan ph 7,0 (1). β- mananase ekstraseluler dari Bacillus sp KK01 mempunyai aktivitas 0,04 U/mg aktif pada suhu 50 o C dan ph 7,0 8. 3.5 Aktivitas mananase spesifik (U/mg) 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 Lama inkubasi (jam) Gambar 4. Pengaruh lama inkubasi G. stearothermophilus L-07 terhadap produksi β-mananase pada suhu 60 o C 2005 FMIPA Universitas Lampung 69
Sumardi Optimasi Produksi Enzim Aktivitas mananase spesifik (U/mg) 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 6 12 18 24 Lama inkubasi (Jam) Gambar 5. Pengaruh lama inkubasi G. stearothermophilus L-07 terhadap produksi β-mananase pada suhu 70 o C 4. KESIMPULAN Bakteri aerob termofilik Geobacillus stearothermophilus L-07 dapat menghasilkan β- mananase (endo-1,4-β-d-mananase, EC 3.2.1.78) ekstraseluler. Enzim tersebut menghidrolisis ikatan 1,4-β-manosidik pada galaktomanan menjadi manooligosakarida dan manosa. Medium dengan sumber karbon 0,65% (b/v) locust bean gum, ph 7,0 dan lama inkubasi 36 jam pada suhu 60 o C adalah kondisi terbaik untuk memproduksi β- 1,4-mananase (3.1 U/mg). Dengan perlakuan yang sama, namun suhu dinaikkan menjadi 70 o C ternyata produksi terbaik pada inkubasi selama 12 jam (3,2 U/mg). UCAPAN TERIMA KASIH Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc atas diskusinya. Demikian juga kepada proyek RCMD FMIPA IPB Bogor, Beasiswa BPPS dari Dikti lewat IPB Bogor, dan dana penelitian DIK 2004 Unila Bandar Lampung yang telah ikut mendanai penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA 1. Ooi T and Kikuchi, D. 1995. Purification and some properties of β-mannanase from Bacillus sp. World J. Microbiol. Biotechnol. 11: 310-314 2. Zakaria M.M., Ashiuchi, M., Yamamoto, S., and Yagi, T. 1998. Optimization for β- mannanase production of a psychrophilic bacterium, Flavobacterium sp. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62: 655-660 3. Xu, B. 2002. Endoglucanase and mannanase from blue mussel, Mytilus edulis purification, characterization, gene and tree dimensional structure. Doctoral thesis. Upsala Universitet. 4. Duffaud G.D., McCutchen, C.M., Leduc, P., Parker, K.N. & Kelly, R.M. 1997. Purification and characterization of extremely thermostable β-mannanase, β-mannosidase, and α- galactosidase from the hyperthermophilic eubacterium Thermotoga neopalitana 5068. Appl. Environ. Microbiol. 63:169-177 5. Politz, O., Krah, M., Thomsen, K.K. and Borriss. R. 2000. A highly thermostable endo- (1,4)- β-mannanase from the marine bacterium Rhodothermus marinus. Appl. Microbiol. Biotechnol. 53: 715-721 6. Sumardi. 2005. Isolasi, karakterisasi, dan produksi β-mananase ekstraseluler dari G. stearothermophilus L-07. Disertasi. Sekolah Pascasarjana IPB Bogor. 7. Miller, G.L. 1959. Use of dinitrosalisylic acid reagent of determination of reducing sugar. Anal Chem., 31: 426-428 8. Hossain H.Z., Abe, J. & Hizukuri, S. 1996. Multiple forms of β-mannanase from Bacillus sp. KK01. Enzyme. Microb. Technol.18: 95-98. 9. Teather, R.M, and Wood, P. J. 1982. Used of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterzation of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl Environ Microbiol 43: 777-780 70 2005 FMIPA Universitas Lampung
J. Sains Tek., Agustus 2005, Vol. 11, No. 2 2005 FMIPA Universitas Lampung 71