III. METODE PENELITIAN 3.1 BAHAN DAN ALAT Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah kacang kedelai, kacang tanah, oat, dan wortel yang diperoleh dari daerah Bogor. Bahan kimia yang digunakan yaitu petroleum eter, etanol 95%, etanol 78%, aseton, buffer fosfat 0.08 M ph 6.0; 0.1 M ph 6.0, termamyl (120 L, Novo Laboratories), protease (P-3910, Sigma Chemical), amiloglukosidase (A-9913, Sigma Chemical), larutan NaOH 0.275N, larutan HCl 0.325 M; 4 M; 0.02 M, celite C-211, pepsin, pankreatin, K 2 SO 4, HgO, H 2 SO 4, NaOH 60%-Na 2 SO 3 5%, H 3 BO 3, indikator MM dan MB, serta akuades. Alat-alat yang digunakan adalah alat-alat gelas, neraca analatik, mortar dan alu, blender, desikator, crucible dengan celite, oven vakum, tanur, waterbath, ph meter, labu Kjehldal, alat destilasi dan alat-alat gelas lainnya. 3.2 METODE PENELITIAN 3.2.1 Metode AOAC Official Methods 985.29; 993.19; dan 991.42 Persiapan sampel Metode persiapan sampel terdiri atas persiapan sampel kering, basah, dan tinggi lemak. Sampel kering dapat langsung digiling hingga berukuran 40-50 mesh. Sampel yang basah dihomogenisasi dan dikeringkan dengan oven terlebih dahulu. Sampel yang mengandung lemak lebih dari 10% harus dihilangkan lemaknya dengan cara dicampurkan dalam 25 ml petroleum eter/g sampel selama satu jam sebanyak tiga kali ulangan, selanjutnya diblender kering. Sampel dikeringkan selama 12 jam dengan oven vakum pada suhu 70 o C atau selama 5 jam dalam oven biasa pada suhu 105 o C hingga kadar air sampel kurang dari 5%. Kehilangan bobot akibat penghilangan air dan/atau lemak dicatat dan dibuat faktor koreksi yang tepat untuk menghitung % TDF, IDF, atau SDF. Analisis 3.2.1.1 Total serat pangan (AOAC Official Methods 985.29) Semua prosedur analisis dilakukan terhadap blanko untuk melihat apakah terdapat endapan non serat yang berasal dari reagen atau enzim yang tersisa dalam residu dan dapat terhitung sebagai serat pangan. Sampel ditimbang sebanyak 1 g, dengan keakuratan hingga 0.1 mg, dalam gelas piala 400 ml. Perbedaan bobot antar sampel diusahakan tidak lebih dari 20 mg. Sebanyak 50 ml buffer fosfat ph 6.0 dimasukkan ke dalam gelas piala. Nilai ph diukur hingga ph 6.0 ± 0.2. Sebanyak 0.1 ml larutan termamyl ditambahkan. Kemudian gelas piala ditutup menggunakan kertas aluminium foil (alufo) dan
diletakkan dalam air mendidih selama 15 menit, digoyangkan secara perlahan dalam interval waktu 5 menit. Waktu pemanasan dapat ditambahkan jika jumlah sampel yang ditempatkan di dalam waterbath menyulitkan untuk mencapai suhu internal antara 95-100 o C. Termometer digunakan untuk memastikan tercapainya suhu 95-100 o C selama 15 menit. Prosedur ini dapat dilakukan selama 30 menit. Selanjutnya larutan tersebut didinginkan pada suhu ruang. Nilai ph ditepatkan hingga 7.5 ± 0.2 dengan penambahan 10 ml NaOH 0.275 N. Sebanyak 5 mg protease dimasukkan ke dalam sampel dengan cara dilengketkan pada ujung spatula. Protease dapat pula digunakan dalam bentuk larutan (50 mg dalam 1 ml buffer fosfat) yang dipipet sebanyak 0.1 ml dan dimasukkan ke dalam sampel sesaat sebelum digunakan. Sampel ditutup kembali dengan kertas alufo. Lalu diinkubasi selama 30 menit pada suhu 60 o C dengan agitasi kontinyu. Sampel didinginkan dan ditambahkan 10 ml HCl 0.325 M. Nilai ph diukur hingga berkisar antara 4.0-4.6, jika nilai ph belum tercapai, maka dapat ditetesi kembali dengan asam. Enzim amiloglukosidase ditambahkan dan sampel ditutup kembali dengan kertas alufo. Selanjutnya diinkubasi selama 30 menit pada suhu 60 o C dengan agitasi kontinyu. Sebanyak 280 ml etanol 95% yang sebelumnya telah dipanaskan hingga suhunya 60 o C (volume diukur setelah pemanasan) ditambahkan. Agar terbentuk endapan, sampel dibiarkan pada suhu kamar selama 60 menit. Secara kuantitatif endapan disaring melalui crucible. Sebelumnya, crucible yang mengandung celite ditimbang hingga keakuratan mendekati 0.1 mg. Residu dicuci dengan 3 x 20 ml etil alkohol 78%, 2 x 10 ml etil alkohol 95%, dan 2 x 10 ml aseton secara berturut-turut. Pada beberapa sampel dapat saja terbentuk getah, filtrasi dapat dibantu dengan pengadukan menggunakan spatula. Waktu yang dibutuhkan untuk pencucian dan penyaringan bervariasi antara 0.1 sampai 6 jam, rata-rata waktu yang dibutuhkan ialah 0.5 jam per sampel. Lamanya waktu filtrasi dapat dikurangi dengan penghisapan vakum secara hati-hati setiap lima menit selama filtrasi. Crucible yang mengandung residu dikeringkan selama satu malam di dalam oven vakum dengan suhu 70 o C atau oven biasa pada suhu 105 o C. lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga keakuratan mencapai 0.1 mg. Untuk memperoleh bobot residu, kurangi dengan bobot crucible dan celite. Analisis residu dari satu sampel ulangan digunakan untuk analisis protein menggunakan metode Kjeldahl, faktor konversi yang digunakan ialah N x 6.25, kecuali pada kasus sampel yang diketahui nilai N dalam proteinnya. Sampel ulangan lainnya diabukan selama 5 jam pada suhu 525 o C. kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga keakuratan mendekati 0.1 mg. Kurangi dengan bobot crucible dan celite untuk memperoleh bobot abu. Perhitungan: Penentuan blanko : B = blanko (mg) = bobot residu P B A B 18
Bobot residu = rata-rata bobot residu (mg) untuk dua ulangan sampel blanko; dan P B dan A B = bobot (mg) dari, masing-masing, protein dan abu yang ditentukan dari kedua ulangan sampel blanko. Perhitungan total serat pangan (TDF) : TDF (%) = [(bobot residu P A B) / bobot sampel] x 100 Bobot residu = rata-rata bobot residu (mg) untuk dua ulangan sampel; P dan A = bobot (mg) dari, masing-masing, protein dan abu yang ditentukan dari kedua ulangan sampel, B = blanko (mg), dan bobot sampel = rata-rata bobot sampel (mg) yang diambil. 3.2.1.2 Serat pangan tidak larut (AOAC Official Methods 991.42) Prosedur yang dilakukan sama dengan analisis total serat pangan, hingga langkah filtrasi sampel secara kuantitatif ke dalam crucible. Selanjutnya residu dicuci dengan 2 x 10 ml air (melarutkan SDF), 2 x 10 ml etil alkohol 95%, dan 2 x 10 ml aseton secara berturut-turut. Langkah pengeringan crucible hingga tahap akhir serupa dengan prosedur total serat pangan. Perhitungan: Perhitungan serat pangan tidak larut (IDF) : IDF, % = [(bobot residu P A B) / bobot sampel] x 100 Bobot residu = rata-rata bobot residu (mg) untuk dua ulangan sampel; dan P dan A = bobot (mg) dari, masing-masing, protein dan abu yang ditentukan dari kedua ulangan sampel, B = blanko (mg), dan bobot sampel = rata-rata bobot sampel (mg) yang diambil. 3.2.1.3 Serat pangan larut (AOAC Official Methods 993.19) Prosedur yang dilakukan sama dengan analisis total serat pangan, hingga langkah filtrasi sampel secara kuantitatif ke dalam crucible. Bobot filtrat ditepatkan hingga 100 g dengan air destilata. Sebanyak 280 ml etanol 95% (yang telah dipanaskan hingga suhu 60 o C) ditambahkan ke dalam sampel. Lalu dibiarkan mengendap pada suhu kamar selama 1 jam. Langkah pengeringan crucible hingga tahap akhir serupa dengan prosedur total serat pangan. Perhitungan: Perhitungan serat pangan larut (SDF) : SDF (%) = [(bobot residu P A B) / bobot sampel] x 100 Bobot residu = rata-rata bobot residu (mg) untuk dua ulangan sampel; P dan A = bobot (mg) dari, masing-masing, protein dan abu yang ditentukan dari kedua ulangan sampel, B = blanko (mg), dan bobot sampel = rata-rata bobot sampel (mg) yang diambil. Perhitungan total serat pangan (TDF) : TDF (%) = SDF + IDF x 100 19
3.2.2 Metode Asp et al., 1992 Persiapan sampel Persiapan sampel yang dilakukan pada analisis serat pangan menggunakan metode Asp sama seperti persiapan sampel yang dilakukan pada metode AOAC. Analisis Sampel kering diekstrak lemaknya dengan pelarut petroleum eter pada suhu kamar selama 15 menit kemudian dikeringkan pada suhu ruang. Sejumlah 1 g sampel bebas lemak (w) dimasukkan ke dalam erlenmeyer, kemudian ditambah 25 ml 0.1 M buffer fosfat ph 6 dan dibuat menjadi suspensi. Sampel kemudian ditambahkan 0.1 ml termamyl, ditutup dengan alufo dan diinkubasi pada suhu 100 o C selama 15 menit dan didinginkan, kemudian ditambahkan 20 ml akuades dan ph diatur menjadi 1.5 dengan menambahkan HCl 4 M. Sampel lalu ditambahkan 100 mg pepsin, ditutup dan diinkubasi pada suhu 40 o C dan diagitasi selama 60 menit. Sampel kemudian ditambahkan 20 ml akuades dan ph diatur menjadi 6.8, lalu ditambahkan 100 mg pankreatin, ditutup, dan diinkubasi pada suhu 40 o C selama 60 menit sambil diagitasi, dan terakhir ph diatur dengan HCl menjadi 4.5. Residu diperoleh melalui penyaringan menggunakan crucible yang berisi celite (bobot kering diketahui). Residu kemudian dicuci dengan 2 x 10 ml aquades, 2 x 10 ml etanol 95%, dan 2 x 10 ml aseton, lalu dikeringkan pada suhu 105 o C hingga berat tetap (sekitar 12 jam) dan ditimbang setelah didinginkan dalam desikator. Residu kemudian diabukan dalam tanur 525 o C selama minimal 5 jam, didinginkan dalam desikator, dan ditimbang. Nilai blanko diperoleh dengan cara yang sama namun tanpa menggunakan sampel. 3.2.3 Evaluasi terhadap Parameter Repeatability, Selektivitas, dan Ruggedness 3.2.3.1. Repeatability Evaluasi terhadap parameter repeatability dilakukan dengan menganalisis kandungan serat pangan (TDF, IDF, dan SDF) yang terdapat dalam empat sampel, yaitu kacang kedelai, kacang tanah, oat, dan wortel menggunakan metode AOAC dan Asp. Menurut EURACHEM Guide (1998), evaluasi terhadap parameter repeatability dilakukan dengan menganalisis sampel sebanyak tujuh hingga sepuluh kali. Hasil analisis serat pangan tiap sampel kemudian dirata-rata serta ditentukan nilai SD dan RSD. Hasil analisis serat pangan mencapai persyaratan repeatability yang baik jika memiliki nilai RSD maksimal 2/3 RSD R (Horwitz). Parameter selektivitas dilakukan dengan membandingkan rata-rata hasil analisis serat pangan masingmasing sampel antara metode AOAC dan Asp. Uji t dilakukan terhadap ratarata serat pangan sampel antara metode AOAC dan Asp untuk mengetahui apakah rata-rata kedua set data tersebut berbeda secara signifikan pada taraf kepercayaan 99%. Uji F dilakukan terhadap nilai SD analisis serat pangan 20
sampel antara metode AOAC dan Asp untuk mengetahui apakah keragaman kedua set data tersebut berbeda secara nyata pada taraf kepercayaan 99%. Diagram proses evaluasi metode serat pangan terhadap parameter repeatability dapat dilihat pada Gambar 7. Sampel (Metode AOAC) (Metode Asp) Uji t dan Uji F Gambar 7. Diagram proses evaluasi metode analisis serat pangan terhadap parameter repeatability 3.2.3.2. Selektivitas Evaluasi terhadap parameter selektivitas dilakukan dengan menganalisis kadar kontaminan yang mungkin masih terdapat pada residu serat. Kontaminan yang dibandingkan antara kedua metode ialah protein dan abu.. Diagram proses evaluasi metode serat pangan terhadap parameter ruggedness dapat dilihat pada Gambar 8. Sampel (Metode AOAC) (Metode Asp) Rata-rata kadar abu dan protein Rata-rata kadar abu dan protein Uji t dan Uji F Gambar 8. Diagram proses evaluasi metode analisis serat pangan terhadap parameter selektivitas 21
3.2.3.3. Ruggedness Test Evaluasi terhadap parameter ruggedness dilakukan dengan memvariasikan konsentrasi etanol yang digunakan dalam pengendapan SDF, baik pada metode AOAC maupun Asp. Analisis serat pangan dilakukan sebanyak dua ulangan (duplo) terhadap empat sampel, yaitu kacang kedelai, kacang tanah, oat, dan wortel menggunakan metode AOAC dan Asp. Rata-rata nilai serat pangan antara perlakuan menggunakan etanol 95% dan 78% dibandingkan menggunakan uji t dan uji F. Jika hasil analisis tidak berbeda secara signifikan, konsentrasi etanol yang dipilih ialah konsentrasi terkecil, yaitu 78%. Diagram proses evaluasi metode serat pangan terhadap parameter ruggedness dapat dilihat pada Gambar 9. Metode AOAC dan Asp Etanol 78% (duplo) Etanol 95% (duplo) Uji t dan Uji F Gambar 9. Diagram proses evaluasi metode analisis serat pangan terhadap parameter Ruggedness 22