BAB I PENDAHULUAN Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawasenyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan proteinprotein dalam cairan fisiologis; menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi. Pada HPLC terdapat injektor yang merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom. Injeksi sampel untuk dianalisis dengan metoda HPLC merupakan tahap yang penting, karena meskipun kolom telah memadai, hasil kromatogram yang ditampilkan tidak akan memadai kalau injeksi sampel tidak dilakukan dengan tepat. Keadaan ini akan menjadi suatu keharusan apabila yang dituju analisis kuantitatif dengan HPLC. Kebanyakan pemasukan cuplikan kedalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukan harus sekecil mungkin, beberapa puluh microliter. Teknik pemasukan cuplikan kedalam sistem HPLC melalui injeksi srynge, injeksi stop-flow, dan kran cuplikan. Oleh sebab itu, dalam makalah ini akan dibahas berbagai sistem injektor HPLC yang umum dipakai.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA I. Injektor/ Injection Port Injektor merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom. Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Pada alat HPLC biasanya dilengkapi dengan penyampel otomatis (automatic sampler). Penyampel otomatis dapat diprogram untuk mereaksikan atau menginjeksikan sampel. Volume sampel berkisar dari 1-5 µl. Injektor yang baik harus mudah digunakan dan dapat bekerja walaupun ada tekanan balik. Injeksi sample seluruhnya otomatis. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas, maka tidak akan diketahui apa yang terjadi pada tingkat dasar.
1.1 Injeksi syringe Alat untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500psi. Akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit labih baik dari 2-3% dan sering lebih jelek. Gambar 1. Syringe 1.2 Injeksi stop-flow Injeksi stop-flow adalah jenis injeksi syringe kedua tapi disini aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung kedalam ujung kolom. Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali. 1.3 Kran cuplikan/loop Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk memasukan cuplikan kedalam aliran fasa gerak perlu dua langkah: a. Sejumlah volume cuplikan disuntikkan kedalam loop dalam posisi load, cuplikan masih berada dalam loop. b. Kran diputar untuk mengubah cuplikan load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat diganti-
ganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga 500 µl. Dengan sistem pemasukan cuplikan ini memungkinkan memasukan cuplikan pada tekanan 7000psi dengan ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia dengan volume 0,5 hingga 5µL. Injektor : Gambar 2. Tipe injector katup putaran Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin Mudah digunakan Keberulangan tinggi Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik II. Fase Gerak (Mobile phase) Berupa zat cair yang disebut eluen (pelarut) dalam HPLC, fasa gerak selain bertugas membawa komponen-komponen campuran menuju detektor, juga dapat berinteraksi dengan solut-solut. Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan berikut:
a. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis. b. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatogram. c. Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom. Biasanya pelarut disaring dengan saringan nilon berukuran diameter 0,45µm. Pompa vakum biasanya digunakan untuk menyaring partikel kotoran sekaligus menghilangkan gas dari pelarut karena gas dapat mengganggu base line. d. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun. e. Zat cair tidak kental. Umumnya keketalan tidak melebihi 0,5 cp (centi Poise). f. Sesuai dengan detektor. Pemilihan zat cair sebagai fasa gerak ini merupakan hal yang kritis dalam keberhasilan pemisahan. Sayangnya, teori interaksi fasa gerak dengan sejumlah solut kurang jelas sehingga para pakar hanya dapat memilih sekelompok pelarut. Jadi, pada akhirnya, pemilihan fasa gerak didasarkan atas eksperimen trial and error dengan berbagai jenis dan krom posisi pelarut hingga diperoleh kromatogram yang diharapkan. Dengan kata lain, fasa gerak yang baik memberikan faktor kapasitas k pada rentang yang sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaliknya dicari fasa gerak yang memberikan k antara 2-5. Sedangkan untuk campuran multikomponen,
waktu cukup untuk pemisahan semua komponen. Biasanya beberapa pelarut atau kombinasi pelarut dapat ditemukan untuk memberikan faktor kapasitas yang cocok. Pemilihan pelarut-pelarut juga bergantung pada faktor selektifitas (α) untuk komponen cuplikan. Gelembung udara (degassing) yang ada harus dihilangkan dari pelarut, karena udara yang terlarut keluar melewati detektor dapat menghasilkan banyak noise sehingga data tidak dapat digunakan. Jenis fasa gerak berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak: a. HPLC fasa normal: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam polar dan fasa gerak non-polar. Fasa diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fasa gerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter. b. HPLC fasa terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam non-polar dan fasa gerak polar. Fasa gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril. Fasa gerak yang baik memberikan factor kapasitas k
pada rentang yang sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fasa gerak yang memberikan k antara 2-5. Wadah fase gerak Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing ( penghilangan gas ) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut untuk fase gerak, maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut, buffer, reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi, dan lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk KCKT berderajat KCKT (HPLC grade). Adanya pengotor dalam dapat terkumpul dalam kolom atau dalam tabung yang sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut. Karenanya, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini (Rohman, 2007). III. Kolom dan Fase Diam Jenis HPLC Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika
fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut: 1. Kromatografi Adsorbsi Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor. 2. Kromatografi fase terikat Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang
digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbonhidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan ph sangat krusial karena kalau ph fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat. 3. Kromatografi penukar ion KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar
ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh ph fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin. 4. Kromatografi Pasangan ion Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. 5. Kromatografi Eksklusi Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekulmolekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh
lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain. 6. Kromatografi Afinitas Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks. Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni: Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100 μl/menit).
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis. Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagenreagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.
Ada dua perbedaan dalam HPLC, dimana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam yaitu (Anonim, 2007): a) Fase normal HPLC Ini secara esensial sama dengan kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4,6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. b) Fase balik HPLC Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut (Anonim, 2007). Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawasenyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom (Anonim, 2007). Types of Compounds Mode Stationary Phase Neutrals Weak Acids Weak Bases Reversed Phase C18, C8, C4 cyano, amino Mobile Phase Water/Organic Modifiers Ionics, Bases, Acids Ion Pair C-18, C-8 Water/Organic Ion-Pair Reagent Compounds not soluble in water Normal Phase Silica, Amino, Cyano, Diol Organics
http://nakhdiahsaisal.blogspot.com/2011/12/kromatografi-cair-kinerja-tinggihplc.html http://informasitips.com/kromatografi-pengertian-dan-jenisnya http://lansida.blogspot.com/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html http://www.artikelkimia.info/cara-kerja-hplc-21532201072011 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Atau Hplc (High Performance Liquid Chromatography) MAKALAH Fajar Mahda A.S (4301408024) Diah Ika Rusmawati (4301408054) Santi Budiarti (4301408069) JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG 2010