JUDUL PERCOBAAN : PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET HARI/TANGGAL PERCOBAAN : Selasa, 19 November 2013 SELESAI PERCOBAAN : Selasa, 19 November 2013 TUJUAN PERCOBAAN : Menentukan kadar protein yang ada pada sampel dengan menggunakan metode biuret DASAR TEORI : Protein berasal dari kata Yunani kuno proteos yang artinya yang utama. Dari asal kata ini dapat diambil kesimpulan bagaimana pentingnya protein dalam kehidupan. Protein terdapat pada semua sel hidup, kira-kira 50% dari berat keringnya dan berfungsi sebagai pembangun struktur, biokatalis, hormon, sumber energi, penyangga racun, pengatur ph, dan bakan sebagai pembawa sifat turunan dari generasi ke generasi (Girindra, 1993). Protein merupakan polipeptida berbobot molekul tinggi. Protein sederhana hanya mengandung asam-asam amino. Protein kompleks mengandung bahan tambahan bukan asam amino, seperti derivat vitamin, lipid atau karbohidrat. Protein berperan pokok dalam fungsi sel. Analisis terhadap protein dan enzim darah tertentu digunakan secara luas untuk tujuan diagnostik (Harper, 1995). Protein dapat ditetapkan kadarnya dengan metode biuret. Prinsip dari metode biuret ini adalah ikatan peptida dapat membentuk senyawa kompleks berwarna ungu dengan penambahan garam kupri dalam suasana basa (Carprette, 2005). Reaksi biuret terdiri dari campuran protein dengan sodium hidroksida (berupa larutan) dan tembaga sulfat. Warna violet adalah hasil dari reaksi ini. Reaksi ini positif untuk 2 atau lebih ikatan peptida (Harrow, 1954). Reaksi :
Biuret adalah reagen yang digunakan untuk menguji kandungan protein suatu bahan makanan. Pengujian biuret dengan cara meneteskan larutan biuret pada bahan makanan yang akan diuji. Jika terkandung protein pada bahan makanan tersebut maka warna biuret yang tadinya warnanya merah kehitaman akan berubah menjadi ungu atau violet. Kandungan senyawa/zat pada reagen biuret : CuSO 4 memberikan kompleks berwarna KOH memberikan suasana basa (mengubah Cu 2+ Cu + ) KNaC 4 H 4 O 6 (Kalium Natrium Tartrat) Cu 2+ untuk menstabilkan kompleks ion Larutan ion Cu 2+ membentuk kompleks dengan ikatan peptida suatu protein sehingga menghsilkan warna ungu dengan absorbansi dari panjang gelombang ( ) maksimal 540 nm Metode Spektrofotometri Sifat protein jika dilarutkan dengan asam klorida dan enzim protease akan menghasilakan asam amino karboksilat. Disisi lain protein dapat mengalami denaturasi yaitu perubahan struktur protein yang menimbulakn perubahan sifat fisika, kimia dan biologi bila Protein apabila dipanaskan dapat mengakibatkan
gelombang elektromagnetik tertentu contohnya bisa, kokain kuman-kuman dan lain-lain. Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube (Yoky 2009). Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri. Spektrofotometer dapat mengukur serapan di daerah tampak, UV (200-380 nm) maupun IR (> 750 nm) dan menggunakan sumber sinar yang berbeda pada masing-masing daerah (sinar tampak, UV, IR). Monokromator pada spektrofotometer menggunakan kisi atau prisma yang daya resolusinya lebih baik sedangkan detektornya menggunakan tabung penggandaan foton atau fototube. Komponen utama dari spektrofotometer, yaitu sumber cahaya, pengatur Intensitas, monokromator, kuvet, detektor, penguat (amplifier), dan indikator. Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombangdan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda. Metode Spektrofotokopi dengan untraviolet yang yang diserap bukan cahaya tampak cahaya ultra ungu (Ultraviolet). Dalam Spektrofotokopi ultra ungu energi cahaya tampak terserap digunakan untuk transfuse electron. Karena energi Cahaya Ultraviolet dapat menyebabkan transfuse electron. Putih Telur Putih telur terdiri dari empat lapisan yaitu lapisan encer luar, lapisan kental luar, lapisan encer dalam dan khalazaferous. Empat bagian utama putih telur yaitu lapisan putih telur yang encer bagian luar, lapisan putih telur yang kental, lapisan putih telur encer bagian dalam dan lapisan kalaza. Bagian putih telur diikat dengan bagian kuning telur oleh kalaza, yaitu serabut-serabut protein berbentuk spiral yang disebut mucin. Bahan utama penyusun putih telur adalah
protein dan air. Perbedaan kekentalan putih telur disebabkan oleh perbedaan kandungan air (Suryono 2006). Protein sederhana pada putih telur terdiri atas ovalbumin, ovoconalbumin dan ovoglobulin, sedangkan yang kedua termasuk glycoprotein, yaitu ovomucoid dan ovomucin. Ovomucin pada putih telur pada putih telur yang kental lebih besar daripada putih telur yang encer. Ovomucin merupakan fraksi protein putih telur yang membentuk selaput dan berfungsi menstabilkan struktur buih. Pemberian asam asetat yang berlebihan akan mengakibatkan penggumpalan sebagian ovomucin dan memperkecil elastisitas gelembung buih. Kerusakan gejala-gejala ovomucin mengakibatkan air dari protein putih telur akan keluar dan putih telur menjadi encer. Semakin encer putih telur, maka semakin tinggi tirisan buih yang dihasilkan (Suryono 2006). Albumin Albumin merupakan protein utama dalam plasma manusia (kurang lebih 3,4-4,7 g/dl) dan menyusun sekitar 60% dari total protein plasma. Albumin merupakan jenis protein terbanyak di dalam plasma yang mencapai kadar 60 persen. Protein yang larut dalam air dan mengendap pada pemanasan itu merupakan salah satu konstituen utama tubuh (Sarikkuntuk 2006).
ALAT DAN BAHAN : 1. Alat : a. Tabung reaksi 9 buah b. Pipet gondok 1 buah c. Gelas kimia 7 buah d. Gelas ukur 1 buah e. Spatula 1 buah 2. Bahan : a. Larutan standar protein b. Larutan sampel protein c. Reagen biuret d. Aquades ALUR KERJA : 1. Pembuatan standar 1 ml larutan standar protein dengan kadar 1mg, 2mg,3mg, 4mg, 5mg per ml protein Ditambah 4 ml reagen biuret Dikocok Diinkubasi pada suhu 41 o C selama 10 menit Dibiarkan pada suhu ruang selama 10 menit sampai terbentuk warna ungu yang stabil dan sempurna Diukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis Absorbansi
2. Penetapan absorbansi larutan blanko 1ml aquades Ditambah 4 ml reagen biuret Dikocok Diinkubasi pada suhu 41 o C selama 10 menit Dibiarkan pada suhu ruang selama 10 menit Diukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis Absorbansi 3. Penetapan absorbansi larutan sampel 1ml lar. Sampel Ditambah 4 ml reagen biuret Dikocok Diinkubasi pada suhu 41 o C selama 10 menit Dibiarkan pada suhu ruang selama 10 menit Diukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis Absorbansi
HASIL PENGAMATAN : No. Prosedur Percobaan Hasil Pengamatan Dugaan/Reaksi Kesimpulan 1. Pembuatan larutan standar Dengan pengenceran bertahap, volume yang digunakan adalah : a. V 1 = 10 ml b. V 2 = 13,3 ml c. V 3 = 15 ml d. V 4 = 16 ml e. V 5 = 10 ml Sebelum : Standar protein (10 mg/ml) : tidak berwarna Aquades : tidak berwarna Larutan standar berbagai konsentrasi : tidak berwarna Reagen biuret : larutan biru jernih Kandungan senyawa/zat pada reagen biuret : CuSO 4 memberikan kompleks berwarna KOH memberikan suasana basa (mengubah Cu 2+ Cu + ) KNaC 4 H 4 O 6 (Kalium Natrium Tartrat) untuk menstabilkan kompleks ion Cu 2+ Larutan ion Cu 2+ membentuk kompleks dengan ikatan peptida suatu protein sehingga menghsilkan warna ungu dengan absorbansi dari panjang gelombang ( ) maksimal 540 nm Dari sepktrosfotometri UV-Vis didapatkan persamaan : y = 0,0395x + 0,02942 R 2 = 0,99618 Dari microsoft excel didapatkan persamaan : y = 0,040x + 0,014 R 2 = 0,983
Sesudah : Larutan standar + r. Biuret : larutan biru jernih (+) Larutan standar + r. Biuret + diinkubasi : larutan biru jernih (++) Kepekatan larutan dari pekat samapi tidak pekat 5mg> 4mg> 3mg> 2mg> 1mg C (mg/ml) A 1 0,062 2 0,103 3 0,141 4 0,176 5 0,205 Reaksi :
2. Penetapan absorbansi larutan blanko Sebelum : Aquades : tidak berwarna Reagen biuret : biru jernih Sesudah : Aquades + reagen biuret : biru jernih (+)
3. Penetapan absorbansi larutan sampel Sebelum : Sampel : tidak berwarna Reagen biuret : biru jernih Sesudah : Sampel + reagen biuret : biru jernih (+) Sampel + reagen biuret + diinkubasi : biru jernih (++) Sampel Absorbansi Sampel 1 0,053 Sampel 2 0,059 Sampel 3 0,054
ANALISIS DATA : Pada percobaan Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret ini bertujuan untuk menentukan kadar proteinn yang ada pada sampel dengan menggunakan metode biuret. Pada percobaan ini dilakukan dalam tiga tahap. Tahap pertama yaitu pembuatan larutan standar yang bertujuan untuk standarisasi larutan yang dianalisis yang digunakan untuk pembuatan kurva standar. Hal ini dilakukan dengan memasukkan 1 ml larutan standar protein dengan kadar 1mg, 2mg, 3mg, 4mg dan 5mg per ml protein melalui pengenceran bertahap dengan larutan induk standar yang digunakan yaitu 10mg/ml. Volume yang digunakan dalam pengenceran bertahap ini adalah ebagai berikut : Mula-mula larutan induk protein 10 mg/ ml di buat menjadi larutan standar protein 5 mg/ml dengan perhitungan : M 1 x V 1 = M 2 x V 2 10 mg/ml x V 1 = 5 mg/ml x 20 ml V 1 = 10 ml Setelah itu dilakukan pengenceran dari 5 mg/ml menjadi 4 mg/ml dengan perhitungan : M 1 x V 1 = M 2 x V 2 5 mg/ml x V 1 = 4 mg/ml x 20 ml V 1 = 16 ml Setelah itu dilakukan pengenceran dari 4 mg/ml menjadi 3 mg/ml dengan perhitungan : M 1 x V 1 = M 2 x V 2 4 mg/ml x V 1 = 3 mg/ml x 20 ml V 1 = 15 ml
Setelah itu dilakukan pengenceran dari 3 mg/ml menjadi 2 mg/ml dengan perhitungan : M 1 x V 1 = M 2 x V 2 3 mg/ml x V 1 = 2 mg/ml x 20 ml V 1 = 13,3 ml Setelah itu dilakukan pengenceran dari 2 mg/ml menjadi 1 mg/ml dengan perhitungan : M 1 x V 1 = M 2 x V 2 2 mg/ml x V 1 = 1 mg/ml x 20 ml V 1 = 10 ml Setelah itu larutan standar protein tersebut dimasukkan kedalam tabung reaksi. Lalu ditambahkan 4 ml reagen biuret dan dikocok. Fungsi penambahan biuret pada larutan untuk menghasilkan warna ungu karena Cu 2+ membentuk kompleks dengan ikatan peptida suatu protein. Setelah itu diinkubasi pada suhu 41 o C selama 10 menit dan diinkubasi lagi pada suhu ruang selama 10 menit sampai warna ungu yang terbentuk stabil dan sempurna. Fungsi dilakukan inkubasi pada percobaan ini adalah terjadi penyesuaian larutan dan reaksi yang terjadi pada suhu tersebut. Lalu diukur absorbansi pada panjan gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV Vis. Dari pengukuran didapatkan : C (mg/ml) A 1 0,062 2 0,103 3 0,141 4 0,176 5 0,205 Berdasarkan absorbansi dari UV Vis diperoleh persamaan y = 0,0395 x + 0,02942 dengan nilai regresi R 2 = 0,99618. Sedangkan dari excel diperoleh persamaan y = 0,040 x + 0,014 dengan nilai regresi R² = 0,983.
Absorbansi Kurva Larutan Standar Protein 0.25 0.2 y = 0.0401x + 0.0141 R² = 0.9835 0.15 0.1 absorbansi Linear (absorbansi) 0.05 0 0 2 4 6 Konsentrasi Tahap kedua adalah penetapan absorbansi larutan blanko. Pada percobaan ini dilakukan seperti halnya pada pembuatan larutan standar. Tapi disini digunakan aquades sebagai pengganti larutan standar protein. Setelah itu ditambah 4 ml reagen biuret dan dikocok. Larutan menjadi biru jernih. Lalu diinkubasi Setelah itu diinkubasi pada suhu 41 o C selama 10 menit dan diinkubasi lagi pada suhu ruang selama 10 menit. Fungsi dilakukan inkubasi pada percobaan ini adalah terjadi penyesuaian larutan dan reaksi yang terjadi pada suhu tersebut. Lalu diukur absorbansi pada panjan gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV Vis. Diperoleh absorbansi 0,003. Tahap ketiga adalah penetapan absorbansi larutan sampel. Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui absorbansi larutan sampel dan membandingkannya dengan absorbansi yang diperoleh dari larutan standar untuk mengetahui konsentrasi sampel. Percobaan ini dilakukan seperti halnya pada pembuatan larutan standar dan penetapan absorbansi larutan blanko. sampel dimasukkan dalam tabung reaksi. Setelah itu diinkubasi pada suhu 41 o C selama 10 menit dan diinkubasi lagi pada suhu ruang selama 10 menit sampai warna ungu yang terbentuk stabil dan sempurna. Fungsi dilakukan inkubasi pada percobaan ini
adalah terjadi penyesuaian larutan dan reaksi yang terjadi pada suhu tersebut. Lalu diukur absorbansi pada panjan gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV Vis. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. Dan diperoleh : Sampel Absorbansi Sampel 1 0,053 Sampel 2 0,059 Sampel 3 0,054 Dari absorbansi yang diperoleh. Dapat diketahui konsentrasi sampel Diperoleh persamaan regresi linier : Sampel 1 y = 0,040x 0,014 ( misal y adalah absorbansi sampel) 0,053 = 0,040x 0,014 0,053 + 0,014 = 0,040x 0,067 = 0,040x x = 1,675 mg/ml ( x adalah konsentrasi sampel) Sampel 2 y = 0,040x 0,014 ( misal y adalah absorbansi sampel) 0,059 = 0,040x 0,014 0,059 + 0,014 = 0,040x 0,073 = 0,040x x = 1,825 mg/ml ( x adalah konsentrasi sampel) Sampel 3 y = 0,040x 0,014 ( misal y adalah absorbansi sampel) 0,054 = 0,040x 0,014 0,054 + 0,014 = 0,040x 0,068 = 0,040x x = 1,700 mg/ml ( x adalah konsentrasi sampel) Kemudian dirata-rata hasil konsentrasi (x) yaitu :
(1,675 mg/ml + 1,825 mg/ml + 1,700 mg/ml)/3 = (5,2mg/ml)/3 = 1,733 mg/ml Jadi rata-rata konsentrasi protein yang diperoleh adalah 1,733 mg/ml. PEMBAHASAN : Tahap pertama yaitu pembuatan larutan standar yang bertujuan untuk standarisasi larutan yang dianalisis yang digunakan untuk pembuatan kurva standar. Hal ini dilakukan dengan memasukkan 1 ml larutan standar protein dengan kadar 1mg, 2mg, 3mg, 4mg dan 5mg per ml protein melalui pengenceran bertahap dengan larutan induk standar yang digunakan yaitu 10mg/ml. Kami menduga bahwa larutan yang digunakan sebagai standar tersebut merupakan Bovine Serum Albumin (BSA) atau dalam dunia industri biasa disebut Probumin. Dalam bentuk padatan berwarna hijau muda dan jika dalam larutan berwarna kuning-jingga (diperoleh dari data MSDS)(Terlampir). BSA biasa digunakan dalam berbagai penelitian sebagai larutan protein standar yang telah kami buktikan dengan pembacaan berbagai Jurnal penelitian tentang uji kadar Protein dengan metode Biuret. Salah satunya adalah jurnal berjudul Protein Biji Kelor Sebagai Bahan Aktif Penjernihan Air. Tujuan pdilakukannya penelitian ini adalah untuk menunjukkan bahwa biji kelor bias digunakan sebagai bio-koagulan karena mengandung protein bermuatan positif yang dapat berperan sebagai kation polielektrolit dan penting dalam agen bio-koagulan. Dalam bagian metode penelitian bagian 2 yaitu untuk menentukan Konsentrasi Protein Biji Kelor, telah disampaikan bahwa disiapkan larutan stok BSA dengan melarutkan 10 mg BSA + 3 tetes NaOH 1 N, kemudian ditambah akuades sampai 10 ml. dalam penjelasan tersebut dapat dinyatakan bahwa larutan BSA bekerja dalam keadaan basa. Hal tersebut parallel dengan Reagen Biuret yang bekerja pada keadaan basa juga. Kemudian dilakukan pembacaan absorbansi pada larutan standar BSA, didapatkan hasil persmaan garis :
Dari hasil gaaris yang diperoleh tersebut kami sepakat untuk memberikan komentar yang bernada membangun yaitu : 1. R 2 =0,9205 yang dihasilkan tidak mematuhi standar Nasioanal yaitu kira-kira 0,997 2. Seharusnya pembuatan kurva standar BSA dilakukan mulai dari Konsentrasi=0, sedangkan data penelitian dibuat tidak melalui konsentrasi=0 melainkan langung dari konsentrasi 125 ppm Warna yang dihasilkan dari larutan standar berbagai konsentrasi tersebut mempunyai warna biru namun dengan kepekatan warna yang berbeda-beda. Warna biru tersebut terjadi dikarenakan terbentuknya suatu kompleks Cu dengan ikatan Peptida dari asam amino protein saat ditambahkan Reagen Biuret. Reagen Biuret sendiri dibuar dari : CuSO 4 memberikan kompleks berwarna KOH memberikan suasana basa (mengubah Cu 2+ Cu + ) KNaC 4 H 4 O 6 (Kalium Natrium Tartrat) untuk menstabilkan kompleks ion Cu 2+ Agar kompleks tersebut stabil, maka ditambahkanlah KNaC 4 H 4 O 6 (Kalium Natrium Tartrat). Dan juga ditambahkan KOH sebagai pemberi suasana basa. Suasana basa ini diharapkan dapat mengubah bilangan oksidasi (biloks) Cu (mengubah Cu 2+ Cu + ). Perubahan Cu 2+ menjadi Cu + adalah terjadinya transisi
elektronik dimana 1e lepas dari Cu 2+, untuk melepaskan electron dibutuhkan energy radiasi sebesar (hv) yang artinya terjadi proses absorbsi energy (hv) ke tingkat yang lebih tinggi. Energy yang diperoleh ini dapat diperoleh dari pemansan dengan tingkat dimana asam amino dalam protein tidak mengalami denaturasi. Setelah itu Cu + yang dibentuk dari Cu 2+ dapat mengalami proses emisi yang artinya melepaskan e dan energy radiasi sebesar (hv). Terjadinya emisi ini yang memunculkan panjang gelombang sesuai menuju keadaan dasarnya (steady state) asal mula terbentuknya warna pada larutan (contohnya : warna biru pada larutan yang ditambahakn reagen Biuret). Panjang gelombang ( ) maksimal 540 nm adalah Panjang gelombang Larutan ion Cu 2+ membentuk kompleks dengan ikatan peptida suatu protein sehingga menghsilkan warna ungu dengan absorbansi. Namun Untuk reagen biuret, dalam data MSDS dari CAROLINA yang kami dapatkan ada beberapa tambahan zat yang jumalahnya sangat kecil (dalam keadaan trace) namun juga mempengaruhi yaitu Kalium Iodida (KI) dan juga EDTA. Kami telah mencari fungsi keduanya dari berbagqi sumber dan ternyata keduanya berfungsi unutk memperkuat kompleks antara logam Cu dan Ikatan Peptida. Lebih spesifiknya KI untuk meghambat terjadinya proses oksidasi pada Cu dikarenakan tingakt oksidasi pada KI lebih besar dari Cu, sehingga yang teroksidasi dahulu adalah KI bukan Cu. Sementara itu EDTA digunakan untuk menyetabilkan ikatan dikarenakan memiliki pasangan electron yang banyak biasa disebut ligan polidentat. Sehingga keduanya saling menguatkan atau dengan kata lain menyetabilkan ikatan antara Cu dan peptide. Kemudian fungsi dilakukan inkubasi pada percobaan ini adalah terjadi penyesuaian larutan dan reaksi yang terjadi pada suhu tersebut. Yang lebih utamanya adalah untuk benar-benar memastikan bahwa terjadi ikatan Cu dan ikatan Peptida yang Mantap (stabil). Dengan reaksi sebagai berikut :
Dengan produl reaksi yang dihasilkan dapat diperkirakan bahwa Cu yang diharapkan adalah dalam bentuk Cu +. Dengan bentuk orbital box dengan system d9 maka didapatkan gambar sebagai berikut : Jika Menjadi ion Cu + maka akan kehilangan 1e, sehingga didapatkan 2 orbital box yang tidak berpasangan, nantinya orbital box tersebut akan berikatan dengan O yang masing-masing O akan menyumbangkan 1e. sehingga nantinya akan terbentuk senywa kompleks dengan ligannya adalah asam amino (ikatan Cu- O). Lalu diukur absorbansi pada panjan gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV Vis. Dari pengukuran didapatkan : C (mg/ml) A
Absorbansi 1 0,062 2 0,103 3 0,141 4 0,176 5 0,205 Berdasarkan absorbansi dari UV Vis diperoleh persamaan y = 0,0395 x + 0,02942 dengan nilai regresi R 2 = 0,99618. Sedangkan dari excel diperoleh persamaan y = 0,040 x + 0,014 dengan nilai regresi R² = 0,983. 0.25 Kurva Larutan Standar Protein 0.2 y = 0.0401x + 0.0141 R² = 0.9835 0.15 0.1 absorbansi Linear (absorbansi) 0.05 0 0 2 4 6 Konsentrasi Digunakan hasil dari perhitungan Excel diakrenakan pada hasil pembacaan Absorbansi pada Spektrofotometer UV-Vis tidak dimulai dari sumbu 0 (nol). Tahap kedua adalah penetapan absorbansi larutan blanko. Pada percobaan ini dilakukan seperti halnya pada pembuatan larutan standar. Tapi disini digunakan aquades sebagai pengganti larutan standar protein. Setelah itu ditambah 4 ml reagen biuret dan dikocok. Larutan menjadi biru jernih. Lalu diinkubasi Setelah itu diinkubasi pada suhu 41 o C selama 10 menit dan diinkubasi
lagi pada suhu ruang selama 10 menit. Fungsi dilakukan inkubasi pada percobaan ini seperti halnya pada Percobaan Tahap Pertama adalah agar terjadi penyesuaian larutan dan reaksi yang terjadi pada suhu tersebut. Lalu diukur absorbansi pada panjan gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV Vis. Diperoleh absorbansi 0,003. Tahap ketiga adalah penetapan absorbansi larutan sampel. Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui absorbansi larutan sampel dan membandingkannya dengan absorbansi yang diperoleh dari larutan standar untuk mengetahui konsentrasi sampel. Percobaan ini dilakukan seperti halnya pada pembuatan larutan standar dan penetapan absorbansi larutan blanko. sampel dimasukkan dalam tabung reaksi. Setelah itu diinkubasi pada suhu 41 o C selama 10 menit dan diinkubasi lagi pada suhu ruang selama 10 menit sampai warna ungu yang terbentuk stabil dan sempurna. Fungsi dilakukan inkubasi pada percobaan ini adalah terjadi penyesuaian larutan dan reaksi yang terjadi pada suhu tersebut. Lalu diukur absorbansi pada panjan gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV Vis. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. Dan diperoleh : Sampel Absorbansi Sampel 1 0,053 Sampel 2 0,059 Sampel 3 0,054 Dari absorbansi yang diperoleh. Dapat diketahui konsentrasi sampel Diperoleh persamaan regresi linier : Sampel 1 x = 1,675 mg/ml ( x adalah konsentrasi sampel) Sampel 2 x = 1,825 mg/ml ( x adalah konsentrasi sampel) Sampel 3 x = 1,700 mg/ml ( x adalah konsentrasi sampel) Kemudian dirata-rata hasil konsentrasi (x) yaitu :
(1,675 mg/ml + 1,825 mg/ml + 1,700 mg/ml)/3 = (5,2mg/ml)/3 = 1,733 mg/ml Jadi rata-rata konsentrasi protein yang diperoleh adalah 1,733 mg/ml. kami menduga bahwa sampel protein yang kami digunakan dalam prsktikum kami adalah sampel dari telur. Telur merupakan bahan pangan hasil ternak ungags yang memiliki sumber protein hewani yang memilki rasa lezat, mudah dicerna dan bergizi tinggi. King ori (2012) menjelaskan bahwa putih telur merupakan salah satu bagian sebuah telur utuh yang mempunyai persentase sekitar 58-60% dari berat telur itu dan mempunyai dua lapisan, yaitu lapisan kental dan lapisan encer. Pemansan pada telur dapat dilakukan dengan cara pasteurisasi. Pasteurisasi ini adalah suatu cara pemanasn dengan suhu dibawah 60 o selama kurang lebih 5 menit untuk menghambat pertumbuhan bakeri patogen pada telur. Jadi proses inkubasi pada percobaan ini selain pemantapan ikatan peptide dan Cu juga diharapkan sama dengan proses pasteutisasi untuk membunuh bakteri yang ada agar tidak mengganggu pembacaan absorbansi.
KESIMPULAN : 1. Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan penambahan biuret pada larutan untuk menghasilkan warna ungu karena Cu 2+ membentuk kompleks dengan ikatan peptida suatu protein. Dengan reaksi : 2. Berdasarkan absorbansi dari UV Vis diperoleh persamaan y = 0,0395 x + 0,02942 dengan nilai regresi R 2 = 0,99618. Sedangkan dari excel diperoleh persamaan y = 0,040 x + 0,014 dengan nilai regresi R² = 0,983. Dengan menggunakan Data Persamaan garis dari Excel dan Metode Biuret didapatkan konsentrasi protein rata-rata = 1,733 mg/ml
Absorbansi JAWABAN PERTANYAAN : 1. Buatlah kurva standar konsentrasi vs absorbansi. Dengan bantuan kurva standar tersebut tentukan kadar protein sampel! Kurva Larutan Standar Protein 0.25 0.2 y = 0.0401x + 0.0141 R² = 0.9835 0.15 0.1 absorbansi Linear (absorbansi) 0.05 0 0 2 4 6 Konsentrasi Perhitungan : Diperoleh persamaan regresi linier : Sampel 1 y = 0,040x 0,014 ( misal y adalah absorbansi sampel) 0,053 = 0,040x 0,014 0,053 + 0,014 = 0,040x 0,067 = 0,040x x = 1,675 mg/ml ( x adalah konsentrasi sampel) Sampel 2 y = 0,040x 0,014 ( misal y adalah absorbansi sampel)
0,059 = 0,040x 0,014 0,059 + 0,014 = 0,040x 0,073 = 0,040x x = 1,825 mg/ml ( x adalah konsentrasi sampel) Sampel 3 y = 0,040x 0,014 ( misal y adalah absorbansi sampel) 0,054 = 0,040x 0,014 0,054 + 0,014 = 0,040x 0,068 = 0,040x x = 1,700 mg/ml ( x adalah konsentrasi sampel) Kemudian dirata-rata hasil konsentrasi (x) yaitu : (1,675 mg/ml + 1,825 mg/ml + 1,700 mg/ml)/3 = (5,2mg/ml)/3 = 1,733 mg/ml 2. Apakah peptida akan memberikan reaksi positif terhadap reaksi biuret? jika benar demikian, bagaimana menentukan kadar protein yang tercampur dengan peptida? Ya, karena Biuret merupakan salah satu cara yang terbaik untuk menentukan kadar protein suatu larutan. Dalam larutan basa, Cu 2+ akan membentuk kompleks dengan ikatan peptida suatu protein, sehingga menghasilkan warna ungu yang dapat diidentifikasi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm. Absorbansi ini berbanding langsung dengan kosentrasi protein dan tidak tergantung jenis protein karena seluruh protein pada dasarnya mempunyai jumlah ikatan peptida yang sama persatuan berat. DAFTAR PUSTAKA : Anna Poedjiadi, 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Penerbit UI-Press: Jakarta. Lehninger AL. 1982. Dasar Dasar BiokimiaJilid I. Maggy Thenawijaya, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry. TIM Dosen. 2013. Perangkat Pembelajaran Biokimia Petunjuk Praktikum (Karbohidrat, Lipid, Protein). Surabaya: Unesa Press.
LAMPIRAN Bahan Larutan standar Larutan sampel dan blanko
Jurnal Yang Digunakan