LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA Penentuan Kadar Glukosa Darah Oleh : Kelompok 4 - Offering C Desy Ratna Sugiarti (130331614749) Rita Nurdiana (130331614740)* Sikya Hiswara (130331614743) Yuslim Nasru S. (130331614748) UNIVERSITAS NEGERI MALANG FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM JURUSAN KIMIA FEBRUARI 2016
A. Tujuan Percobaan Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa diharapkan : 1) Mampu menentukan kadar glukosa didalam darah 2) Mampu memahami prinsip pemisahan glukosa dari komponen darah yang lain, khususnya protein B. Dasar Teori Glukosa merupakan senyawa penting bagi tubuh yang berfungsi sebai sumber energi. Hal ini karena glukosa merupakan molekul utama penghasil ATP yang akan digunakan untuk menjalankan fungsi secara fisiologi. Glukosa diangkut ke seluruh bagian tubuh melalui aliran darah tanpa melalui proses pencernaan. Kadar glukosa normal dalam darah adalah 80-100 mg per 100 ml darah. Glukosa(C 6 H 12 O 6 berat molekul 180.18) adalah heksosa monosakarida yang mengandung enam atom karbon. Glukosa merupakan aldehida (mengandung gugus - CHO). Lima karbon dan satu oksigennya membentuk cincin yang disebut "cincin piranosa", bentuk paling stabil untuk aldosa berkabon enam. Dalam cincin ini, tiap karbon terikat pada gugus samping hidroksil dan hidrogen kecuali atom kelimanya, yang terikat pada atom karbon keenam di luar cincin, membentuk suatu gugus CH 2 OH. Struktur cincin ini berada dalam kesetimbangan dengan bentuk yang lebih reaktif, yang proporsinya 0.0026% pada ph 7. (a) (b) (a) Bentuk rantai D- Glukosa (b) Gambaran proyeksi Haworth struktur glukosa (α-d-glukopiranosa) Glukosa merupakan sumber tenaga yang terdapat di mana-mana dalam biologi. Kita dapat menduga alasan mengapa glukosa, dan bukan monosakarida lain seperti fruktosa, begitu banyak digunakan. Glukosa dapat dibentuk dari formaldehida pada keadaan abiotik, sehingga akan mudah tersedia bagi sistem biokimia primitif. Hal yang lebih penting bagi organisme tingkat atas adalah kecenderungan glukosa, dibandingkan dengan gula heksosa lainnya, yang tidak mudah bereaksi secara nonspesifik dengan gugus amino suatu protein. Reaksi ini mereduksi atau bahkan merusak fungsi berbagai enzim. Rendahnya laju
glikosilasi ini dikarenakan glukosa yang kebanyakan berada dalam isomer siklik yang kurang reaktif. Meski begitu, komplikasi akut seperti diabetes, kebutaan, gagal ginjal, dan kerusakan saraf periferal ( peripheral neuropathy ), kemungkinan disebabkan oleh glikosilasi protein. Darah terdiri atas sel darah merah, sel darah putih, dan plasma darah. Protein dan glukosa merupakan komponen utama yang terlarut dalam plasma darah. Untuk menentukan kadar glukosa dalam sampel darah maka protein harus dipisahkan dengan cara diendapkan agar tidak mengganggu analisa darah. Selanjutnya filtrat yang diperoleh dipanaskan dalam larutan Cu 2+ dalam suasana basa. Glukosa memiliki gugus aldehid bebas yang dalam larutan berada dalam keadaan setimbang dengan bentuk enediol. Pada suasana basa bentuk enediol dominan dan mereduksi ion kupri (Cu 2+ ). Cu 2 O yang terbentuk kemudian direaksikan dengan asam fosfomolibdat akan membentuk warna biru. Adsorbansi diukur pada panjang gelombang 540 nm. Konsentrasi glukosa dapat ditentukan melalui kurva standar glukosa. Pada praktikum ini, penentuan kadar glukosa darah menggunakan metode spektofotometri. Spektrofotometri merupakan metode analisis yang didasarkan pada absorpsi radiasi elektromagnet. Cahaya terdiri dari radiasi gelombang dengan panjang berlainan akan menimbulkan cahaya yang berlainan sedangkan campuran cahaya dengan panjang-panjang ini akan menyusun cahaya putih. Cahaya putih meliputi seluruh spektrum nampak yaitu terdapat pada 400-760 mm. Spektrofotometer ini hanya terjadi bila adanya perpindahan elektron dari tingkat energi yang rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi. Perpindahan elektron tidak diikuti oleh perubahan arah spin, hal ini dikenal dengan sebutan tereksitasi singlet. Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan Hukum Lambert- Beer, bila cahaya monokromatik melalui suatu media, maka sebagian cahaya disebut diserap, sebagian dipantulkan, dan sebagian diteruskan (Sabrina 2012) C. Alat dan Bahan 1) Alat - Tabung reaksi - Sentrifuga - Spektofotometer sinar tampak 2) Bahan - Larutan Ba(OH) 2 0,3 N - Larutan ZnSO 4.7H 2 O 5 % - Larutan standar glukosa 0,1 mg/ml - Pereaksi warna arsenomolibdat - Larutan Nelson A - Larutan Nelson B - Pereaksi Nelson
D. Analisis Prosedur No. Prosedur Percobaan Analisis Prosedur 1. Pembuatan filtrat darah bebas protein Hal ini dikarenakan protein memiliki gugus fenolik yang dapat teroksidasi menghasilkan warna yang sama dengan glukosa apabila direaksikan dengan arsenomolibdat sehingga nanti akan menganggu pembacaan adsorbansi spektofotometer. 2. Darah yang digunakan, terlebih dahulu diberikan natrium oksalat 3. Darah oxalated dimasukkan dalam tabung sentrifuga yang telah diisi 1,5 ml aquades 4. Ditambahkan 1,5 ml Ba(OH) 2 0,3 N, diaduk 5. Ditambahkan 1,5 ml ZnSO 4 5%, diaduk 6. Dibiarkan 3 menit, kemudian disentrifuga selama 20 menit 7. Sentrat yang diperoleh ditambahkan pereaksi Nelson 8. Diinkubasi dalam penangas air mendidih selama 20 menit 9. Didinginkan hingga suhu kamar 10. Ditambahkan 1 ml pereaksi arsenomolibdat, diaduk 11. Dibaca adsorbansi dengan spektofotometer pada λ = 540 nm. 12 Dibuat larutan glukosa standart dengan konsentrasi 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 Kemudian ditentukan serapan larutan blanko dan standar glukosa dengan cara yang sama. Didalam darah terdapat ion Ca 2+ yang dapat membentuk benang-benang fibrin yang menyebabkan darah membeku, oleh karena itu ditambahkan natrium oksalat agar Ca 2+ bereaksi dengan oksalat sehingga darah tidak membeku. Untuk melarutkan albumin darah dan untuk mengencerkan darah. untuk memberi suasana basa. mengendapkan kelebihan oksalat. membantu mereduksi ion Cu 2+ pada penentuan kadar glukosa. untuk mengendapkan ion-ion besi yang terdapat didalam darah. Untuk mengendapkan dan mendenaturasi protein secara sempurna, selain itu juga sebagai katalis dalam mempercepat reaksi pengendapan albumin oleh Ba(OH) 2. untuk memisahkan protein dengan glukosa, protein akan terletak di lapisan bawah karena memiliki berat jenis yang lebih besar dari glukosa. Sehingga diperoleh sentrat yang tidak bewarna. Pereaksi Nelson bertidak sebagai oksidator pada reaksi reduksi ion kupri oleh gula pereduksi menjadi kuprooksida yang membentuk endapan merah bata. Untuk mempercepat reaksi reduksi Cu 2+ menjadi Cu +. Supaya reksi berjalan stabil, karena apabila terlalu panas kemungkinan senyawa rusak Untuk melarutkan kuprooksida, dan oksidasi Mo Karena pada λ ini, molekul gula reduksi dapat menyerap sinar secara optimum, sehingga pembacaan adsorbansi berjalan dengan baik. Untuk menentukan kadar glukosa darah
E. Data Pengamatan Prosedur Percobaan Sebelum reaksi Sesudah reaksi 1. Pembuatan filtrat darah bebas protein 0,5 ml darah oxalated Dimasukkan dalam tabung sentrifuga yang telah diisi 1,5 ml air, dikocok. Ditambahkan 1,5 ml Ba(OH) 2 0,3 N, diaduk Ditambahkan 1,5 ml ZnSO 4 5%, diaduk Dibiarkan 3 menit, kemudian disentrifuga selama 20 menit hasil Warna darah merah Ba(OH) 2 = larutan tidak bewarna ZnSO 4 = larutan tidak bewarna Warna larutan merah Warna larutan merah kecoklatan Warna larutan coklat muda Filtrat = tidak bewarna, endapan bewarna coklat muda 2. Penentuan adsorbansi larutan blanko, standar protein, dan sampel No. tabung 1 2 3 4 5 6 7 Konsentrasi (mg/ml) Gula standart (0,1 mg/ml) 0,00 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 H 2 O (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Pereaksi nelson (1 ml) Inkubasi air mendidih 20 menit dan dikocok Pereaksi arsenomolibdat (1 ml) Biru Biru Biru Biru Biru Biru Biru Biru + Tidak berwarna bata + bata ++ bata +++ Biru ++ Biru + Biru +++ bata +++ Biru +++ bata ++++ H 2 O - - - - - - - Biru +++ Hijau Biru ++ A 540nm 0 0,416 0,399 0,552 0,533 0,491 0,305
F. Pembahasan Pada praktikum kali ini dilakukan uji penentuan kadar glukosa darah. Darah yang digunakan dalam percobaan ini adalah darah ayam. Percobaan penentuan kadar glukosa darah ini didasarkan pada hasil reduksi ion Cu 2+ oleh glukosa dalam suasana basa dengan reagen arsenomolibdat yang memberikan warna biru. Reaksi ini dilakukan dalam suasana basa karena reaksi reduksi dapat berjalan dengan baik dalam suasana basa. Proses yang terjadi pada metode ini yaitu oksidasi glukosa menjadi asam glukonat dan reduksi ion Cu 2+ menjadi ion Cu +. Selanjutnya diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm dengan menggunakan spektrofotometer. Pada penentuan kadar glukosa darah ini diawali dengan membuat filtrat darah bebas protein kemudian penentuan kadar glukosa darah. Pada penentuan filtrat darah bebas protein, mula-mula dimasukkan 0,5 ml darah yang telah ditambahkan natrium oksalat kedalam tabung sentrifuga yang telah diisi dengan 1,5 ml H 2 O. Penambahan natrium oksalat berfungsi agar darah tidak terjadi pembekuan. Darah mengandung ion Ca 2+ yang dapat membentuk benang-benang fibrin yang menyebabkan darah membeku jika tidak ditambahkan dengan natrium oksalat. Penambahan H 2 O berfungsi untuk melarutkan albumin darah dan untuk mengencerkan darah. Kemudian ditambahkan larutan Ba(OH) 2 0,3 N, warna larutan darah yang semula bewarna merah menjadi bewarna merah kecoklatan. Ba(OH) 2 berfungsi memberi suasana basa dan untuk mengendapkan kelebihan oksalat, setelah itu ditambahkan dengan ZnSO 4 yang berfungsi untuk mendenaturasi protein. Hasil pengamatan menunjukkan warna larutan menjadi coklat muda. Sesuai dengan persamaan reaksi berikut : Ba(OH) 2 (aq) + ZnSO 4 (aq) Zn(OH) 2 (s) + BaSO 4 (s) Larutan Zn(OH) 2 berfungsi bersifat seperti koloid yang menyebabkan protein dapat terkoagulasi. Kemudian dibiarkan 3 menit agar endapan yang terbentuk sempurna, kemudian dilanjutkan dengan sentrifugasi larutan selama 20 menit. Sentrifugasi larutan ini bertujuan untuk memisahkan protein dengan glukosa. Protein akan terletak pada lapisan bawah karena memilik massa jenis yang lebih besar daripada glukosa yang ditunjukkan dengan terbentuknya endapan coklat dan sentrat menjadi tidak bewarna. Sentrat yang diperoleh dianalisis lebih lanjut dengan standar glukosa dan larutan blanko. Sentrat darah bebas protein yang diperoleh dimasukkan dalam tabung reaksi sebanyak 1 ml. Kemudian ditambahkan pereaksi Nelson. Pereaksi Nelson merupakan campuran 25 bagian Nelson A dengan 1 bagian Nelson B yang diaduk hingga homogen. Pereaksi Nelson ini berfungsi sebagai oksidator pada reaksi reduksi ion kupri oleh gula pereduksi menjadi kuprooksida yang dapat membentuk endapan merah bata.
konsentrasi Setelah itu diinkubasi dalam air mendidih selama 20 menit. Hal ini bertujuan untuk mempercepat laju reaksi reduksi Cu 2+ menjadi Cu +. Hasil pengamatan menunjukkan larutan menjadi bewarna hijau. Setelah itu ditambahkan pereaksi bewarna arsenoolibdat yang berfungsi untuk melarutkan kuprooksida, dan untuk mengoksidasi Mo, sehingga dihasilkan warna biru. Penambahan reaksi warna ini pada prinsipnya agar dapat dibaca adsorbansinya dalam spektofotometer, karena spektofotometer ini menggunakan cahaya tampak. Dari hasil pembacaan pada spektofotometer, diperoleh adsorbansi sentrat bebas protein sebesar 0,305. Untuk menentukan kadar glukosa dalam darah diperlukan adsorbansi kelima standar glukosa dengan konsentrasi 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 dan 1 dan larutan blanko. Penentuan adsorbansi standar glukosa dan larutan blanko seperti pada penentuan adsorbansi sentrat darah bebas protein. Langkah-langkah dalam Penentuan adsorbansi kelima standar glukosa, larutan blanko dan sentrat darah bebas protein ini dilakukan dalam waktu yang bersamaan. Hasil pengamatan diperoleh adsorbansi standar glukosa sebesar 0,416; 0,339; 0,552; 0,533; 0,491. Kemudian dibuat kurva dengan konsentrasi diperoleh: 1,2 Y-Values 1 0,8 y = 1,4705x - 0,0027 R² = 0,8453 0,6 0,4 0,2 Y-Values Linear (Y-Values) 0-0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6-0,2 adsorbansi y = 1,4705x - 0,0027 R² = 0,8453 sehingga kadar glukosa dalam sampel dapat dihitung: y = 1,4705x 0,0027 y = 1,4705 (0,305) 0,0027 y = 0,446 mg/ml
Keterangan: x = absorbansi sampel = 0,305 y = konsentrasi sampel = 0,446 mg/ml Pada kurva diatas dihilangkan 1 data pada standar glukosa yang kedua karena diperoleh data adsorbansi yang kurang baik. Seharusnya data adsorbansi meningkat seiring dengan kenaikan konsentrasi gula standar. Kesalahan ini mungkin disebakan ketika penambahan reaksi arsenomolibdat praktikan kurang teliti dalam mengamati miniskus pada buret. Dari analisis data pada kurva diatas diperoleh kadar glukosa darah pada ayam adalah 0,446 mg/ml. G. Kesimpulan 1) Prinsip pemisahan glukosa dari protein dengan cara penambahan pereaksi Ba(OH) 2 dan ZnSO 4 dimana protein akan terdenaturasi dan mengendap sehingga diperoleh filtrat darah bebas protein. 2) Penentuan kadar glukosa dalam darah dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri dengan panjang gelombang 540 nm 3) Kadar sampel filtrat darah bebas protein dihasilkan sebesar 0,446 mg/ml dengan nilai absorbasi sampel tersebut adalah 0.305. H. Daftar Pustaka Randi. 2010. Penentuan kadar glukosa dalam darah. Online. http://stationofwords.blogspot.co.id/2012/01/penentuan-kadar-glukosa-dalam-darah.html. diakses pada 25 february 2016 Riska. 2014. Pembentukan kadar glukosa dalam darah. Online. http://www.academia.edu/9702589/laporan_biokimia_pembentukan_kadar_glukosa_dal am_darah. diakses pada 25 february 2016