BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (IPB) mulai Maret 2011 sampai Oktober 2011. Bahan Bahan yang digunakan adalah serbuk gergaji, dedak, ampas tahu, tepung limbah udang, kapur pertanian, susu skim, glukosa, media agar WYE (Water-yeast extract), media PDA (Potato Dextrose Agar), isolat aktinomiset APS 7, APS 9, APS 12, ATS 5, dan biakaan cendawan Sclerotium rolfsii. Peremajaan Aktinomiset dari Kultur Penyimpanan Isolat murni aktinomiset didapatkan dari Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan Proteksi Tanaman. Isolat aktinomiset APS 7, APS 9, dan APS 12 berasal dari tanah bagian top soil sekitar perakaran sawit (Putra 2011) sedangkan aktinomiset ATS 5 berasal dari tanah persawahan (Himmah 2012). Perbanyakan isolat murni dilakukan dengan menumbuhkan inokulum pada media agar WYE (0.25 g yeast extract, 0.5 g K 2 HPO 4, 18 g agar, dan 1 L aquades) (Crawford et al. 1993) dan diinkubasi pada suhu ruang 28 ⁰C selama 7-14 hari. Pertumbuhan isolat berhasil jika terdapat koloni aktinomiset yang tumbuh dan mengeluarkan spora seperti berdebu (merupakan eksospora yang terbentuk), mengandung pigmen tertentu, dan berbau khas tanah. Perbanyakan Sclerotium rolfsii dari Kultur Penyimpanan Isolat S. rolfsii disiapkan dengan menumbuhkan bulatan miselium cendawan (diameter 0.5 cm) pada media PDA (20 g dextrose, 200 g ekstrak kentang, 15 g agar, dan 1 L aquades) lalu diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang 28 ⁰C. Isolat siap digunakan jika ada pertumbuhan miselium tipis, berwarna putih, dan teratur yang tumbuh memenuhi isi cawan. Pada umur tua miselium ini akan berubah menjadi butiran bulat (tidak beraturan) dengan permukaan yang licin. Mulanya berwarna putih kemudian menjadi kecoklatan dinamakan
11 sklerotium, ini digunakan sebagai struktur bertahan pada kondisi lingkungan yang tidak mendukung. Uji in vitro Penghambatan Sclerotium rolfsii oleh Aktinomiset Pengujian antagonis aktinomiset menggunakan metode peracunan media tumbuh S. rolfsii. Media yang digunakan adalah PDA yang telah disterilisasi pada suhu 121 ⁰ C selama 15 menit. Masing-masing aktinomiset berumur 14 hari sebanyak satu ose diinokulasikan ke dalam 15 ml media cair WYE ( 0.25 g yeast extract, 0.5 g K 2 HPO 4, dan 1 L aquades) (Crawford et al. 1993) dan diinkubasi pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 100 rpm selama 7, 14, 21 dan 28 hari. WYE cair yang mengandung biakan aktinomiset, masing-masing sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung ependorff lalu sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit hingga didapatkan supernatan yang mengandung senyawa bioaktif aktinomiset. Supernatan dimasukkan ke dalam erlenmayer steril 200 ml dan dipanaskan pada inkubator pemanas dengan suhu 65 ⁰ C selama 30 menit. Selanjutnya didiamkan pada suhu ruang selama 60 menit lalu dipanaskan kembali selama 30 menit dengan suhu yang sama, hal ini bertujuan untuk mematikan sel vegetatif aktinomiset. Cairan yang mengandung senyawa bioaktif dicampurkan ke dalam media PDA yang telah dicairkan (suhu 50 ⁰ C). Media PDA yang telah tercampur oleh senyawa bioaktif aktinomiset kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri (diameter 9 cm). Setelah itu, pada pusat cawan petri diinokulasikan bulatan koloni S. rolfsii (diameter 0.5 cm) berumur 7 hari pada masing-masing perlakuan. Media biakan lalu diinkubasi selama 3 hari pada suhu ruang 28 ⁰ C. Percobaan dilakukan sebanyak dua kali ulangan. Pengamatan dilakukan terhadap pertumbuhan miselium pada setiap perlakuan. Persen penghambatan pertumbuhan S. rolfsii dihitung dengan persamaan: Daya hambat (%) = Keterangan: Dk Dp Dk DK = diameter koloni S. rolfsii pada kontrol DP = diameter koloni S. rolfsii pada perlakuan. 100%
12 Aktinomiset yang memiliki keefektifan tertinggi dalam menekan pertumbuhan S. rolfsii digunakan sebagai pengujian pembiakan pada media limbah organik. Isolat yang terseleksi kemudian dilakukan perbanyakan. Pembiakan Aktinomiset pada Media Limbah Organik Persiapan Media Limbah Organik Bahan yang digunakan sebagai komposisi utama terdiri dari serbuk gergaji dan dedak. Serbuk gergaji berasal dari limbahvpabrik penggergajian yang merupakan jenis kayu kihiyang (Albizzia procerra) sedangkan dedak didapatkan dari toko pertanian. Serbuk gergaji dan dedak disaring guna mendapatkan bagian yang lebih halus dan dijemur agar terhindar dari serangan mikroorganisme gudang. Bahan tambahan untuk menunjang nutrisi terdiri dari ampas tahu, tepung limbah udang, kapur pertanian, glukosa, dan susu skim. Ampas tahu diperoleh dari pabrik pengolahan tahu yang terletak di daerah Cibanteng, Bogor. Ampas tahu diperas dengan saringan kain dan dijemur hingga kering kemudian dihaluskan menggunakan blender hingga menjadi tepung. Sedangkan tepung limbah udang berasal dari limbah udang yang terdiri dari kepala, ekor dan cangkang udang yang dijemur dan dikeringkan dengan oven lalu dihaluskan hingga menjadi tepung. Pembuatan Media Limbah Oganik Bahan-bahan pembuatan media limbah organik dicampurkan hingga kondisi homogen dengan penambahan air sebanyak 30 ml untuk media serbuk gergaji dan 50 ml untuk media dedak. Indikator penambahan air yang cukup yakni jika media digenggam tidak hancur (menggumpal) dan tidak sampai meneteskan air. Setelah tercampurnya semua bahan media limbah organik, maka dilakukan penyesuaian tingkat keasaman pada media dengan derajat keasaman 6.5-8.0. Kondisi ini merupakan ph optimum untuk syarat hidup aktinomiset. Kemudian bahan yang telah tercampur dimasukkan ke dalam plastik polipropilen 1 kg tahan panas sebanyak 200 g. Setelah itu ujung plastik diberi cincin pipa (diameter 4 cm) kemudian lubang cincin disumbat menggunakan kapas dan ditutup dengan kertas putih (13 cm x 9 cm) guna meminimalkan terjadinya kontaminasi. Komposisi tiap bahan yang diperlukan untuk membuat 200 g media aktinomiset sebagai berikut:
13 Tabel 1 Komposisi bahan media serbuk gergaji Bahan Komposisi bahan (g) Komposisi bahan (%) Serbuk gergaji 90.0 45.0 Ampas tahu 88.6 44.3 Kapur pertanian 5.4 2.7 Glukosa 10.0 5.0 Susu skim 5.0 2.5 Tepung limbah udang 1.0 0.5 Tabel 2 Komposisi bahan media dedak Bahan Komposisi bahan (g) Komposisi bahan (%) Dedak 90.0 45.0 Ampas tahu 77.0 38.5 Kapur pertanian 17.0 8.5 Glukosa 10.0 5.0 Susu skim 5.0 2.5 Tepung limbah udang 1.0 0.5 Media tumbuh serbuk gergaji dan dedak kemudian disterilisasi pada suhu 120 ⁰ C selama 15 menit untuk mengindari terjadinya kontaminasi. Media tumbuh disimpan pada suhu 28 ⁰ C selama 24 jam sebelum diinokulasikan dengan biakan aktinomiset. Pembiakan Aktinomiset Pembiakan dilakukan dengan mencampurkan 10 ml air steril ke dalam biakan aktinomiset (berumur 14 hari) kemudian spora dipanen menggunakan spatula steril hingga tersuspensi. Suspensi spora yang telah tercampur diambil sebanyak 1.25 ml (satu gram media terdapat koloni aktinomiset dengan kerapatan 1 10 3 cfu/ml) lalu dilarutkan ke dalam 8.75 ml air steril hingga total menjadi 10 ml. Suspensi sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam 200 g media limbah organik kemudian suspensi dihomogenkan bersamaan dengan media. Semua proses inokulasi aktinomiset ke dalam media dilakukan secara aseptik. Media diinkubasi selama 0, 2, 4, 6, dan 8 minggu pada suhu ruang 28 ⁰ C. Pengulangan dilakukan sebanyak lima kali.
14 Penghitungan Populasi Aktinomiset pada Media Limbah Organik Penghitungan populasi aktinomiset dilakukan dengan metode pengenceran berkala (10 0, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, dan 10-5 ) pada media tumbuh yang telah diinkubasi selama 0, 2, 4, 6, dan 8 minggu. Metode pengenceran dilakukan dengan memasukkan 1 g media limbah organik ke dalam tabung reaksi berisi 10 ml air steril sebagai pengenceran 10 0, Kemudian diambil sebanyak 1 ml larutan dari tabung pengenceran 10 0 dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml air steril sebagai pengenceran 10-1 berikutnya. Setiap pengenceran 10-3, 10-4, dan 10-5 lalu pengenceran dilakukan pada tabung diambil masing-masing sebanyak 0.1 ml untuk disebar secara merata pada media agar WYE menggunakan glass bead. Setelah itu diinkubasi selama 3-7 hari untuk menghitung populasi koloni aktinomiset. Indikator adanya koloni aktinomiset yakni terdapat koloni tunggal berukuran 1-10 mm yang memiliki filamen berdebu seperti miselium dan berbau khas tanah. Data diambil berdasarkan penghitungan koloni yang terdapat pada media agar WYE, koloni dihitung menggunakan metode plate count berlatarbelakang hitam dengan kisaran 30-300 koloni/cawan menggunakan alat Handy Tally Counter (Hadioetomo 1990). Populasi aktinomiset APS 7 pada media limbah organik dihitung dengan persamaan: Populasi bakteri = X V p r g Keterangan: X = rataan koloni aktinomiset dengan faktor pengenceran ke- (cfu/ml) V = volume pengenceran media (ml) p = faktor pengenceran ker = volume suspensi yang disebar pada cawan (ml) g = bobot media yang digunakan (g). Analisis Data Data pengamatan uji in vitro penghambatan S. rolfsii oleh aktinomiset ditabulasi menggunakan program Microsoft Excel 2007 dan data penghitungan kepadatan populasi aktinomiset diolah menggunakan program Statistical Analysis System (SAS) 9.1.3 untuk Windows. Pengaruh yang berbeda nyata akan dilakukan uji lanjut selang berganda Duncan pada taraf nyata ( ) = 5%.