BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Spektrofotometri dapat digunakan untuk menganalisa konsentrasi suatu zat didalam larutan berdasarkan absorbansi terhadap warna dari larutan pada panjang gelombang tertentu. Metode spektrofotometri memerlukan larutan standar yang telah diketahui konsentrasinya. Metode ini merupakan metode yang sangat sederhana untuk menganalisis jumlah (konsentrasi) sampel yang sangat kecil. Dalam bidang pangan spektrofotometri berguna untuk mengetahui kadar Antosianin pada suatu bahan. Antosianin merupakan pewarna alami untuk pangan dan dapat dijadikan alternatif pengganti pewarna sintetis yang lebih aman bagi kesehatan. Sedangkan dalam bidang oceanografi, spektrofotometri dapat digunakan untuk mengetahui tingkat kesuburan suatu perairan dengan menentukan konsentrasi zat organik yang dihasilkan atau juga disebut produtivitas primer. Salah satu cara yang dipakai dengan mengetahui banyaknya biomassa plankton dilaut dengan menentukan kadar klorofil fitoplankton dengan metode spektrofotometri. 1.2. Tujuan Praktikum 1. Menentukan panjang gelombang optimum antosianin dengan spektrofotometer metode spektrofotometri. 2. Menentukan kurva hubungan konsentrasi antosianin vs absorbansi pada panjang gelombang optimumnya dengan spektrofotometer metode spektrofotometri. 3. Menentukan konsentrasi antosianin pada sampel dengan spektrofotometer metode spektrofotometri. 1.3. Manfaat Praktikum Mahasiswa mampu melakukan analisa kuantitatif secara akurat suatu zat kimia dengan menggunakan spektrofotometer
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Pengertian Spektofotmetri adalah kata yang digunakan untuk ilmu yang berkaitan dengan absorbsi, emisi, dan penyebaran (scattering) dari radiasi elektromagnetik molekul, ion atau atom. Spektrofotometri (teknik spektroscopy) merupakan metode analisa untuk menentukan identitas dan konsentrasi suatu senyawa dalam larutan yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis larutan berwarna. Suatu senyawa, elektron dan intinya mempunyai nilai level energi tertentu, dan hanya bisa mengabsorpsi photon dengan energi dan panjang gelombang tertentu. Energi cahaya yang diabsorbsi oleh molekul dapat dikorelasikan dengan gerakan dari molekul seperti yang ditunjukkan oleh tabel 2.1. Tabel 2.1 Hubungan antara energi terabsorbsi dengan gerakan molekul Gerakan Molekul Cahaya yang diabsorbsi Energi Rotasi Vibrasi Microwave, Infrared Infrared Rendah Sedang Transisi electron Tampak, Ultraviolet Tinggi Kisaran spektrum elektromagnetic seperti infrared, sinar tampak, ultraviolet atau X-ray dapat digunakan untuk berinteraksi dengan suat zat. Alat yang dipakai pada praktikum ini dapat disebut juga dengan colorimeter, karena dapat mengukur absorpsi cahaya pada spektrum sinar tampak. Skema dari proses absorpsi cahaya oleh suatu larutan contoh dapat dilihat pada gambar 1. Gambar 2.1 Absorpsi cahaya oleh larutan contoh. Persen transmitan adalah pembanding antara intensitas cahaya yang keluar dari sampel terhadap intensitas yang masuk, dinyatakan dengan rumus %T = I/lox100%................................. (1) Sedang absorbansi dinyatakan dengan rumus : A = log 1/T = log(i/i 0 ) = 2- log (%T)..................................(2)
Tabel 2.2 Spektrum sinar tampak dan warna komplementer (vogel 1989) Panjang Warna (terabsorbsi) Warna komplementer Gelombang (nm) 400-435 Violet Kuning-hijau 435-480 Biru Kuning 480-490 Hijau-Biru Orange 490-500 Biru-Hijau Merah 500-560 Hijau Ungu 560-580 Kuning-Hijau Violet 580-595 Kuning Biru 595-610 Orange Hijau-Biru 610-750 Merah Biru-Hijau Banyaknya cahaya/sinar yang diabsorbsi tergantung pada jenis larutannya, panjang sel/kuvet, konsentrasi larutan. Parameter tersebut dapat dinyataan secara matematis dengan hukum Beer : A=log (Io/It) = abc................................. (3) dengan: Io =Intensitas sinar datang It =Intensitas sinar yang diteruskan A =Absorbansi a =Absorbtivitas b =Panjang cuvet (cm) c =Konsentrasi (mg/l) Molekul tidak mengabsorpsi semua panjang gelombang secara sama. Tergantung dari warna objek. Bunga akan terlihat mempunyai warna merah, jika mengabsorpsi semua warna kecuali warna merah atau kalau bunga mengabsorpsi cahaya dari warna komplementer merah yaitu biru-hijau. Pada tabel 2.2 ditunjukkan warna dan komplementer dari berbagai warna. Pada praktikum ini nilai a dan b tidak berubah, sehingga nilai ab dianggap sebagai konstanta baru (k), sehingga persamaan (3) A= k.c dapat dinyatakan dengan persamaan garis lurus. Dari hukum Beer dapat dinyatakan juga bahwa hubungan antara absorbansi vs konsentrasi akan memberikan garis lurus. (Underwood, 1999) Hukum Beer menjadi dasar aspek kuantitatif spektrofotometri yang mana konsentrasi dapat dihitung berdasarkan persamaan (3). Absorptivitas (a) konstanta yang tidak tergantung pada konsentrasi, tebal kuvet dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel. Absorptivitas tergantung pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan panjang gelombang radiasi.
2.2 Metode Analisis Spektrofotometri Ada tiga teknik yang biasa dipakai dalam analisis secara spektrofotometri. Ketiga teknik tersebut adalah Metode Standar Tunggal, Metode Kurva Kalibrasi, Metode Adisi Standar. Pada praktikum ini, metode yang digunakan adalah Metode Kurva Kalibrasi. Metode Kurva Kalibrasi Dalam Metode ini dibuat suatu larutan standar dengan berbagai konsentrasi dan absorbansi dari larutan tersebut diukur dengan AAS. Langkah selanjutnya adalah membuat grafik antara konsentrasi (C) dengan absorbansi (A) yang akan merupakan garis lurus mekewati titik nol dengan slope = Ɛ.b atau slope = a.b. Konsentrasi larutan sampel dapat dicari setelah absorbansi lantan sampel diukur dan diintrapolasi ke dalam kurva kalibrasi atau dimasukkan ke dalam persamaan garis lurus yang diperoleh dengan menggunakan program regresi linear pada kurva kalibrasi.
BAB III METODE PRAKTIKUM 3.1. Bahan dan Alat yang Digunakan 3.1.1 Bahan 1. Air demin secukupnya 2. KCl 20 ml 3. Natrium Asetat 20 ml 4. Sampel 100 ml 3.1.2 Alat 1. Spektrofotometri Optima Sp-300 2. buah beakerglass 250ml 3. 6 tabung reaksi beserta 1 rak tabung reaksi 4. 1 pipet ukur 10 cc 5. ph meter 6. 4 buah beaker glass 50 cc 3.2. Gambar Alat Utama Keterangan ggambar 1. Tempat sampel 2. Pengontrol panjang gelombang 3. Indikator power ON/OFF 4. Pembacaan LCD Digital 5. Tombol pengganti Mode 6. Tombol control 100% T 7. Tombol control 0% T 8. Tombol print 9. Jendela pembacaan panjang gelombang Gambar 3.1 Spektrofotometri Optima Sp-300
Gambar 3.2 Cuvet 3.3.Cara Kerja 3.3.1. Menentukan panjang gelombang optimum untuk antosianin. 1. Optima sp-300 dihidupkan dengan menekan tombol power (3) sampai bunyi klik, dan indikator lampu menyala. Menunggu 20 menit untuk pemanasan alat sebelum digunakan. 2. Dengan tombol 5, mode pembacaan transmitansi (T) diatur 3. Panjang gelombang yang diinginkan diatur dengan menggunakan tombol (2) 3.3.2. Cara kalibrasi alat spektrofotometri 1. Tempat sampel (1) pada spektrofotometer dikosongkan. 2. Skala pembacaan transmitan diatur 0% menggunakan tombol (7). 3. Cuvet (seperti barang yang sederhana tetapi dari bahan gelas dengan super kualitas, berharga 3 juta) diambil dan dibersihkan kemudian diisi dengan air demin sampai ¾ nya (disebut dengan blangko). Bagian luar cuvet dibersihkan dengan kapas secara hati-hati (jangan sampai tergores). 4. Tutup sampel pada spektrofotometer (1) dibuka, dan tempat kuvet diambil. 5. Cuvet dimasukkan pada tempat kuvet dengan sisi yang terang menghadap ke luar dan kembali ditutup (tinggi larutan disesuaikan dengan tanda yang ada). 6. Pembacaan transmitan diatur 100% (A=0) untuk larutan blangko menggunakan tombol (6). 7. Cuvet diambil dari tempat sampel kemudian ditutup. Pembacaan skala transmitan dapat dilihat pada layar (4). Dalam tahap ini pembacaan transmitan harus 0%. Jika tidak, diulangi dari langkah 3 hingga pembacaan diperoleh pembacaan transmitan yang konsisten. 8. Jika sudah diperoleh pembacaan untuk 0 % dan 100% konsisten, cuvet disimpan dengan larutan blangko tersebut sampai praktikum selesai. 9. Cuvet lainnya diisi dengan larutan sampel, bagian luar cuvet dibersihkan, lalu dimasukkan ke dalam tempat sampel, dan ditutup kembali, skala transmitan
dapat dibaca pada layar (4) dan hitung absorbansinya, A =2-log %T. 10. Panjang gelombang dinaikkan setiap 10nm dengan menggunakan tombol (2), ulangi langkah 1 sampai 7. 11. Kurva hubungan antara absorbansi versus panjang gelombang dibuat, kemudian tentukan nilai panjang gelombang optimum untuk jenis larutan target. 3.3.3.Membuat kurva kalibrasi antara absorbansi versus konsentrasi antosianin. 1. Larutan berwarna dibuat pada berbagai variasi sampel. 2. Panjang gelombang diatur sesuai dengan hasil yang diperoleh pada tujuan (a) menggunakan tombol (2). 3. Alat spektrofotometri dikalibrasi (langkah 1 sampai 6). 4. Cuvet lainnya diisi dengan larutan sampel no. 2, Cuvet dibersihkan bagian luarnya, dimasukkan ke dalam tempat sampel, ditutup kembali, dibaca skala transmitan dan dihitung absorbansinya, A=2-log (%T). Lalu diulangi untuk sampel no. 3, 4, 5, dan 6. 3.3.4. Menentukan kadar antosianin total dalam larutan. 1. Larutan KCl 0,025 M dibuat sebagai larutan buffer ph 1. Kemudian diukur phnya dan diatur phnya supaya mempunyai ph 1 dengan menggunakan larutan HCl. 2. Larutan Natrium Asetat (CH 3 CO 2. Na 3 H 2 O) 0,4 M dibuat. Kemudian diukur ph nya dan diatur phnya supaya larutan mempunyai ph 4,5 dengan menggunakan larutan HCl. 3. 1 buah beaker glass 50cc diisi dengan larutan no.2 sebanyak 5ml dengan pipet ukur. ph larutan dibuat sama dengan 1 dengan menambahkan larutan buffer KCl dengan pipet ukur, hitung berapa jumlah volume yang telah ditambahkan sehingga ph=1. Hal serupa dilakukan untuk sampel no. 3,4,5, dan 6. 4. Panjang gelombang diatur pada 520 nm, kemudian dlakukan kalibrasi alat langkah 1-6 (dilakukan untuk setiap pergantian panjang gelombang). Setelah itu, dimasukkan larutan no.2 dengan ph=1 kedalam cuvet hingga ¾ bagian. % transmitan dicatat dan hitung absorbansinya, begitu juga untuk sampel no.3,4,5,dan 6. 5. Panjang gelombang diatur pada 700 nm. Kemudian lakukan kalibrasi alat langkah1-6 (dilakukan untuk setiap pergantian panjang gelombang). Setelah itu, masukkan larutan no.2 ph 1 ke dalam cuvet hingga ¾ bagian. % transmitan dicatat dan hitung absorbansinya, begitu juga untuk sampel no. 3,4,5, dan 6. 6. Ulangi langkah 1-5 dengan membuat ph larutan sama dengan 4,5 dengan menambah larutan buffer Na Asetat.
7. Konsentrasi antosianin dihitung sesuai dengan rumus :........................................ (4) 8. Persamaan Beer untuk konsentrasi antosianin, dibuat dengan persamaan : A = kc...........................................(5)
DAFTAR PUSTAKA Barners, kw, dkk. 2005. Determination of Totalmorometricantosianin pigmencontent of Fruit Juice, Beverage, Natural Colorants, and Louise Bythe ph Differential Groggins, ph.1950, unit proses in organic syntesis (5th ed), PP 700 783. New York : Mc.Graw Hill Book Company Inc. J.pharm. 2006. Solubilization and Quantificationolycopeneinaqueousmediaithe System. diakses dari Cyclodextrin Binari pada tanggal 4 mei 2013. Kerr, R.W. 1950. Chemystri and Industri of Starch (2nd ed), PP 375-403. New York : Academic Press Inc. Method Collaboration Study. Journal of AOA Cinternational, Vol 85, rb.5, PP 1269-1278. Munkramin, Baso. 2012. Spektrofotometri-absorbansi dan Konsentrasi ( hukum labert beer ) diakses pada tanggal 27 April 2013 Penelope, Perkins Veanic. 2002. Composition of Orange, Yellow, and Red Fleshes Watermelon. Diakses pada tanggal 2 Juni 2013. Underwood,A.I.And Day R.A.1983.Analisa kimia kuantitatif 5th edition. Diterjemahkan oleh R.Soendoro. Jakarta : Erlangga Vogel. 1989. Textbook of Quantitatif Chemical Analysis, PP 645-676. New York : Longman Scientific and Technical. Woodman, A.1941. Food analysis (4 ed), PP 264-261. NewYork : Mc Graw Hill Book Company Inc.