MATERI DAN METODE PENELITIAN

18 MATERI DAN METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Embriologi, Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Stem Cell and Cancer Institute, Pulomas, Jakarta. Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret 2009 hingga Desember 2009, dengan penelitian pendahuluan dilaksanakan dari bulan Juni 2008 sampai dengan Februari 2009. Rancangan Percobaan Diferensiasi ESC menjadi sel beta pankreas dirancang menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan tiga kali pengulangan. Perlakuan yang dilakukan adalah pengkulturan ESC dengan medium yang mengandung CM dengan konsentrasi 0%, 10%, 30%, dan 50%. Parameter yang diamati adalah diferensiasi ESC menjadi sel beta pankreas dengan cara pengamatan langsung setelah hari ke-21 pada sel yang berwarna merah setelah pewarnaan dithizone serta kemampuan ekspresi dari gen yang bertanggung jawab menghasilkan insulin yaitu gen proinsulin 1 dan proinsulin 2 yang mengekspresikan adanya produksi insulin pada sel beta pankreas. Hasil positif analisa mrna dilihat secara kualitatif dari intensitas pita hasil RT-PCR pada gel agarose. Tahapan dan Prosedur Kerja Pembuatan Conditioned Medium Conditioned medium (CM) diperoleh dari supernatan medium kultur primer pankreas mencit dewasa. Kultur primer pankreas dilakukan sesuai dengan Katdare et al. (2004) dan Leng & Lu (2005) dengan modifikasi. Pankreas diisolasi dari mencit usia 8 minggu yang dikorbankan secara cervicalis dislocation. Setelah diisolasi pankreas dicuci dengan larutan Dulbecco s Phosphate Buffer Saline (DPBS) (Gibco, USA) yang mengandung 5μl/ml penicillin-streptomycin (Sigma, USA) dan dicacah hingga berukuran 1-2 mm menggunakan pisau bedah. Hasil cacahan dicuci dengan DPBS dan diinkubasi

19 dalam larutan DPBS yang mengandung 112,25 units/ml colagenase (Sigma, USA) selama 10 menit pada suhu 37 C. Suspensi sel kemudian disaring menggunakan penyaring nilon (nylon strainer) berukuran 100 μm. Supernatan yang diperoleh kemudian disentrifuse dengan kecepatan 200g selama 10 menit. Pelet yang diperoleh lalu dicuci dengan DPBS sebanyak 3 kali dan 1 kali dengan Dulbecco s Modified Eagle s Medium (DMEM)/Ham s F12 (Sigma, USA). Pelet kemudian dikultur selama 7 hari dalam medium DMEM/Ham s F12 yang mengandung fetal bovine serum (FBS) 20% (Sigma, USA), non-essential amino acids (NEAA) 1% (Sigma, USA), β-mercaptoethanol 0.1 mm (Sigma, USA), penicillin-streptomycin (Sigma, USA) 5μl/ml. Setelah 7 hari sel kemudian dikultur dalam medium tanpa serum hingga hari ke 21. Pengkoleksian CM dilakukan mulai hari ke 9 hingga 21 dengan interval setiap 48 jam. Conditioned medium yang diperoleh lalu difilter dengan millipore berukuran 0.22 μm dan disimpan berupa aliquot pada suhu -18 C sebelum digunakan sebagai perlakuan. Penyediaan Embryonic Stem Cell a. Superovulasi dan Koleksi Embrio Tahap Blastosis Mencit yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit putih (Mus musculus) betina galur ddy berumur 8-12 minggu dengan jumlah 10 ekor pada tiap ulangan. Metode superovulasi dan koleksi embrio dilakukan sesuai dengan Nagy et al. (2003). Mencit betina disuperovulasi dengan cara menyuntikkan 7.5 IU hormon Pregnant Mare s Serum Gonadotropin (PMSG, Folligon, Intervet, Holland) diikuti dengan penyuntikan 7.5 IU hormon human Chorionic Gonadotrophin (hcg, Chorulon, Intervet, Holland) dengan interval 46-48 jam kemudian. Kedua penyuntikan tersebut dilakukan secara intraperitonial. Setelah penyuntikan hcg mencit betina kemudian disatukan dengan mencit jantan selama 1 malam agar terjadi perkawinan, perbandingan mencit betina : jantan yaitu 1 : 1. Keesokan harinya dilakukan pemeriksaan vagina plug, penanda telah terjadinya kopulasi. Mencit-mencit yang memiliki vagina plug kemudian disatukan dan dilakukan isolasi embrio pada hari ke-4 setelah penyuntikan hcg. Embrio diisolasi dengan membilas/flushing kedua uterus menggunakan DPBS yang

20 mengandung FBS 1%. Embrio kemudian diisolasi menggunakan pipet pasteur dan mikroskop stereo (Nikon, SMZ-2T, Japan). Pencucian dan pengkulturan embrio dilakukan dalam medium kultur berupa drop-drop mikro bervolume 40 μl yang diatasnya telah dilapisi dengan mineral oil (Sigma, USA). Embrio kemudian dikultur selama 24 jam dalam medium DMEM yang mengandung FBS (Sigma, USA) 10%, penicillin-streptomycin (Sigma, USA) 5μl/ml, non-essential amino acids (Sigma, USA) 1%, dan β-mercaptoethanol 0.1 mm sebelum dilakukan pengisolasian inner cell mass/ ICM. b. Isolasi Inner Cell Mass Isolasi ICM dilakukan sesuai dengan metode Nagy et al. (2003) dan Kim et al. (2005). Pada embrio tahap blastosis yang masih memiliki zona pelucida dilakukan pelisisan zona dengan menginkubasi blastosis dalam DPBS yang mengandung enzim pronase 0.25% (Sigma, USA) selama 7-10 menit atau hingga zona pelucida menghilang. Blastosis kemudian dicuci dalam medium kultur yang mengandung serum untuk menghentikan kerja enzim pronase. Sebelum dilakukan isolasi ICM, blastosis terlebih dahulu dicuci dalam medium tanpa serum. Isolasi ICM dilakukan dengan menggunakan metode immunosurgery. Blastosis diinkubasi dalam DMEM yang mengandung rabbit anti-mouse serum (Sigma, USA) 25% selama 90 menit, kemudian dicuci dalam DMEM tanpa serum dan diinkubasi kembali dalam DMEM yang mengandung guinea pig complement (Sigma, USA) 25% selama 90 menit. Proses isolasi ICM kemudian dilanjutkan dengan melakukan pemipetan berulang dan pencucian untuk menghilangkan selsel trofoblas yang masih melekat. ICM yang diperoleh kemudian dikultur dalam medium kultur ESC. c. Kultur dan Pasase Embryonic Stem Cell Inner cell mass dikultur dalam medium DMEM-high glucose (Sigma, USA) yang mengandung non-essential amino acid 1%, FBS 10%, penicillinstreptomycin (Sigma, USA) 5μl/ml, mercaptoethanol (Sigma, USA) 0,1 mm, Leukimia Inhibitory Factor/LIF (Sigma, USA) 20 ng/ml. Kultur ICM dilakukan pada petri 4-well (Nunc, Denmark) yang sebelumnya telah dilapisi dengan gelatin 0,1% (SIGMA, USA). Penggantian medium kultur dilakukan setiap 48 jam (Roach & McNeish 2002).

21 d. Pewarnaan Alkaline Phosphatase Koloni-koloni ESC terlebih dahulu dicuci dengan DPBS sebanyak 2 kali sebelum dilakukan fiksasi. Proses fiksasi dilakukan dengan menginkubasi ESC dalam DPBS yang mengandung paraformaldehide 4%selama 20 menit pada suhu ruang. Setelah difiksasi, ESC kemudian dicuci sebanyak 2 kali menggunakan DPBS. Embryonic stem cells yang telah difiksasi lalu diinkubasi dalam larutan substrat alkaline phosphatase (AP) yang mengandung naphtol AS-MX phosphate (Sigma, USA) 200 μg/ml dan Fast Red TR Salt (Sigma, USA) 1 mg/ml dalam Tris Buffer 100 mm dengan ph 8.2 selama 30 menit pada suhu ruang. Embryonic stem cells kemudian dicuci dengan DPBS. Embryonic stem cells yang positif mengandung enzim AP akan berwarna merah yang menandakan bahwa sel-sel tersebut masih bersifat pluripoten (Kitiyanant et al. 2000). Pengarahan Embryonic Stem Cells Menjadi Sel Beta Pankreas Diferensiasi ESC menjadi sel penghasil insulin dilakukan sesuai dengan protocol Schroeder et al. (2006) yang telah dimodifikasi. Embryonic stem cells terlebih dahulu dicuci dengan DPBS sebanyak 2 kali dan diinkubasi dengan DPBS yang mengandung trypsin/edta 0.25% selama 3 menit pada suhu 37 C, lalu ditambahkan medium kultur yang mengandung FBS 15%. Populasi sel kemudian dihomogenkan menggunakan pipet hingga menjadi sel-sel tunggal atau cluster-cluster kecil. Sel lalu dikultur pada cawan petri yang telah dilapisi dengan gelatin (Sigma, USA) 0.1% dan dikultur selama 48 jam dalam medium kultur yang mengandung serum. Setelah 48 jam sel kemudian dicuci dengan medium kultur tanpa serum dan dikultur selama 14 hari dalam medium pengarahan, yaitu medium yang mengandung CM dengan konsentrasi volume per volume (v/v) 0%, 10%, 30% dan 50%. Analisa Sel Beta Pankreas Untuk mendeteksi adanya sel beta yang terbentuk dilakukan pewarnaan dithizone (Sigma, USA) sesuai dengan Shiroi et al. (2002). Larutan stok dithizone dibuat dengan melarutkan 50 mg dithizone dengan 5 ml dimethyl sulfoxide (DMSO) (SIGMA, USA) dan disimpan dalam suhu -18 C. Untuk

22 membuat larutan pewarnaan, 10 μl larutan stok diencerkan dengan 1ml DPBS kemudian difilter menggunakan mikrofilter berukuran 0.22 μm. Sebelum dilakukan pewarnaan sel dicuci terlebih dahulu dengan DPBS. Pewarnaan kemudian dilakukan dengan menginkubasi sel selama 15 menit dalam larutan pewarnaan pada suhu 37 C. Sel kemudian dicuci dengan DPBS dan diamati dengan mikroskop. Sel-sel yang positif (sel beta pankreas yang mengandung insulin) akan terlihat berwarna merah dengan pewarnaan tersebut. Kemampuan Ekspresi Gen Insulin Untuk membuktikan adanya ekspresi gen insulin pada sel beta pankreas yang dihasilkan dari pengarahan ESC dilakukan deteksi mrna dari insulin 1 dan insulin 2 dengan metode Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT- PCR). Kedua gen tersebut merupakan gen yang menghasilkan hormon insulin pada sel beta pankreas. Setelah dilakukan kultur selama 14 hari, sel kemudian dicuci dengan DPBS dan diinkubasi dengan 1 ml Trizol (Invitrogen) selama 5 menit. Seluruh supernatan kemudian dipindahkan ke dalam tabung berukuran 2 ml dan ke dalamnya ditambahkan kloroform sebanyak 200 μl. Kemudian dihomogenkan dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Larutan kemudian disentrifus dengan kecepatan 12000 g selama 15 menit pada suhu 4 C. Supernatan berupa cairan bening dipindahkan ke dalam tube baru berukuran 1.5 ml dan ditambahkan dengan isoprophil alkohol (isopropanol) sebanyak 500 μl, dicampur hingga homogen dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Larutan kemudian disentrifus dengan kecepatan 12000g selama 10 menit pada suhu 4 C. Supernatan kemudian dibuang dan pada pelet yang diperoleh ditambahkan etanol DEPCdH 2 O sebanyak 1 ml, divortex hingga homogen dan disentrifus dengan kecepatan 7500g selama 5 menit pada suhu 4 C. Supernatan kemudian dibuang dan RNA dikeringkan selama 15-20 menit pada suhu ruang. Pada RNA yang telah kering ditambahkan RNAse free water 30 μl dan siap digunakan atau disimpan pada suhu -80 C hingga dilakukan RT-PCR.

23 Reaksi reverse transcription dilakukan menggunakan Transcriptor (Roche) dan reaksi PCR dilakukan menggunakan Go Tag Green Mastermix (Promega, USA). Primer yang digunakan adalah b-actin (kontrol), proinsulin 1 dan proinsulin 2 (Tabel 1). Tabel 1. Primer yang digunakan dalam RT-PCR Primer Sekuen basa Produk 1 Beta Actin (F) 5 TTC TTT GCA GCT CCT TCG TTG CCG 3 457bp Beta Actin (R) 5 TGG ATG GCT ACG TAC ATG GCT GGG 3 2 Proinsulin 1 (F) 5 GTT GGT GCA CTT CCT ACC CCT G 3 300bp Proinsulin 1 (R) 5 GTA GAG GGA GCA GAT GCT GGT G 3 3 Proinsulin 2 (F) 5 GTG GAT GCG CTT CCT GCC CCT G 3 300bp Proinsulin 2 (F) 5 GTA GAG GGA GCA GAT GCT GGT G 3 Sumber: Shiroi et al. 2005, Schienda J et al. 2006. Total campuran pada reaksi awal transkripsi adalah 13 μl yang terdiri dari Anchored-oligo (dt) primer 1 μl, total RNA 7 μl, dan water-pcr grade 7 μl. Campuran kemudian dihomogenkan lalu diinkubasi pada suhu 65 C selama 10 min. Setelah itu campuran langsung didinginkan dalam es dan ditambahkan dengan Transcriptor buffer 4 μl, RNase inhibitor 0.5 μl, Deoxynucleotide 2 μl, dan Transcriptase 0.5 μl hingga volume total campuran menjadi 20 μl. Campuran kemudian dihomogenkan dan dimasukkan ke dalam mesin PCR (GeneAmp PCR System 9600) serta diinkubasi pada suhu 50 C selama 60 menit diikuti dengan pemanasan pada suhu 85 C selama 5 menit. cdna yang dihasilkan kemudian langsung digunakan sebagai cetakan atau template pada reaksi PCR atau disimpan pada suhu -80 C. Pada reaksi PCR, total campuran terdiri dari Go tag green mastermix 12.5 μl, primer sense 1.25 μl, primer antisense 1.25 μl, DNA template 5 μl, dan Nuclease-free water 5 μl sehingga total volume yang diperoleh menjadi 25 μl. Campuran tersebut kemudian dihomogenkan lalu dimasukkan dalam mesin PCR. Reaksi PCR dilakukan sebanyak 35 siklus dengan suhu denaturasi awal 95 C selama 2 menit, suhu denaturation 95 C selama 45 detik, suhu annealing (b-actin

24 dan insulin 1: 62 C dan insulin 2: 64 C) selama 45 detik, suhu extension 72 C selama 1 min dan final extension 72 C selama 5 menit (Lampiran 1). Produk PCR kemudian dianalisa menggunakan gel agarose dengan konsentrasi agarose 2.5% yang mengandung Ethidium Bromide (EtBr) 1.25 μl/ml. Produk PCR yang dianalisa dalam setiap proses elektroforesis adalah 10 μl pada sampel dan 4μl pada kontrol. Elektroforesis dilakukan pada voltase 95 volt selama 60 menit menggunakan gel electrophoresis system (Bio Rad). Hasil elektroforesis kemudian dibaca menggunakan Gbox XT (Eppendorf). Analisa Data Semua data kualitatif disajikan secara deskriptif, sedang data-data kuantitatif akan diuji secara statistik menggunakan ANOVA (Analysis of Variance), dan dilanjutkan dengan uji LSD (Least Significant Difference) untuk menentukan beda nyata antar perlakuan. Analisa menggunakan software SPSS 17.0 for Windows dan MS Office Excell 2007.