PENETAPAN KADAR TEOFILIN DALAM SEDIAAN TABLET EUPHYLLIN DENGAN METODE HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY DISUSUN OLEH 1. Hendrik 2. Nadia Ghaisani 3. ShibghatunNi mah 4. Asyrof Syahiroh 5. Defrinda Ayu Saputri 6. Yusrina Hidayati 7. Mukfi Rahman Wibowo Laboratorium Kimia Farmasi Program Studi Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Islam Indonesia Yogyakarta 2013
A. Tujuan 1. Dapat menjelaskan prinsip dasar pemisahan senyawa sencara High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC) dan aplikasinya. 2. Dapat menjelaskan alasan pemilihan metode HPLC untuk analisis teofilin. 3. Dapat melakukanan alisis teofilin dalam sediaan tablet euphyllins ecara kualitatif dan kuantitatif dengan metode HPLC. 4. Dapat melakukan validasi metode analisis. B. Latar Belakang Asma merupakan seuatu keadaan dimana saluran napas mengalami peradangan dan penyempitan yang bersifat sementara. Hal ini terjadi karena saluran napas tersebut sangat sensitif terhadap faktor khusus yang menyebabkan jalan udara menyempit sehingga aliran udara berkurang dan mengakibatkan sesak napas. Terdapat beberapa obat yang dapat digunakan untuk pengobatan asma, salah satu diantaranya yang biasa digunakan adalah Teofilin. Berdasarkan mekanisme kerjanya teofilin termasuk dalam golongan Bronchodilator yaitu obat yang bekerja dengan merangsang sistem adrenergik sehingga memberi efek bronkodilatasi. Teofilin merupakan salah satu contoh derivat xantin yang bekerja berdasarkan penghambatan enzim fosfodiesterase dan meningkatkan kadar camp selular. Obat ini sering digunakan dalam pengobatan asma akut dan kronis. Salah satu contoh sediaannya adalah tablet Euphyllin dengan kekuatan sediaan tertentu. Obat ini memiliki indeks range teraapeutik yang sempit sehingga perlu dimonitoring penggunaan dan dianalisis kadarnya dalam sediaan tablet. Salah satu metode yang dapat digunakan untuk analisis kadar teofilin adalah High Performance Liquid Chromatography (HPLC). HPLC merupakan metode pemisahan senyawa dalam suatu sampel dalam jumlah besar maupun kecil untuk keperluan analisis kualitatif dan kuantitatif. Metode ini merupakan metode yang baik untuk analisis senyawa campuran seperti tablet Eufilin dan bersifat tidak destruktif. Kelebihannya metode ini dapat digunakan untuk analisis berbagai macam senyawa, seperti senyawa organik maupun anorganik, senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities), senyawa non volatile, molekul netral, ion, isolasi dan pemurnian senyawa, dan pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur yang hampir sama. Selain HPLC, metode lain yang dapat digunakan untuk analisis teofilin ini diantaranya adalah Gas Chromatography (GC). Namun kelemahan dari GC adalah tidak dapat menganalisis senyawa non volatile, sehingga dalam percobaan kali ini digunakan metode HPLC.
C. Dasar Teori Teofilin (1,3-dimetilxantin) adalah senyawa alkaloid turunan xantin dan termasuk ke dalam kelompok purin. Teofilin telah lama digunakan untuk mengobati penyakit asma yang bekerja dengan cara merelaksasi otot polos serta menstimulasi sistem syaraf pusat dan otot jantung (Young 2003). Teofilin masih banyak digunakan di Indonesia, sedangkan di Inggris jarang digunakan karena mempunyai efek samping yang lebih besar dibandingkan dengan obat-obat inhalasi lainnya. Struktur teofilin Teofilin dapat ditemukan pada tumbuhan seperti teh, tetapi teofilin yang digunakan untuk pengobatan umumnya disintesis dalam skala industri. Ciri fisik teofilin adalah berbentuk serbuk, berwarna putih, tidak berbau, rasanya pahit, dan stabil di udara. Teofilin sukar larut dalam air, mudah larut dalam air panas, larutan alkali hidroksida, dan amonium hidroksida, serta agak sukar larut dalam etanol, kloroform, dan eter (USP 2003). Kelarutan dari teofilin yaitu larut dalam air, mudah larut dalam air panas, larut dalam etanol (95%), mudah larut dalam larutan alkali hidroksida dan dalam ammonia encer. Metode yang umum digunakan untuk analisis kuantitatif teofilin adalah metode High Performance liquid Chromatography (HPLC) (USP 2003). HPLC di gunakan untuk pemisahan sejumlah senyawa organic, anorganik maupun senyawa biologis, analisis ketidak murnian, analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap, penentuan molekul-molekul netral, ionic maupun zwitter ion, isolasi dan pemurnian senyawa. HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kuantitatif maupun kualitatif (Gandjar 2007). Teofilin ditetapkan menggunakan metode HPLC karena HPLC memiliki beberapa keuntungan diantaranya pemasukan sampel yang tepat dan mudah dikendalikan, menjamin presisi kuantitatif dan memiliki beragam kolom dan detektor yang berarti selektifitas metode
dapat disesuaikan dengan mudah. Namun, ada beberapa keterbatasan HPLC diantaranya obat-obat harus di ekstraksi dari formulasinya sebelum dianalisis dan masih membutuhkan detektor yang terandalkan dan tidak mahal yang dapat memantau senyawa yang tidak memiliki kromofor (Watson, 2009). prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut : dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solut terhadap fasa diam. HPLC merupakan teknik pemisahan komponen dari komponen lainnya yang terdistribusi ke dalam dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak di dalam suatu kolom yang diisi pengadsorpsi padat. Berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak, maka dikenal system HPLC fase normal dan fase terbalik. Peralatan HPLC mempunyai 4 bagian penting yaitu reservoir yang berisi fase gerak, sistem injeksi, kolom, dan detektor. Umumnya industri farmasi menggunakan HPLC untuk menganalisis senyawa obat yang mempunyai sifat tidak mudah menguap dan tidak stabil terhadap panas (USP 2003). Dalam suatu percobaan perlu dilakukan validasi metode. Validasi metode merupakan suatu proses pembuktian terhadap suatu metode analisis tentang dapat atau tidaknya metode tersebut diterima untuk tujuan yang diharapkan (Green 1996). Metode baru yang dikembangkan untuk suatu permasalahan perlu divalidasi untuk mengevaluasi karakteristik unjuk kerja metode tersebut. Dengan metode yang telah tervalidasi maka akan dihasilkan data yang valid. ada beberapa parameter metode validasi yang digunakan yaitu : Presisi Presisi adalah suatu prosedur analisis menunjukkan ukuran kedekatan nilai sederet pengukuran dari beberapa contoh yang sama pada kondisi yang telah ditentukan (Chan et al. 2004). Presisi dibedakan menjadi kedapatulangan (repeatability), presisi antara (intermediate precision), dan ketertiruan (reproducibility) (Chan et al. 2004). Kedapatulangan adalah pengukuran presisi dengan metode, peralatan, laboratorium, dan analis yang sama serta dalam rentang waktu yang pendek. Presisi antara adalah pengukuran presisi yang dilakukan di suatu laboratorium pada hari dan peralatan yang berbeda serta dilakukan oleh analis yang berbeda. Ketertiruan adalah pengukuran presisi dengan peralatan, analis, dan laboratorium yang berbeda namun dengan metode yang sama. Hasil uji presisi dilaporkan sebagai simpangan
baku (SB), persen simpangan baku relatif (%SBR), dan interval data. Kriteria %SBR menurut AOAC (1993) adalah sebagai berikut: o Sangat teliti : %SBR < 1 o Teliti : %SBR = 1-2 o Sedang : %SBR = 2-5 o Tidak teliti : %SBR > 5 Akurasi Akurasi prosedur analisis menunjukkan kedekatan nilai yang sebenarnya dan nilai yang terukur. Ada beberapa cara untuk menentukan akurasi, yaitu menganalisis contoh yang telah diketahui konsentrasinya kemudian membandingkan nilai yang terukur dengan nilai yang sebenarnya (Green 1996). Akurasi umumnya dilaporkan sebagai recovery (perolehan kembali) yang diterima pada selang 80-110% (AOAC 1993). Linearitas Linearitas merupakan suatu prosedur analisis, kemampuan suatu metode analisis untuk memberikan hasil yang sebanding dengan konsentrasi (jumlah analat). Linearitas dapat dikatakan baik apabila nilai koefisien korelasi (r) 0.9995 (AOAC 1993). Apabila suatu kisaran konsentrasi memberikan linearitas yang baik maka kisaran konsentrasi tersebut berarti telah memenuhi hukum Lambert-Beer. Konsentrasi contoh yang akan dianalisis untuk akurasi harus di dalam kisaran konsentrasi yang memiliki linearitas yang baik, sedangkan apabila suatu kisaran konsentrasi memberikan hasil yang tidak linier, maka kisaran konsentrasi harus direduksi sehingga menghasilkan kisaran konsentrasi yang memberikan linearitas yang baik (Chan et al. 2004). Limit deteksi dan limit kuantisasi Limit deteksi adalah konsentrasi terendah dari analat yang menghasilkan respons yang dapat terdeteksi di atas noise, umumnya tiga kali dari noise, sedangkan limit kuantisasi adalah konsentrasi terendah dari analat yang dapat diukur dengan tepat dan akurat (Green 1996). D. Metode Percobaan 1. Alat dan Bahan - Alat Gelas Arloji Gelas beker Labu takar 1000 ml
Labu takar 50 ml Labu takar 10 ml Pipet tetes Pipet volume 10 ml, 5 ml. Syringe + penyaring - Bahan Asam asetat glacial Asetonitril P Aqubides Natrium asetat P Sampel tablet Euphyllin Standar Teofilin 2. Cara Kerja Kondisi HPLC yang diperlukan adalah flow rate 1.0 ml/menit, Kolom ODS Hypersil 5 µm, fase gerak isokratik Asetonitril : Buffer asetat (7 : 93), detector UV 270 nm, suhukolom 50 o C, volume injeksi 5µL. Dalam pembuatan fase gerak, pertama-tama dibuat larutan dapar dengan cara ditimbang 1,36 g natrium asetat, kemudian dilarutkan dengan aquabidestilata secukupnya. Di masukkan kedalam labu ukur 1000 ml. Setelah itu ditambahkan 5 ml asam asetat glacial, dan di ad dengan aquabidestilata sampai tanda batas. Setelah dibuat larutan dapar, dimasukkan 70 ml asetonitril P kedalam labu ukur 1000 ml, kemudian diencerkan dengan larutan dapar yang telah dibuat sampai tanda batas. Larutan sebagai fase gerak tersebut kemudian di ultasonifikasi selama 10 menit. Dalam pembuatan larutan baku, ditimbang 10 mg teofilin standar dan di masukkan kedalam labu ukur 10 ml kemudian diad dengan fase gerak sampai tanda batas. Setelah itu, diambil 5 ml larutan teofilin tersebut dan dimasukkan kedalam labu ukur 50 ml, ad sampai tanda batas dengan fase gerak (larutan 100 ppm). Kemudian dibuat seri kadar 20 ppm,50 ppm, 80 ppm, 110 ppm, dan 140 ppm dengan mengambil masing - masing 0,4 ml, 1 ml, 1,6 ml, 2,2 ml, dan 2,8 ml larutan teofilin standar, dimasukkan kedalam labu ukur 10 ml, dan di ad dengan fase gerak sampai tanda batas.
Kemudian dilakukan penetapan kadar teofilin dalam sediaan tablet Euphyllin. Ditimbang tablet euphyllin yang setara dengan 25 mg teofilin, dilarutkan dengan fase gerak hingga larut sempurna, lalu dimasukkan kedalam labu ukur 50 ml dan di ad dengan fase gerak hingga tanda batas. Larutan diultrasonifikasi selama 15 menit, dan disaring dengan kertas saring. Kemudian diambil 5 ml larutan, dimasukkan kedalam labu ukur 50 ml. Setelah itu dilarutkan dengan fase gerak hingga tanda batas. Dilakukan akurasi sebagai salah satu parameter validasi metode. Untuk akurasi 80% diambil larutan sampel sebanyak 5 ml, ditambahkan larutan standar 40 ppm (diambilsebanyak 4 ml) dan dimasukkan kedalam labu ukur 10 ml, di ad dengan fase gerak hingga tanda batas. Untuk akurasi 100% diambil larutan sampel sebanyak 5 ml, ditambahkan larutan standar 50 ppm (diambil sebanyak 5 ml), dimasukkan kedalam labu ukur 10 ml, di ad dengan fase gerak hingga tanda batas. Untuk akurasi 120%, diambil larutan sampel sebanyak 5 ml, ditambahkan larutan standar 60 ppm (diambilsebanyak 6 ml) kemudian dimasukkan kedalam labu ukur 10 ml, dan di ad dengan fase gerak hingga tanda batas. Masing masing larutan disaring dan diinjeksikan pada HPLC. Untuk perhitungan akurasi, perlu dibuat larutan standar 40 ppm, 50 ppm, dan 60 ppm. Untuk standar 40 ppm, diambil larutan teofilin standar sebanyak 4 ml, dimasukkan kedalam labu ukur 10 ml, dan di ad dengan fase gerak hingga tanda batas. Untuk standar 50 ppm tidak perlu dibuat karena telah sesuai dengan kadar larutan standar yang dibuat sebelumnya. Untuk standar 60 ppm, diambil larutan teofilin standar sebanyak 6 ml, dimasukkan kedalam labu ukur 10 ml, dan di ad dengan fase gerak hingga tanda batas. Masing-masing larutan di injeksikan pada HPLC. 3. PerhitunganKurva Baku Penetapan Kadar Teofilindalam Tablet Euphyllin Larutan yang akandibuat : 25 mg Teofilindalam 50 ml fasegerak. Diambil 5mL diencerkankedalamlabu 50 ml kadarsampel yang akandibaca
PerhitunganAkurasi Akurasi Sampel + Standar Total kadar Akurasi 50 ppm sebanyak 5 ml 50 ppm + 40 ppm= 80% 90 ppm M 1.V 1 = M 2.V 2 100ppm.V 1 =40ppm.10mL V 1 = 4 ml Standardiambil4 ml Akurasi 100% 50 ppm sebanyak 5 ml 50 ppm + 50 ppm= 100 ppm M 1.V 1 = M 2.V 2 100ppm.V 1 =50ppm.10mL V 1 = 5 ml Standardiambil 5 ml Akurasi 120% 50 ppm sebanyak 5 ml 50 ppm + 60 ppm= 110 ppm M 1.V 1 = M 2.V 2 100ppm.V 1 =60ppm.10mL V 1 = 6 ml Standardiambil 6 ml PerhitunganKurva Baku Seri kadarharusdibuatberkisarantara< 50 ppm sampaidengan>110 ppm Seri kadar yang dibuat: 20 ppm, 50 ppm, 80 ppm, 110 ppm, 140 ppm. - Seri kadar 20 ppm - Seri kadar 50 ppm
- Seri kadar 80 ppm - Seri kadar 110 ppm - Seri kadar 140 ppm E. Data dan Perhitungan - Data Kurva Baku Seri Kadar (x) Area (y) y i (y i- y) 2 20 ppm 346975 347255.2 78512.04 50 ppm 877411 878164 567009 80 ppm 1404910 1409072.8 17328904 110 ppm 1951687 1939981.6 137016389 140 ppm 2464381 2470890.4 42372288 = 197363102 Persamaan Regresi: y = bx + a a = - 6684 b = 17696.96 r = 0.999 Y = 17696.96 x - 6684 >> seri kadar 20 ppm y = 17696.96 (20) 6684 = 347255.2
>> seri kadar 50 ppm y = 17696.96 (50) 6684 = 878164 >> seri kadar 80 ppm y = 17696.96 (80) 6684 = 1409072.8 >> seri kadar 110 ppm y = 17696.96 (110) 6684 = 1939981.6 >> seri kadar 140 ppm y = 17696.96 (140) 6684 = 2470890.4 >> sy/x = = = 8110.962 >> LOD = 3.3 x = 3.3 x = 1.51 ppm >> LOQ = = 10 x = 10 x = 4. 58 ppm - Data Akurasi Area x = kadar Sampel 3059982 173.288 ppm Akurasi 80 % 17241343 974.632 ppm Standar 40 ppm 3576087 202.451 ppm Akurasi 100 % 17894037 1011.514 ppm Standar 50 ppm 877411 49.957 ppm Akurasi 120 % 16949809 958.158 ppm Standar 60 ppm 5086326 287.790 ppm >> kadar sampel: Y = 17696.96 x - 6684 3059982 = 17696.96 x 6684 x = 173.288 ppm >> kadar akurasi 80 % : Y = 17696.96 x - 6684 17241343 = 17696.96 x 6684 x = 974.632 ppm >> kadar standar 40 ppm: Y= 17696.96 x 6684 3576087 = 17696.96 x 6684 x = 202.451 ppm >>Kadar akurasi 100 %: Y= 17696.96 x 6684 17894037 = 17696.96 x 6684 x = 1011.514 ppm >>kadar standar 50 ppm: Y= 17696.96 x 6684
877411 = 17696.96 x 6684 x = 49.957 ppm >>kadar akurasi 120 %: Y= 17696.96 x 6684 16949809 = 17696.96 x 6684 x = 958.158 ppm >>kadar standar 60 ppm : Y= 17696.96 x 6684 5086326 = 17696.96 x 6684 x = 287.790 ppm - % akurasi 80 % = = 395. 821 % - % Akurasi 100 % = = 1677.895 % - % akurasi 120 % = = 272.723 % - Kadar Teofilin dalam tablet eufilin: Sampel = 173.288 ppm x fp (10x) = 1732.88 mg/ 1000ml = 86.64 mg / 50 ml Kadar teofilin dalam 1 tablet = 1732.88 mg / 125 mg x 100 % = 1386.304 % F. Pembahasan Percobaan ini bertujuan untuk menganalisis secara kualitatif dan kuantitatif kandungan teofilin dalam sediaan tablet euphyllins dengan metode HPLC. sampel tablet euphyllins menggunakan peralatan High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Prinsip kerja dari HPLC adalah dengan bantuan pompa fase gerak, cairan dialirkan melalui kolom menuju detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam fase gerak dengan cara disuntikkan.di dalam kolom terjadi pemisahan komponen_-komponen campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut- solut terhadap fase diam.hplc merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk anlisis kualitatif maupun kuantitatif. Sampel yang dianalisis pada percobaan ini adalah teofilin yang terkandung dalam euphyllins bentuk tablet. Pemerian dan sifat dari teofilin antara lain: serbuk berserat atau granul, berwarna putih, suspensi dalam air bereaksi netral terhadap lakmus P, mengembang dalam air dan membentuk suspensi yang jernih hingga opalesen kental,koloidal.kelarutan : sukar larut dalam air tetapi mudah larut dalam larutan alkali hidroksida dan dalam
ammonium hidroksida agak sukar larut dalam etanol. Stabilitas : dapat disimpan pada suhu kamar, dibawah cahaya florosensi terus menerus selama sekurang kurangnya 180 hari tanpa perubahan konsentrasi yang signifikan dalam bentuk larutan sebaiknya dilindungi cahaya,stabil di udara. Pada percobaan ini, digunakan metode HPLC dikarenakan, lebih unggul bila dibandingkan dengan kromatografi kolom terbuka. Dalam HPLC digunakan ukuran partikel fase diam yang lebih kecil dan pompa bertekanan tinggi (300-3000 Psi) untuk menjamin proses penghantaran fase gerak dapat berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.detektor yang digunakan adalah detektor UV, detektor UV digunakan dalam suatu analisis jika senyawa yang akan dianalisis menerima panjang gelombang maksimum pada rentang 200-800nm.Senyawa yang akan diuji adalah teofilin yang berada pada rentang panjang gelombang tersebut.detektor UV dapat menguji senyawa yang memiliki gugus auksokrom dan kromofor. Pada HPLC, menggunakan fase gerak cair yang dialirkan melalui kolom yang merupakan fase diam, menuju ke detektor. Dalam fase gerak ada dua pilihan atau jenis, yaitu isokratik yang hanya menggunakan satu macam fase gerak ataupun gradien yang menggunakan lebih dari satu macam fase gerak. Dan pada percobaan ini digunakan fase gerak isikratik. Setelah campuran memasuki kolom,terjadi pemisahan senyawa- senyawa yang akan keluar atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi antara senyawa dengan fase diam.senyawa- senyawa yang kurang kuat akan keluar terlebih dahulu, dan sebaliknya senyawa yang berinteraksi kuat dengan fase diam akan keluar lebih lama. Senyawa yang keluar dari kolom akan didetaksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Dari kromatogram akan dapat diidentifikasikan waktu retensi (tr) dan luas area/ tinggi puncak. Informasi tr digunakan untuk analisis kualitatif sedangkan luas area atau timggi puncak untuk analisis kualitatif. Dalam percobaan ini, dilakukan beberapa perlakuan diantaranya adalah ultrasonikasi yang bertujuan untuk mempercepat proses ekstraksi dengan diikuti timbulnya gelembung yang meningkatkan transfer massa antara permukaan padat- cair.selain itu, juga dilakukan penyaringan untuk menyaring kotoran atau kontaminan yang dapat mempengaruhi bahan serta hasil praktikum. Teknik penyuntikan sampel dilakukan dengan bantuan micro syringe. Sebanyak 15 mikroliter larutan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi load, setelah itu tutup diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi inject dan fase gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Pada awal penyuntikan dilakukan penyuntikan parasetamol murni dan kafein murni, kemudian ditunggu selama 10 menit, setelah alat HPLC berbunyi (merupakan tanda bahwa elusi telah selesai). Langkah selanjutnya dilakukan penyuntikan standar campuran parasetamol dan kafein pada berbagai konsentrasi (20ppm, 50ppm, 80ppm, 110ppm,140ppm) yang nantinya digunakan untuk membuat kurva baku, selanjutnya larutan sampel yang mengandung teofilin diinjektsi lalu dielusi. Pada HPLC, diperluakan suatu validasi metode yang meliputi: presisi, akurasi, sensitifitas, limit deteksi(lod), limit kuantitasi (LOQ), jangkauan kerja linear dan selektivitas. Dan dari sekian validasi metode, yang digunakan dalam praktikum ini adalah linearitas yang merupakan kisaran konsentrasi analit yang secara eksperimen mampu
memenuhi persyaratan mutu metode uji melalui penetapan presisi, akurasi dan linearitas pengujian.lod adalah jumlah analit yang memberikan respon sinyal pengukuran terendah dalam suatu derajat kepercayaan statistik yang dapat diterjemahkan sebagai indikasi terdapatnya analit dalam larutan. Sedangkan LOQ yaitu konsentrasi analit terendah yang dapat ditetapkan dengan presisi atau ripitibilitas yang masih dapat diterima. Dan akurasi adalah kedekatan nilai hasil uji dengan nilai sebenarnya. Untuk menghitung bobot teofilin dalam sampel, maka luas area terkoreksi dimasukkan sebagai y ke dalam persamaan kurva baku hasil regresi linear antara bobot versus luas area terkoreksi dari larutan baku. Dari kurva baku didapat nilai r=0.999 sedangkan regresi linear, yaitu Y = 17696.96 x 6684 dan didapatkan hasil sy/x= 8110.962, LOD= 1.51 ppm dan LOQ= 4. 58 ppm. Konsentrasiteofilin173.288 ppm dan kadar dalam sampel =86.64 mg / 50 ml,sedangkan kadar teofilin dalam 1 tablet=1386.304 %. Dari data yang didapat tersebut, di dapatkan nilai r yang baik, nilai LOD dan LOQ juga termasuk cukup baik.
G. DaftarPustaka Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi 4,Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 2009, The United Stated Pharmacopeia National Formulary, Volume 3, United Book Press, Maryland. Association Official of Analytical Chemistry, 1993, AOAC Peer-Verified Methods Program, Maryland: AOAC International. Chan CC., 2004, Potency Method Validation, Di dalam: Chan CC, Lee YC, Lam H, Zhang XM, editor. Analytical Method Validation and Instrument Performance Verification, New Jersey: J Wiley & Sons. Gandjar,I.G., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Jogjakarta. Green JM., 1996, A practical guide to analytical method validation. Anal Chem 68:305A-309A Watson, David. G., 2009, Analisis Farmasi: Buku Ajar untuk Mahasiswa Farmasi DAN Praktisi Kimia; alih bahasa, Winny R Syarief: editor edisi bahasa Indonesia Amalia H, Hadinata., edisi 2, EGC, Jakarta. Young W., 2003, Summary of research on theophylline treatment of respiratory deficiency. http://sciwire.com [23 Juli 2005].