3. HASIL PENELITIAN 3.1. Fermentasi Asinan Rebung Rebung yang digunakan untuk asinan rebung ialah rebung jenis rebung kuning bambu betung (Dendrocalamus asper) dengan kualitas yang baik (Gambar 5a). Fermentasi untuk menjadi asinan rebung dilakukan dengan penambahan larutan garam 5% dan pada kondisi anaerob. Pada akhir proses fermentasi asinan rebung akan menghasilkan bau asam dan ph berubah menjadi 4,2 (Gambar 5b). (a) (b) Gambar 5. Bahan baku pembuatan asinan rebungrebung kuning bambu betung(dendrocalamus asper) (a)asinan rebung yang digunakan sebagai substrat pertumbuhan bakteri asam laktat dan telah melalui proses fermentasi hingga ph dibawah 4,5 (b). 18
19 3.2. Isolasi Bakteri Asam Laktat (BAL) dariasinanrebung Bakteri asam laktat diisolasi dari asinan rebung dengan cara ditumbuhkan pada media MRS agar yang mengandung 1% CaCO 3. Adanya bakteri asam laktat ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening disekitar bakteri. Bakteri asam laktat yang didapatkan kemudian dimurnikan pada media yang sama hingga membentuk koloni tunggal (Gambar 6). Zona Bening 1A4 KKoloni Tunggal Gambar 6. Koloni bakteri asam laktat hasil isolasi yang membentuk zona bening dan Koloni tunggal pada isolat 1A4
20 3.3. Identifikasi Bakteri Asam Laktat (BAL) dari Asinan Rebung Tabel 2. Hasil Tes Biokimia Identifikasi Bakteri Asam Laktat pada Asinan Rebung. Zona bening Pewarnaan Bentuk Bakteri Produksi Gas No Isolat GramSpora Katalase Motilitas 1 1A1 + Ungu Merah Basil - - - B 2 1A2 + Ungu Merah Basil - - - B 3 1A3 + Ungu Merah Basil - - - B 4 1A4 + Ungu Merah Basil - - - B 5 2A1 + Ungu Merah Basil - - + B 6 2A2 + Ungu Merah Basil - - + B 7 2A3 + Ungu Merah Basil - - - B 8 2A4 + Ungu Merah Basil - - - B 9 3A1 + Ungu Merah Basil - - - B 10 3A2 + Ungu Merah Basil - - - B 11 3A3 + Ungu Merah Basil - - - B 12 3A4 + Ungu Merah Basil - - - B 13 4A1 + Ungu Merah Basil - - + B 14 4A2 + Ungu Merah Basil - - - B 15 4A3 + Ungu Merah Basil - - + B 16 4A4 + Ungu Merah Basil - - + B 17 5A1 + Ungu Merah Basil - - - B 18 5A2 + Ungu Merah Basil - - - B 19 5A3 + Ungu Merah Basil - - + B 20 5A4 + Ungu Merah Basil - - + B 21 6A1 + Ungu Merah Basil - - + B 22 6A2 + Ungu Merah Basil - - - B 23 6A3 + Ungu Merah Basil - - + B Keterangan : + = positif / membentuk : - = negatif / tidak membentuk : B = bakteri asam laktat BAL Berdasarkan Tabel 3 diketahui bahwa dari 23 isolat bakteri yang diperoleh, semua isolat termasuk dalam bakteri asam laktat karena memiliki ciri-ciri: membentuk zona bening pada media MRS agar yang telah ditambahkan 1% CaCO 3, memiliki bentuk basil, Gram positif, tidak membentuk spora, katalase negatif, non motil, dan bersifat heterofermentatif, atau homofermentatif.
21 3.3.1. Identifikasi Bakteri Asam Laktat (BAL) Bedasarkan Pewarnaan Gram Pengecatan pewarnaan Gram dilakukan pada semua isolat yang membentuk zona bening. Pewarnaan ini dilakukan untuk mengetahui sifat Gram bakteri asam laktat. Bakteri Gram positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna ungu dan bakteri Gram negatif akan berwarna merah muda apabila dilihat dengan menggunakan mikroskop. Pengamatan pewarnaan Gram bakteri asam laktat dapat dilihat pada Gambar 7. Gambar 7. Hasil pengamatan pewarnaan Gram pada isolat 1A4 dengan mikroskop perbesaran 40 X 10 menunjukkan bakteri Gram positif (sel berwarna ungu). 3.3.2. Identifikasi Bakteri Asam Laktat (BAL) Berdasarkan Pewarnaan Spora Pengecatan spora dilakukan pada semua isolat, pengamatan ini juga dilakukan untuk melihat bentuk sel. Semua isolat yang mengalami pewarnaan endospora dan diamati dibawah mikroskop. Dua puluh tiga isolat diketahui bahwa seluruh isolat tidak berspora dan berbentuk basil/batang. Sel yang tidak berspora ditunjukan dengan hasil pewarnaan spora berwarna merah. Apabila sel berspora maka akan berwarna hijau. Hasil pengecatan spora dapat dilihat pada Gambar 8.
22 Gambar 8. Hasil pengamatan pewarnaan spora menunjukkan isolat 1A4 termasuk bakteri Gram positif dengan mikroskop pada perbesaran 10x100 3.3.3. Identifikasi Bakteri Asam Laktat (BAL) Berdasarkan Aktivitas Katalase Bakteri asam laktat merupakan bakteri yang tidak memiliki enzim katalase. Enzim katalase ialah enzim yang dapat mengkatalisasi atau menguraikan hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) menjadi air dan oksigen. Pengujian pada isolat dilakukan dengan menambahkan beberapa tetes H 2 O 2 pada koloni bakteri asam laktat. Apabila bakteri asam laktat memiliki enzim katalase ditandai dengan terbentuknya gelembung udara pada koloni dan sekitarnya. Berdasarkan Tabel 3 diatas dan Gambar 9 dapat dilihat bahwa 23 isolat tidak memiliki kemampuan menghasilkan enzim katalase (katalase negatif). Tidak terbentuk gelembung udara Gambar 9. Isolat 1A4 tidak memproduksi enzim katalase yang ditunjukkan dengan tidak terbentuknya gelembung gas pada koloni isolat serta pada sekitarnya.
23 3.3.4. Identifikasi Bakteri Asam Laktat (BAL) Berdasarkan Uji Motilitas Pengujan motilitas digunakan untuk mengetahui pergerakan dari bakteri. Bakteri asam laktat merupakan kelompok bakteri yang bersifat non-motil atau tidak bergerak. Bakteri non-motil hanya dapat tumbuh pada daerah di sekitar tusukan, sedangkan bakteri motil tumbuh menyebar pada media agar MRS semi padat. Berdasarkan tabel 3 serta gambar 10 menunjukan bahwa 23 isolat bakteri termasuk dalam kelompok non-motil. 2A1 1A4 Gambar 10. Hasil uji motilitas isolat 2A1 dan 1A4 bersifat non-motilyang ditandai dengan pertumbuhan bakteri di sekitar tusukan. 3.3.5. Identifikasi Bakteri Asam Laktat (BAL)Berdasarkan Produksi Gas Pengujian produksi gas pada semua isolat dilakukan untuk mengetahui tipe fermentasi dari bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat memiliki beberapa macam tipe fermentasi. Tipe fermentasi heterofermentatif akan menghasilkan gas pada tabung Durham, sedangkan tipe fermentasi homofermentatif tidak memproduksi gas. Berdasarkan Tabel 3, dari 23 isolat yang diamati, 9 isolat merupakan heterofermentatif dan 14 isolat yang lain merupakan bakteri asam laktat homofermentatif (Gambar 11).
24 Terdapat gelembung gas 2A1 1A4 (a)(b) Gambar 11. Isolat 2A1 menghasilkan gelembung gas pada tabung Durham (bakteri asam laktat dengan tipe fermentasi heterofermentatif)(a), Isolat 1A4 tidak menghasilkan gelembung gas pada tabung Durham (bakteri asam laktat dengan tipe fermentasi homofermentatif)(b). 3.3.6. Identifikasi Genus Bakteri Asam Laktat (BAL) Berdasarkan Kemampuan Pertumbuhan Bakteri pada Berbagai ph, Suhu, dan Kadar NaCl Bakteri asam laktat yang telah didapat dilanjutkan pada penentuan genus dari bakteri asam laktat tersebut. Penentuan genus dilakukan melalui pengujian kemampuan tumbuh bakteri pada berbagai suhu yaitu (10 0 C, 45 0 C, dan 50 0 C), ph (4,4, dan 9,6), serta NaCl (6,5% dan 18%). Kemampuan pertumbuhan dari bakteri ditunjukan dari kekeruhan yang terbentuk pada media (Tabel 3) dan (Gambar 12). Peningkatan kekeruhan dari media diamati berdasarkan nilai absorbansi pada jam ke-24 dan ke-48 (Lampiran 2).
25 Tabel 3. Hasil Pengujian Kemampuan Tumbuh Pada Berbagai Suhu, ph dan NaCl Nomor Isolat Suhu ( o C) NaCl (%) ph 10 45 50 6,5 18 4,4 9,6 Genus BAL 1 1A1 + + - + - + - Lactobacillus 2 1A2 + + - + - + - Lactobacillus 3 1A3 + + - + + + - ND 4 1A4 + - - + - + - Lactobacillus 5 2A1 + + - + - + - Lactobacillus 6 2A2 + - - - - + - Lactobacillus 7 2A3 + + - + + + - ND 8 2A4 + + - + - + - Lactobacillus 9 3A1 + + - - - + - Lactobacillus 10 3A2 + + - + - + - Lactobacillus 11 3A3 + + - + - + - Lactobacillus 12 3A4 + + - + + + - ND 13 4A1 + + - + - + - Lactobacillus 14 4A2 + - - + + + - ND 15 4A3 + + - + - + - Lactobacillus 16 4A4 + - - + + + - ND 17 5A1 + + - - - + - Lactobacillus 18 5A2 + + - - + + - ND 19 5A3 + + - + + + + ND 20 5A4 + + - + + + - ND 21 6A1 + + - + - + - Lactobacillus 22 6A2 + - - + + + - ND 23 6A3 + - - + - + - Lactobacillus Keterangan : + = tumbuh : - = tidak tumbuh : ND = not detected Berdasarkan Tabel 3 dapat terlihat bahwa 23 isolat yang diuji kemampuan tumbuh padaberbagai suhu, ph dan NaCl terdapat 14 isolat yang merupakan bakteri asam laktat genus Lactobacillus (Gambar 12). Bakteri asam laktat genus Lactobacillus memiliki ciri-ciri pertumbuhan spesifik yaitu tidak tumbuh pada kadar NaCl 18%, dan pada ph 9,6. Sedangkan 9 isolat bakteri asam laktat yang lain belum dapat teridentifikasi karena kurang sesuai dengan ciri-ciri genus bakteri asam laktat yang lain.
26 Kontrol 2A1 6A1 Kontrol 2A1 6A1 Kontrol 2A1 6A1 (a-i) (a-ii) (a-iii) Kontrol 2A1 6A1 Kontrol 2A1 6A1 (b-i) (b-ii) Kontrol 2A1 6A1 Kontrol 2A1 6A1 (c-i) (c-ii) Gambar 12. Isolat bakteri asam laktat 2A1 dan 6A1 dapat tumbuh pada 10 o C (a-i) dan 45 o C (a-ii) tetapi tidak pada 50 o C (a-iii); tumbuh pada NaCl 6,5% (b-i) dan tidak tumbuh pada NaCl 18% (b-ii); tumbuh pada ph 4,4(c-i), tetapi tidak tumbuh pada ph 9,6 (c-ii).
27 3.4. Aktivitas Antimikroba Bakteri asam laktat yang diperoleh kemudian dilanjutkan pengujian aktivitas antimikroba terhadap bakteri patogen Escherichia coli dan Staphylococcus aureus dengan metode difusi sumuran dapat dilihat pada Tabel 4 dan Gambar 13. Tabel 4. Hasil Pengukuran Zona Bening dari Isolat Bakteri Asam Laktat Terhadap Bakteri PatogenEscherichia coli dan Staphylococcus aureus Nomor Isolat Zona hambat ( mm ) Eschericia coli Staphylococcus aureus 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1A1 1A2 1A4 2A1 2A2 2A4 3A1 3A2 3A3 4A1 4A3 5A1 6A1 6A3 10,00 12,00 12,37 15,03 07,56 08,25 10,12 12,74 12,11 10,00 10,26 07,84 06,94 12,72 18,26 17,58 20,83 19,79 18,36 13,23 12,26 18,14 18,21 19,04 15,22 12,05 10,73 17,78 25 20 Zona Bening 15 10 5 Eschericia coli Staphylococcus aureus 0 Isolat Gambar 13. Aktivitas antimikroba isolat bakteri asam laktat terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus
28 Berdasarkan Tabel 4 dan Gambar 13 diatas dapat disimpulkan bahwa 14 isolat bakteri asam laktat genus Lactobacillus memiliki kemampuan antimikroba terhadap bakteri patogen Escherechia coli dan Staphylococcus aureus. Bakteri asam laktat yang memiliki kemampuan aktivitas antimikroba paling tinggi ialah pada isolat 1A4 dimana memiliki aktivitas penghambatan pada Staphylococcus aureus sebesar 20,83 mm. Sedangkan isolat yang memiliki aktivitas penghambatan paling besar terhadap Escherichia coli ialah isolat 2A1 sebesar 15,03 mm. Kemudian dari semua isolat dapat terlihat bahwa semua isolat memiliki kemampuan penghambatan terhadap bakteri patogen Staphylococcus aureus lebih baik dari pada bakteri patogen Escherichia coli. Kemampuan aktivitas antimikroba dari isolat bakteri asam laktat dapat terlihat dari terbentuknya zona bening di sekeliling lingkaran sumur (Gambar 14).
29 2A1 (a) 1A4 (b) Gambar 14. Zona hambat isolat bakteri asam laktat yang ditunjukan adanya zona bening terhadap Escherichia coli pada isolat 2A1 (lihat tanda panah) (a)dan zona hambat terhadap Staphylococcus aureus pada isolat 1A4 (lihat tanda panah) (b)