2.3. Enzim Restriksi
Copyright Statement: Dengan ini dinyatakan, bahwa seluruh material (teks, gambar, grafik dan seluruh alat bantu penjelas lainnya) bahan kuliah dalam format.ppt sebagaimana tercantum disini memiliki hak eksklusif intelektual bagi penyusun. Penggunaan diluar untuk keperluan pembelajaran sebagaimana disepakati dalam pemberian material harus mendapatkan izin tertulis dari penyusun dan pelanggaran dalam hal ini akan dikenakan sanksi hukum sebagaimana berlaku di Negara Kesatuan Republik Indonesia.
2.2. Enzim Restriksi Pengamatan terhadap bakteri yang mampu menghalangi pertumbuhan bakteriophage, disebut nuklease, memotong = restriksi, internal = endonuklease Aktifitas: Memutuskan ikatan rantai phospodiester pada ujung 5 rantai DNA
3 Macam golongan, restriksi endonuklease type I, II dan III Type I dan III melakukan proses metilasi dan restriksi pada DNA yang sama Type II proses metilasi dan restriksi pada DNA yang berbeda Dalam keperluan rekayasa genetika enzym restriksi type II banyak digunakan Memotong DNA menurut urutan sisi pengenalan (recognition site), bedakan dengan cutting site (titik pemotongan) Jenisnya bermacam-macam: dari mulai 4-8 (tetra nukleotide-oktanukleotide) Contoh: 4: AfaI ; GT AC ; 37 C ; Rhodopseudomonas sphaeroides; 65 C-15 menit 6: Eco RI; G AATTC; 37 C; Escherichia coli H709C; 60 C-15 menit 8; Not I; GC GGCCGC; 37 C; Nocardia otitidis-caviarum; ekstraksi phenol
Tabel beberapa contoh enzim, sisi pengenalan, suhu inkubasi dan suhu inaktivasi Enzim Sisi Pengenalan Suhu inkubasi Organisme asal Suhu inaktifasi Aat II GACGT C 37 C Acetobacter aceti IFO3281 65 C; 20 Afa I GT AC 37 C Rhodopseudomonas sphaeroides 65 C; 15 Alu I AG CT 37 C Arthrobacter luteus 60 C; 15 Apa I GGGCC C 37 C Acetobacter pasteurianus sub. 60 C; 15 pasteurianus BamHI G GATCC 30 C Bacillus amyloliquifaciens H. 60 C; 15 Bgl I GCCNNNN NGGC 37 C Bacillus globigi 65 C; 15 Bgl II A GATCT 37 C Bacillus globigi 70 C; 15 Eco RI G AATTC 37 C Escherichia coli H709C 60 C; 15 Eco RV GAT ATC 37 C Escherichia coli 70 C; 15 Hae III GG CC 37 C Haemophilus aegyptus 70 C; 15 Hind III A AGCTT 37 C Haemophilus influenzae Rd 70 C; 15 Hpa I GTT AAC 37 C Haemophilus parainfluenzae 60 C; 15 Mbo I GATC 37 C Moraxella bovis 70 C; 15 Nco I C CATGG 37 C Nocardia corallina 70 C; 15 Not I GC GGCCGC 37 C Nocardia otitidis-caviarum Ekst. phenol Pst I CTGCA G 37 C Escherichia coli ED8654 yang 60 C; 15 membawa gene Pst I Sau3A I GATC 37 C Staphylococcus aureus 3A 70 C; 15 Taq I T CGA 65 C Thermus aquaticus Tidak ada Xba I T CTAGA 37 C Xanthomonas badrii 60 C; 15 Xho I C TCGAG 37 C Xanthomonas holcicola Presipitasi ethanol
Contoh titik potong enzim restriksi endonuklease C T G A T G A A T T C C G T G A C T A C T T A A G G C A EcoRI A Ujung kohesif Cohesive end C T G A T G G A C T A C T T A A A A T T C C G T G G C A G A T G A T G A A T T C C G T C T A C T A C T T A A G G C A MseI B Ujung tumpul Blunt end G A T GA T G A A C T A C T A C T T T T C C G T A A G G C A
Analogi Pemotongan Enzim Restriksi Enzim A Enzim B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 20,0 A B AB 11,5 11,0 10,0 7,0 3,0 2,5 1,0 7,0 4,5 3,0 2,5 1,0
Contoh dalam praktek hasil restriksi DNA M V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M 12 kb 6 kb 3 kb 2 kb 1,6 kb DNA BAC dipotong dengan EcoRI dan HindIII, sumber Jamsari
Frekuensi pemotongan = 4 n 4 = jumlah total macam basa nitrogen (CGAT) N = jumlah sisi pengenal spesifik Contoh : EcoRI, hexanukleotid, maka enzim tersebut memotong DNA setiap: 4 6 basa = 4096 Maka apabila panjang DNA = 10 kb = 10.000 bp, akan terpotong menjadi sekitar 2 atau 3 fragmen jika dipotong dengan EcoRI, Jika dipotong dengan MseI akan menghasilkan 38-40 fragment
Transfer Asam Nukleat Southern Transfer (DNA) Northern Transfer (RNA) Western Transfer (Protein)
Transfer Asam Nukleat Southern Transfer (DNA) diperkenalkan oleh Edward Southern (1977) Pemberat Tumpukan kertas penghisap Membran selulosa Gel tempat DNA Bahan penghisap larutan alkali Bak berisi larutan alkali
Hibridisasi Asam Nukleat Hibridisasi : Penyatuan molekul DNA asing dengan sekuens DNA (probe) yang sudah diketahui identitasnya Syarat : ada homologi antara molekul DNA asing dengan probe yang kita miliki (70-100%) Sumber Probe: 1. Pustaka DNA genomik anonym yang dipilih. 2. Pustaka cdna 3. DNA yang dihasilkan dari luar inti sel (sitoplasma)
Hibridisasi Asam Nukleat Langkah-langkah Proses Hibridisasi Hibridisasi dengan Probe Restriksi Agarose gel Nylon membran Röntgen Film
Hibridisasi Asam Nukleat Gambar hasil autoradiogram jumlah kopi ujung Klon BAC yang dihibridisasi dengan DNA genomik tanaman asparagus, Sumber, Jamsari
Selesai