62 MATERI DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan selama sembilan bulan, yaitu dari bulan Oktober 2009 sampai dengan Juni 2010. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler, Bagian Pemuliaan dan Genetika Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Materi Sapi Perah FH Sapi perah yang digunakan untuk penelitian adalah sapi FH laktasi dengan kisaran hari laktasi 1 sampai 6 bulan dan periode laktasi 1 sampai 5 pada daerah sentra produksi susu di Kabupaten Lembang Jawa Barat yang telah diketahui data produksi dan kualitas susunya. Studi dilakukan pada dua kondisi pemeliharaan berbeda yaitu pada pemeliharaan secara intensif dan semi intensif. Pada pemeliharaan ternak perah secara intensif usaha dilakukan dengan organisasi operasional yang modern dan skala usaha yang besar, dijalankan secara teratur di suatu tempat dalam jangka waktu tertentu dan bertujuan komersial yaitu menghasilkan susu dan hasil sampingan yang lainnya. Pemeliharaan dengan manajemen intensif diwakili oleh Unit Pelaksana Teknis Daerah (UPTD) Balai Pembibitan dan Pengembangan Sapi Perah (PBPT-SP) Cikole. Penerapan aspek teknis pemeliharaan sapi perah yang meliputi breeding dan reproduksi, makanan ternak, pengelolaan, kandang dan peralatan serta kesehatan ternak pada PBPT-SP Cikole secara umum telah terkontrol dan dilakukan sesuai Good Farming Practice. Gambaran pelaksanaan pemeliharaan ternak pada PBPT-SP Cikole dapat dilihat pada Lampiran 13. Pada pemeliharaan ternak secara semi intensif usaha dilakukan dalam skala kecil sebagai usaha rumah tangga, tanpa sepenuhnya mengikuti prinsip-prinsip ekonomi dan tanpa dukungan teknologi yang memadai. Pemeliharaan dengan manajemen semi intensif diwakili oleh peternakan rakyat di bawah binaan Koperasi Susu Bandung Utara (KPSBU) Lembang yaitu peternakan rakyat di desa Cilumber dan di desa Pasar Kemis. Penerapan aspek teknis pemeliharaan sapi perah pada
63 peternakan rakyat di bawah binaan KPSBU Lembang secara umum baru mencapai 80%. Penerapan aspek teknis dari yang tertinggi hingga terendah berturut-turut adalah aspek kesehatan hewan (85.5%), diikuti aspek makanan ternak (84.38%), aspek pengelolaan (78.16%), aspek kandang dan peralatan (76.13%) serta aspek breeding dan reproduksi (72.35%). Gambaran pelaksanaan pemeliharaan ternak pada peternakan rakyat di bawah binaan KPSBU Lembang dapat dilihat pada Lampiran 13. Sampel Darah Sampel darah yang digunakan dalam penelitian ini adalah darah yang berasal dari sapi FH laktasi yang telah diketahui data produksi dan kualitas susunya. Sampel yang digunakan sebanyak 282 ekor dengan perincian dari PBPT Cikole sebanyak 88 ekor, KPSBU Desa Pasir Kemis sebanyak 96 ekor dan KPSBU Desa Cilumber sebanyak 98 ekor. Sampel darah diambil dari bagian vena juguralis dengan menggunakan jarum vaccutainer no. 21 G dan disimpan dalam tabung vaccutainer 10 ml dengan alkohol absolut. Perbandingan antara volume alkohol dengan darah adalah 1:1. Metode Isolasi DNA DNA yang digunakan untuk identifikasi polimorfisme gen β-kasein dan laktoferin merupakan koleksi dari Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Isolasi DNA dilakukan dari darah dan sel somatik susu. Isolasi DNA dari sampel darah menggunakan metode ekstraksi phenol-chloroform (Sambrook et al. 1989) yang telah dimodifikasi untuk sampel darah yang disimpan dalam alkohol. Isolasi DNA dari sampel susu menggunakan metode ekstraksi DNA dari sel somatik (Arnould et al. 2009). Polymerase Chain Reaction
64 Reaksi PCR dilakukan pada mesin thermocycler dengan enzim taq polymerase dan buffernya. Informasi mengenai primer yang digunakan untuk gen laktoferin dan β-kasein disajikan pada Tabel 4. Pereaksi yang digunakan untuk amplifikasi kedua ruas gen target adalah 2 µl sampel DNA cetakan, primer 1 pmol, dntps 200 µm, MgCl 2 1 mm, dan 0.5 unit taq polymerase (Real Taq) serta bufernya dalam larutan total 25 µl. Amplifikasi in vitro dengan mesin thermal cycler dilakukan dengan kondisi denaturasi awal pada suhu 94 ºC selama 5 menit, 35 siklus yang terdiri atas denaturasi pada suhu 94 ºC selama 45 detik, annealing pada suhu 59 ºC selama 1 menit untuk gen β-kasein dan suhu 60 ºC selama 45 detik untuk laktoferin. Elongasi pada suhu 72 ºC selama 1 menit dan elongasi akhir pada suhu 72 ºC selama 5 menit. Tabel 4 Informasi sekuen primer yang digunakan dalam penelitian. Produk Daerah Gen PCR Sekuen Primer (5-3 ) Target (pb) LF 301 Intron 6 CSN2 233 Exon 7 Sumber F: GCCTCATGACAACTCCCACAC Wojdak- R: CAGGTTGACACATCGGTTGAC Maksymiec et al. 2006 F:CCAGACACAGTCTCTAGTCTATCCC Medrano dan R:CAACATCAGTGAGAGTCAGGCTCCG Sharrow 1991 Penentuan Genotipe (Genotyping) Penentuan genotipe untuk gen β-kasein dan gen laktoferin menggunakan metode restriction fragment length polymorphism (RFLP). Hasil genotyping divisualisasikan pada gel agarose 2% dengan bufer 0,5x TBE (tris borat EDTA) yang dijalankan pada tegangan 100 volt selama 40 menit yang diwarnai dengan etidium bromida di atas UV trans ilmuninator. Enzim restriksi yang digunakan untuk gen target β-kasein adalah MspI dengan situs pemotong C CGG dan untuk gen target laktoferin adalah EcoRI dengan situs pemotong G AATTC. Pengukuran Produksi Susu Data produksi susu merupakan data sekunder (data telah diambil pada bulan Agustus 2008). Data produksi susu merupakan data produksi satu hari yang diperoleh dengan menjumlahkan produksi pagi dan sore dari sapi laktasi dalam kisaran bulan laktasi antara 1sampai 6 bulan dan periode laktasi antara 1sampai 5.
65 Analisis Kualitas Susu Data kualitas susu yang terdiri atas kadar protein, berat jenis, kadar lemak, kadar bahan kering dan kadar bahan kering tanpa lemak yang merupakan data sekunder (data telah diambil pada bulan Agustus 2008). Prosedur pengujian kualitas susu yang dilakukan sesuai standart uji pada Dewan Standarisasi Nasional (1998) yaitu: Analisis kadar protein. Prosedur pengujian kadar protein menggunakan cara titrasi formol, p yaitu banyaknya NaOH yang terpakai untuk titrasi sampel (susu) dan q yaitu banyaknya NaOH yang terpakai untuk titrasi blanko. Kadar protein dihitung dengan rumus berikut: % protein = (p q) ml x 1.7 (faktor formol) Analisis kadar lemak. Pengukuran kadar lemak susu menggunakan metode Gerber. Analisis berat jenis. Pengukuran berat jenis dilakukan dengan alat laktodensimeter, kemudian dilakukan penyetaraan pada suhu 27.5 C. Penyebab utama bervariasinya berat jenis ini adalah kandungan lemak susu. Berat jenis dari skim, krim dan susu segar dapat dihitung dengan rumus berikut: Keterangan: ρ = berat jenis mf = kadar lemak Bahan kering dan bahan kering tanpa lemak. Dihitung setelah kadar lemak dan berat jenis diperoleh dengan rumus: Bahan kering tanpa lemak = Bahan kering Kadar lemak Penghitungan Jumlah Sel Somatik Susu Pemeriksaan sel somatik dengan metode Breed dilakukan dengan mengambil sebanyak 0,01 ml sampel susu, diteteskan pada gelas objek dan diratakan hingga
66 membentuk suatu lapisan tipis dan merata. Sampel dibiarkan kering udara selama 5 sampai 10 menit selanjutnya difiksasi dengan api Bunsen. Pewarnaan Breed dilakukan dengan merendam gelas objek dalam eter alkohol selama 2 menit. Sampel diwarnai dengan larutan Methylen Loeffler biru selama 1-2 menit, kemudian dimasukkan dalam larutan alkohol 96 % untuk menghilangkan sisa zat warna yang tidak melekat. Jumlah sel somatis dihitung dengan bantuan mikroskop pada pembesaran 100 kali. Rancangan dan Analisis Data Frekuensi Alel dan Genotipe Frekuensi alel dari masing-masing lokus dapat diperkirakan dengan penghitungan jumlah gen pada populasi. Menurut Nei (1987), jika n ii adalah individu yang bergenotipe A i A i, n ij adalah individu yang bergenotipe A i A j, dan jumlah total sampel adalah n, maka frekuensi alel A i (χ i ) dihitung dengan persamaan sebagai berikut: 2 nij / n i n ii 2 Frekuensi genotipe dapat diperkirakan dengan menghitung perbandingan jumlah genotipe pada populasi. Menggunakan asumsi sebelumnya, maka frekuensi genotipe A i A i (χ ii ) dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut: Keterangan : n ii ii n X i = frekuensi alel ke-i n ij = jumlah individu yang bergenotipe ii n ii = jumlah individu yang bergenotipe ij n = jumlah sampel Derajat Heterozigositas Derajat heterozigositas (ĥ) dihitung berdasarkan frekuensi alel pada tiap lokus DNA dengan rumus Nei (1987) : ĥ = 2n (1 - Σ X 2 i ) / (2n 1) Keterangan : X i = frekuensi alel ĥ = nilai heterozigositas lokus
67 Proporsi Hardy-Weinberg Proporsi Hardy-Weinberg dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut: 2 2 ( O E) E Keterangan : χ 2 = nilai chi-square uji O = jumlah pengamatan genotipe ke-i E = jumlah harapan genotipe ke-i Penentuan keragaman genetik dilakukan dengan analisis frekuensi alel, frekuensi genotipe dan nilai heterozigositas. Penentuan keseimbangan genotipe dilakukan dengan menghitung Proporsi Hardy-Weinberg. Analisis keragaman dan keseimbangan genetik gen β-kasein dan laktoferin diuji dengan software Tools for Population Genetics Analyses (TFPGA) (Miller 1997). Pengaruh Manajemen Pemeliharaan terhadap Produksi dan Kualitas Susu Hubungan antara manajemen pemeliharaan dengan produksi dan kualitas susu sapi perah FH dianalisis dengan pendekatan General Linear Model. Data produksi dan kualitas susu dikelompokkan berdasarkan manajemen pemeliharaan, periode dan bulan laktasi yang berbeda. Pengujian dilakukan berdasarkan perbedaan kelompok dan jika respon menunjukkan perbedaan (α=0,05) dilakukan pengujian lanjut dengan metode uji beda Tukey. Model matematis dirumuskan sebagai berikut (Mattjik dan Sumertawijaya (2006): Y ij = μ + α i + e ij Keterangan : Y ij = nilai pengamatan μ = komponen aditif dari rataan α i = pengaruh aditif perlakuan e ij = pengaruh galat perlakuan Pengaruh Genotipe β-kasein dan Laktoferin terhadap Protein dan Kualitas Susu Data produksi dan kualitas susu sebelum dianalisis distandarisasi terhadap hari laktasi (1 sampai 6 bulan) dan periode laktasi (1sampai 5). Standarisasi menggunakan rumus : Peubah terstandarisasi Keterangan: = rataan peubah yang digunakan sebagai standar = rataan peubah yang akan distandarisasi
68 x = peubah yang akan distandarisai Analisis hubungan antara genotipe β-kasein dan laktoferin dengan produksi susu, kadar protein dan kualitas susu (ph, kadar lemak, bahan kering dan berat kering tanpa lemak) dilakukan dengan metode analisis General Linear Model (GLM) dengan menggunakan software SAS Ver 9,1. Pengaruh keragaman genetik serta korelasi antara dua gen terhadap produksi susu dan kualitasnya dihitung berdasarkan model linear dari Mattjik dan Sumertawijaya (2006) dan jika respon menunjukkan perbedaan (α=0,05) dilakukan pengujian lanjut dengan metode uji Tukey. Model matematis dirumuskan sebagai berikut: Y ijk = μ + α i + β j + (αβ) ij + e ijk Keterangan : Y ij = nilai pengamatan μ = komponen aditif dari rataan α i = pengaruh aditif gen β-kasein β j = pengaruh aditif gen laktoferin (αβ) ij = pengaruh aditif interaksi gen β-kasein dan laktoferin = pengaruh galat perlakuan e ijk