ISOLASI TOTAL DNA TUMBUHAN DENGAN KIT EKSTRAKSI DNA PHYTOPURE Halaman : 1 dari 5 1. RUANG LINGKUP Metode ini digunakan untuk mengisolasi DNA dari sampel jaringan tumbuhan, dapat dari daun, akar, batang, buang maupun buah. 2. ACUAN NORMATIF Karp, A., S. Kresovich, K. V. Bhat, W. G. Ayad and T. Hodgkin. 1997. Molecular tools in plant genetic resources conservation: a guide to the technologies. International Plant genetic Resources Institute. Sambrook, J., E. F. Fritch and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning : a laboratory manual. Volume 1-3. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press., Cold Spring Harbor. 3. ISTILAH DAN DEFINISI DNA (Deoxyribosa Nucleic Acid) adalah asam nukleat yang berada di dalam dan atau di luar inti sel (nukleus) yang dimiliki oleh semua organisme hidup (virus pengecualian) serta berperan sebagai materi genetik. Materi genetik adalah suatu faktor pembawa sifat organisme yaitu gen. Gen adalah segmen / sekuens spesifik dari DNA yang membawa sifat genetik, diekspresikan pada fenotip dan diwariskan kepada keturunanya Isolasi DNA adalah proses pemisahan molekul DNA dari molekul-molekul lain di inti sel.
Halaman : 2 dari 5 4. CARA UJI 4.1. Prinsip Prinsip kerja isolasi DNA adalah preparasi ekstrak DNA (perusakan dinding sel dan lisis membran sel), purifikasi DNA, dan presipitasi DNA, serta pemisahan terhadap protein (dengan protease) dan RNA (dengan RNAse). Hasil dari ekstraksi DNA diperlukan uji kualitas DNA, yang ditentukan oleh kemurnian DNA, panjang DNA, kemampuan dipotong oleh enzim, tidak mengalami modifikasi selama proses isolasi berlangsung. 4.2. Bahan Kit ekstraksi phytopure, larutan buffer TE, larutan TBE 10x, larutan kloroform, akuades dan larutan ethanol. 4.3. Peralatan Timbangan, mortar, sentrifugasi, mikrotube, botol flakon, pipet eppendorf, pipet tip, pipet ukur, pro pipet, tabung reaksi, oven, erlenmeyer, gelas beker, elektroforesis, spektrofotometer Qubit, pendingin. 4.4. Persiapan pengujian Sampel jaringan tanaman yang akan diuji ditimbang dengan berat 0,3 gr kemudian dibekukan dengan nitrogen cair atau dimasukkan dalam freezer terlebih dahulu 4.5. Prosedur pengujian Sampel digerus di atas mortar dan ditambahkan 500 µl Reagen Phytopure I lalu digerus kembali. Campuran dituang ke dalam tube 1,5 ml dan ditambahkan 200 µl Reagen Phytopure II kemudian diinversi hingga homogen. Setelah itu diinkubasi pada suhu 70 C selama 20 menit dan kemudian diletakkan dalam freezer selama 10 menit. Tahap selanjutnya ditambahkan 400 µl chloroform dingin dan 20 µl resin Phytopure dengan
Halaman : 3 dari 5 cara dituang tegak lurus dengan tube kemudian diinversi selama 30 menit. Tahap selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 1300 rpm selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan diambil dan dipindahkan ke dalam tube baru. Apabila supernatan yang dihasilkan keruh, ditambahkan akubides sebanyak 200 µl dan chloroform dingin 400 µl. Tahap selanjutnya disentrifugasi kembali 1300 rpm selam 10 menit.supernatan diambil dan ditambahkan isopropanol dingin melalui dinding dengan volume sama dengan supernatan yang diambil. Proses selanjutnya digoyang perlahan dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan diperoleh pellet DNA di dasar tube. Pellet dicuci dengan 100 µl ethanol 70% dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Pencucian ini dilakukan sebanyak 3 kali. Ethanol dibuang kemudian dikering anginkan serta ditambahkan 50 µl 1x buffer TE. Setelah dilakukan ekstraksi dilakukan uji kualitatif dengan elektroforesis dan dan uji kuantitatif dengan spektrofotometer. 4.6. Perhitungan Perhitungan data ukuran DNA dilakukan melalui analisis kualitatif dan kuantitatif DNA. Analisis data secara kualitatif untuk memperoleh konsentrasi serta kemurnian hasil ektraksi DNA dapat menggunakan spektrofotometer Qubit kemudian dihitung nilai konsentrasi dengan persamaan [DNA]=OD260x50x FC Keterangan : [DNA]: konsentrasi DNA (μl/ml) OD 260: nilai absorbansi pada panjang gelombang 260nm FC: faktor pengenceran Sedangkan umtuk menghitung nilai kemurnian hasil ekstraksi ditentukan dengan persamaan DNA= OD 260 OD 280
Keterangan : FAKULTAS BIOLOGI DNA : kemurnian DNA OD 260: nilai absorbansi pada panjang gelombang 260nm OD 280: nilai absorbansi pada panjang gelombang 280nm. Halaman : 4 dari 5 Analisis data kualitatif menggunakan metode elektroforesis dengan pengamatan pita atau band dilakukan dibawah sinar UV. Uji kualitas DNA dilakukan dengan mengambil sebanyak 5 µl sampel dicampurkan dengan 2µL loading buffer (30% gliserol; 0,2% bromfenol biru; 10mM tris-hcl ph 8,0; 0,1 mm EDTA), kemudian dimasukkan ke dalam 0,8% gel agarosa (0,2µg ml -1 SYBR SAFE) dan dielekroforesis pada 50V selama 40 menit dalam TBE buffer 1X. Hasil positif yang didapatkan saat pengamatan di bawah sinar UV yaitu tervisualisasinya pita total DNA hasil isolasi. Cara analisis hasil pita yang didapatkan adalah benar pita total DNA yaitu dengan melihat ukuran pita/band yang tervisualisasi dalam satuan base pair (bp) dan kemudian dicocokkan dengan marker. 5. PENGENDALIAN MUTU 5.1. Pengendalian mutu hasil isolasi DNA Setiap tahapan isolasi disesuaikan dengan protokol isolasi DNA dengan adanya modifikasi pada saat optimasi metode sebelumnya sehingga didapatkan pelet DNA yang berwarna putih bening didasar tube ekstraksi 5.2. Pengendalian mutu hasil DNA Ukuran DNA yang dapat dipisahkan oleh gel agarosa dengan konstentrasi 0,8% berkisar dari 10kb 0,7kb (Beckmann & Osborn, 1992). Konsentrasi dan kemurnian DNA diuji secara kuantitatif dengan menggunakan metode spektrofotometri dengan sinar UV pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Pita ganda DNA dapat menyerap sinar UV pada panjang gelombang 260 nm sedangkan kontaminan seperti protein atau fenol akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang 280 nm. Oleh sebab itu, nilai kemurnian DNA dapat diukur
Halaman : 5 dari 5 dengan absorbansi Å260/Å280 dengan hasil kemurnian pada kisaran 1,7-1,8. Tingkat konsentrasi DNA diketahui dari nilai OD sampel dengan formula [DNA] (mg/ml) = O.D.260 x 50 x faktor pengenceran (Sambrook and Russel, 1989).