MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian dilaksanakan dari bulan Februari sampai dengan bulan Juli 2011 di Laboratorium Nutrisi Ternak Perah, Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, IPB dan di Balai Penelitian dan Pengembangan Ternak, Serpong-Tangerang. Analisa kandungan tanin dan saponin di Balai Penelitian Ternak Ciawi, Bogor. Pengujian proporsi molar VFA di Pusat Penelitian dan Pengembangan Ternak, Bogor. Analisa kandungan nutrien konsentrat, hijauan, ampas teh dan daun kembang sepatu di Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB. Analisa kandungan serat kasar ampas teh di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan IPB. Materi Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian antara lain timbangan digital, tabung fermentor, tutup karet, sudip, syringe glass Hohenheim 100 ml, pipet volumetik, pipet mikro 0,1 ml, bulp, termos, kain penyaring, waterbath, tabung gas CO 2, ph meter, tabung eppendorf, tissu, pompa vakum, eksikator, erlenmeyer, oven 105 o C, cawan porselen, tanur, gegep, sentrifuse, tabung reaksi, cawan Conway, buret, magnetic stirrer, dan Gas Chromatography (GC). Bahan Ternak dan Pakan. Sumber cairan rumen yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari sapi Peranakan Ongole berfistula yang dipelihara seperti sapi perah di Laboratorium Lapang Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Pakan yang diberikan adalah 2 kg konsentrat dan 15 kg rumput gajah dengan rasio (35:65% BK). Bahan yang digunakan untuk in vitro adalah: 1) ransum perlakuan (60% Hijuaan (Rumput Gajah) dan 40% Konsentrat dengan komposisi 34,25% pollard; 29,33% bungkil kalapa; 25,07% onggok; 5,26% molasses; 3,24% CaCO 3, 1,31% urea, 0,66% premix; 0,64% bungkil kedelai; dan 0,44% garam, 2) tepung ampas teh dan 3) tepung daun kembang sepatu. Ransum perlakuan yang digunakan selama penelitian sudah mencukupi standar 18
kebutuhan sapi perah dengan bobot badan 454 kg, produksi susu 10 kg, kadar lemak 4% membutuhkan PK 11,9% dan TDN 68% (NRC, 2001). Tabel 1. Kandungan Nutrien Ransum Penelitian Berdasarkan Bahan Kering (% BK) Nutrien K:H= K H 40:60% AT DKS BK 87,89 19,78 47,03 43,87* 22,42 Abu 14,65 6,43 9,72 14,28 10,48 PK 15,43 14,58 14,92 22,28 14,91 LK 8,57 2,64 5,01 1,76 2,73 SK 6,49 25,37 17,82 16,78 13,43 Lignin 4) - - - 45,97 - Silika 4) - - - 8,54 - Hemiselulosa 4) - - - 6,69 - Selulosa 4) - - - 22,61 - Beta-N 54,86 50,98 52,53 44,90 58,45 TDN 3) 76,67 61,91 67,81 69,04 68,29 Keterangan: 1) K=Konsentrat, H= Hijauan (Rumput Gajah), AT= Ampas Teh, DKS= Daun Kembang Sepatu 2) Analisa proksimat Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati & Bioteknologi, Dramaga Bogor (2011). 3) Perhitungan TDN dengan rumus (Hartadi,1980) Rumus TDN = 92,464 - (3,338 x SK) - (6,945 x LK) - (0,762 x Beta-N) + (1,115 x PK) + (0,031x SK 2 ) - (0,133 x LK 2 ) + (0,036 x SK x Beta-N) + (0,207 x LK x Beta-N) + (0,1 x LK x PK) - (0,022 x LK x PK) 4) Analisa komponen SK (ampas teh) Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan, IPB (2011) *Data Sekunder : Istirahayu (1993) Bahan Kimia. Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari NaHCO 3, Na 2 HPO 4.7H 2 O, KCL, NaCl, MgSO 4.7H 2 O, CaCl 2, larutan Na 2 CO 3 jenuh, asam borat, H 2 S0 4 0,005 M, asam sulfosalisinat, pepsin, HCL pekat, HgCl 2, larutan mineral mikro (CaCl 2 2H 2 O, MnCl 2 4H 2 O, CoCl 2 6H 2 O, FeCl 3 6H 2 O), buffer rumen (NH 4 HCO 3 dan NaHCO 3 ), larutan makro (Na 2 HPO 4 anhydrous, KHPO 4 anhydrous, MgSO 4.7H 2 O), larutan pereduksi (NaOH 1 N dan Na 2 S.9H 2 ), resazurin, dan aquadest. Metode Prosedur Pembuatan Tepung Ampas Teh dan Daun Kembang Sepatu Bahan tepung ampas teh didapatkan dari PT. Sinar Sosro Bekasi. Daun kembang sepatu berasal dari lingkungan sekitar PUSPITEK Serpong. Ampas teh dan Daun kembang sepatu dibersihkan, dikeringanginkan (kering layu) selama 5 6 jam 19
dibawah terik matahari. Setelah itu dikeringkan dengan menggunakan oven (60 o C) selama 2 hari. Daun dan ampas yang sudah kering digiling dengan menggunakan mesin penggiling untuk mendapatkan dalam bentuk tepung. Tabel 2. Kandungan Tanin dan Saponin yang Terdapat pada Ampas Teh dan Daun Kembang Sepatu Berdasarkan Bahan Kering Bahan (% BK) Tanin Saponin Ampas Teh 0,27 1 Daun Kembang Sepatu 0,53 8,53 Keterangan: Analisis di Laboratorium Balai Penelitian Ternak, Ciawi Bogor (2011). Daun Teh * Tepung Ampas Teh Daun Kembang Sepatu Tepung Daun Kembang Sepatu Gambar 9. Bahan Tambahan Ransum Penelitian Sumber: BPPT* (2005) & Dokumentasi Penelitian (2011) Prosedur Pengujian Fermentasi in vitro Pengambilan Cairan Rumen. Termos yang akan dipakai untuk tempat cairan rumen diisi dengan air panas sehingga suhunya mencapai 39 o C kemudian ditutup. Cairan rumen diambil diperas dengan menggunakan kain kasa dan dimasukkan kedalam termos hangat. Sebelum digunakan untuk tempat cairan rumen, air panas yang ada didalam termos dibuang terlebih dahulu. Dalam rangka menjaga agar cairan rumen tetap dalam kondisi anaerob, termos harus segera ditutup rapat dan dialiri gas CO 2 sebelum digunakan. 20
Pembuatan Larutan Mc Dougal (Saliva Buatan). Dalam pembuatan larutan 6 liter, sebanyak 5 liter air destilasi dimasukkan ke dalam labu takar yang bervolume 6 liter kemudian dimasukkan bahan-bahan sebagai berikut: NaHCO 3 (58,8 gram), Na 2 HPO 4.7H 2 O (42 gram), KCL (3,42 gram), NaCl (2,82 gram), MgSO 4.7H 2 O (0,72 gram) dan CaCl 2 (0,24 gram). Semua bahan tersebut dilarutkan kecuali CaCl 2, setelah semua bahan larut ditambahkan CaCl 2. Kemudian leher labu dicuci dengan air destilasi sampai permukaan air mencapai tanda tera. Campuran lalu dikocok dengan gas CO 2 secara perlahan-lahan dengan cara melewatkannya. Fermentasi Pakan. Tabung fermentor yang telah diisi dengan 500 mg sampel ransum, kemudian ditambahkan sesuai perlakuan dengan tepung ampas teh (0; 50; 100; 150) mg dan tepung daun kembang sepatu (0; 7,5; 15) mg diluar 500 mg sampel. Sampel perlakuan ditambahkan 10 ml cairan rumen dan 40 ml larutan Mc Dougal. Tabung fermentor dikocok dengan cara mengaliri gas CO 2 selama 30 detik (ph 6,5-6,9) dan ditutup dengan karet berventilasi. Tabung dimasukkan ke dalam shaker water bath dengan suhu 39 o C, dilakuan fermentasi selama 4 jam untuk sampel VFA, NH 3, dan pengukuran ph serta fermentasi 48 jam untuk sampel KCBK/KCBO. Menghentikan fermentasi tutup karet berventilasi dibuka dan ditetesi 2 tetes HgCl 2. Pengukuran ph. Sampel yang digunakan berasal dari proses fermentasi selama inkubasi 4 jam diukur dengan menggunakan ph meter. Nilai ph yang diambil merupakan nilai ph yang konsinten ditunjukkan ph meter. Pengukuran Konsentrasi NH 3 (Metode Mikrodifusi Conway). Konsentrasi N-amonia dalam cairan rumen diukur dengan metode mikrodifusi Conway (General Laboratory Prosedurs, 1966). Supernatan sampel yang merupakan hasil sentrifuge 3500 rpm selama 15 menit sebanyak 1 ml diletakkan dalam satu sisi sekat conway dan pada posisi sekat lainnya diletakkan 1 ml larutan Na 2 CO 3 jenuh. Posisi cawan conway dimiringkan agar kedua larutan tersebut tidak bercampur sebelum cawan ditutup rapat. Pada bagian tengah diletakkan 1 ml asam borat berindikator. Pada tepi cawan dan penutupnya diolesi vaselin agar tertutup rapat. Kemudian cawan diletakkan mendatar sehingga larutan Na 2 CO 3 jenuh bercampur dengan supernatan dan dalam reaksi tersebut dilepaskan gas amonia. Amonia yang dibebaskan akan 21
segera ditangkap oleh asam borat. Proses ini akan berlangsung sempurna setelah 24 jam, kemudian asam borat dititrasi dengan H 2 S0 4 0,005 M sampai terjadi perubahan warna dari biru ke merah (warna awal asam borat). Kadar amonia dapat dihitung dengan rumus: N NH 3 (mm) = ml H 2 SO 4 x N H 2 SO 4 x 1000 g sampel x BKsampel Pengukuran Konsentrasi VFA Total dan Parsial. Pengukuran produksi VFA total dan parsial (asam asetat, propionat, butirat, iso butirat, valerat dan iso valerat) dilakukan dengan menggunakan alat Gas Chromatography (GC). Sampel VFA parsial yang digunakan berasal dari proses fermentasi dengan inkubasi 4 jam yang diambil sebanyak 1,5 ml ke dalam tabung eppendorf dan phnya diturunkan sampai ph 3 dengan tujuan untuk menstabilkan sampel yang akan diukur gasnya. Selanjutnya dilakukan proses proteinase dengan cara menambahkan 30 mg asam sulfosalisinat pada setiap sampel kemudian disentrifuge selama 10 menit pada 1200 rpm pada suhu 7 o C. Proses proteinase bertujuan untuk mengendapkan protein sampel karena dapat mengganggu analisa. Selanjutnya sampel dianalisa dengan cara menginjekkan 0,6 µl sampel pada GC. Dengan membaca kromatogram standar acuan VFA yang konsentarsinya sudah diketahui maka konsentrasi VFA yang akan diukur dapat dilihat pada kromatogram yang terdapat pada layar monitor (area). Kandungan VFA sampel dapat diketahui dengan cara menghitung data dengan rumus: mmol sampel = AreaContoh x AreaS tan dar 1000 BobotMolek ul Pengukuran KCBK dan KCBO (Tilley & Terry, 1963). Pembuatan Larutan Pepsin. Sebanyak 2,8 gram pepsin dilarutkan dalam 850 ml aquadest, kemudian ditambahkan 17,8 ml HCL pekat dan campuran dimasukkan ke dalam labu takar. Air ditambahkan hingga permukaan mencapai tanda tera 1000 ml. Pengukuran KCBK dan KCBO. Sampel dalam tabung fermentor yang sudah diinkubasi 48 jam dan ditetesi HgCl 2, kemudian disentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit. Supernatan dan endapan dipisahkan, kemudian endapan yang terbentuk ditambah 50 ml larutan pepsin-hcl. Campuran tersebut diinkubasi selama 48 jam tanpa tutup karet. Setelah 48 jam campuran endapan-pepsin disaring dengan menggunakan 22
kertas saring Whatman No.41 dengan bantuan pompa vakum. Hasil saringan (residu) dimasukkan kedalam cawan porselen yang sebelumnya sudah diketahui bobot kosongnya. Bahan kering diperoleh dengan cara mengeringkan sampel dalam oven 105 0 C selama 24 jam. Selanjutnya bahan dalam cawan diabukan dalam tanur listrik selama 6 jam pada suhu 600 o C. Sebagai blanko digunakan residu asal fermentasi tanpa sampel. Koefisien Cerna Bahan Kering (KCBK) dan Koefisien Cerna Bahan Organik (KCBO) diitung dengan rumus : % KCBK = BKsampel ( g) ( BKresidu ( g) ( BKblanko ( g)) BKsampel ( g) x 100% % KCBO = BOsampel ( gr) ( BOresidu ( gr) BOblanko( gr)) x 100% BOsampel ( g) Prosedur Pengukuran Gas Test (Close & Menke, 1986) Pembuatan Larutan Media. Larutan mineral mikro 0,1 ml (13,2 gr CaCl 2 2H 2 O+10 gr MnCl 2 4H 2 O+ 1,0 gr, CoCl 2 6H 2 O+8,0 gr FeCl 3 6H 2 O+aquades hingga volumenya 100 ml), larutan buffer rumen 200 ml (4,0 gr NH 4 HCO 3 + 35,0 gr NaHCO 3 + aquades hingga volumenya 1000 ml), larutan makro 200 ml (5,7 gr Na 2 HPO 4 anhydrous + 6,2 g KHPO 4 anhydrous + 0,6 g MgSO 4.7H 2 O, dan ditambah dengan aquadest hingga mencapai volume 1000 ml), larutan resazurin 0,1% (w/v)1,0 ml, larutan pereduksi 40 ml (4,0 ml NaOH 1 N + 625 mg Na 2 S.9H 2 ) ditambah 95 ml aquades. Persiapan Sampel Gas Test. Piston syringe Hohenheim 100 ml diberi vaselin, kemudian 230 mg ransum perlakuan (60% Hijauan : 40% Konsentrat) ditambahkan sesuai perlaukan dengan tepung ampas teh (0; 23; 46; 69) mg dan tepung daun kembang sepatu (0; 0,35; 0,70) mg diluar 230 mg ransum perlakuan. Kemudian sampel dimasukkan ke dalam syringe dan piston. Larutan media yang sudah diaduk dan dialiri gas CO 2 ditempatkan dalam waterbath 39 o C. Selanjutnya satu bagian cairan rumen dicampur dengan dua bagian media dan diaduk dengan magnetic stirer lalu disimpan dalam waterbath dan dialiri gas CO 2. Sebanyak 30 ml campuran cairan rumen dan media dimasukkan pada masing-masing syringe menggunakan pipet. Udara yang ada didalam syringe dikeluarkan dan klep syringe ditutup. Posisi piston pada waktu sebelum inkubasi dicatat (Gb 0 ). Piston diinkubasi dalam waterbath 23
selama 48 jam dan pencatatan posisi piston dilakukan pada jam ke 2, 4, 8, 12, 24, dan 48 jam. Rumus Produksi Gas diukur dengan : Gb (ml/200mgbk,24 jam) = ((Gb24-Gb0)-(Gb24 blanko-gb0 blanko) x 200 x ((FH+FC)/2) / BK bahan) Produksi gas standar : FH (hijauan) dan FC (konsentrat) diasumsikan = 1 Rancangan Percobaan dan Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Kelompok (RAK) pola faktorial 4 x 3 dengan 3 ulangan. Faktor pertama adalah level ampas teh (0; 1; 2; 3 mg/ml cairan rumen) dan faktor kedua adalah daun kembang sepatu (0; 0,15; 0,30 mg/ml cairan rumen) (Gambar 10). Pengelompokan berdasarkan waktu pengambilan cairan rumen. Peubah yang diamati nilai ph, konsentrasi NH 3, konsentrasi VFA total & parsial, KCBK dan KCBO serta produksi gas. 0 DKS 0 AT 0,15 DKS 0,30 DKS Ransum (H:K = 60:40%) 0 DKS 1 AT 0,15 DKS 0,30 DKS 0 DKS 2 AT 0,15 DKS 0,30 DKS Model matematik adalah sebagai berikut : 0 DKS 3 AT 0,15 DKS 0,30 DKS Gambar 10. Desain Rancangan Percobaan Y ijk = µ + α i + β j +α i β j + k + ijk Keterangan: Y ijk = nilai faktor A ke-i, faktor B ke-j, dan pengamatan kelompok ke-k µ = nilai rataan umum α i β j α i β j = pengaruh faktor A (taraf pemberian tepung ampas teh) ke-i = pengaruh faktor B (permberian tepung daun kembang sepatu) ke-j = pengaruh interaksi faktor A ke-i dan faktor B ke-j 24
k = pengaruh kelompok (cairan rumen) ke-k ijk = galat percobaan untuk faktor A ke-i, faktro B ke-j & kelompok ke-k Data yang diperoleh dianalisis secara statistik menggunakan analisis ragam analysis of variance (ANOVA) dan jika terdapat perbedaan nyata di antara perlakuan maka dilakukan uji jarak DUNCAN (Mattjik dan Sumertajaya, 2002). Analisis data dilakukan menggunakan software statistik SPSS 16. 25