BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Ribosome Inactivating Protein (RIP) merupakan kelompok enzim tanaman yang memiliki kemampuan untuk menonaktifkan ribosom dengan memodifikasi 28S rrna melalui aktivitas N-glikosidase, yang dimanifestasikan dengan pemutusan ikatan N-glikosidik pada adenin tertentu. RIP dikenal memiliki kemampuan untuk membunuh sel kanker secara selektif tanpa harus mengganggu sel-sel normal. Mekanisme RIP dalam immunoterapi kanker menggunakan immunotoksin adalah dengan menginduksi apoptosis (Ikawati dkk., 2003). Mirabilis jalapa L atau tanaman bunga pukul empat merupakan salah satu contoh tanaman yang mengandung RIP. Berdasarkan pada proses pemurnian ditemukan bahwa tanaman M. jalapa L mengandung lebih dari satu RIP, yaitu basa dan asam (Sudjadi dkk., 2003). RIP basa (MJ-30) yang diperoleh dari pemurnian menggunakan CM-Sepharose CL-6B memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D dan MCF7 (Sismindari dkk., 2010). Fraksi tidak terikat yang bermuatan negatif disebut RIP asam (RIP MJ-C), selain dapat memotong ikatan DNA superkoil menjadi nick circular dan linear, juga memiliki efek sitotoksik yang lebih kuat dibandingkan dengan RIP MJ-30 (Sudjadi dkk., 2007). Pada penggunaannya, protein sebagai bahan obat memiliki stabilitas yang kurang baik karena protein mudah terdegradasi. Dalam sediaan parenteral banyak dipengaruhi oleh faktor-faktor yang dapat mengganggu 1
kestabilannya baik pada proses produksi, penyimpanan dan perjalanannya menuju target terapi. Faktor-faktor tersebut diantaranya adalah pelarut, ph, bahan tambahan yang digunakan dan suhu. Untuk meningkatkan stabilitas protein perlu adanya suatu sistem yang dapat melindungi protein dari pengaruh degradasi seperti sistem penghantaran obat berupa nanopartikel. Nanopartikel adalah partikel koloid dengan rentang ukuran partikel 10-1000 nm, membentuk dinding polimer atau secara keseluruhan merupakan matriks polimer (Rawat dkk., 2006). Penelitian mengenai nanopartikel sebagai sistem penghantaran obat telah banyak diteliti, diantaranya adalah penelitian tentang formulasi nanopartikel kitosan rantai pendek dan pektin yang mengemas protein RIP MJ (Pertiwi, 2014), nanopartikel kitosan rantai sedang pektin sebagai penghantar pada RIP MJ, dan RIP MJ yang dienkapsulasi nanopartikel kitosan viskositas rendah dengan alginat (Wicaksono, 2014). Penggunaan kitosan dan pektin sebagai sebagai pembawa dalam sistem penghantaran obat telah dikenal sejak mulai dikembangkannya sistem penghantaran obat bentuk baru. Kitosan merupakan salah satu polimer biodegradable yang berasal dari alam yang terdiri dari koopolimer glukosamin dan n-asetilglukosamin. Kitosan memiliki toksisitas yang rendah, memiliki sifat biokompatible, biodegradable sehingga cocok apabila digunakan dalam formulasi obat. Kompleksasi ionik memungkinkan untuk penggunaan dua macam biopolimer dalam satu sistem formulasi. Kedua biopolimer yang digunakan harus memiliki muatan yang berbeda, sehingga dapat membentuk matriks yang dapat mengenkapsulasi obat dengan baik, 2
misalnya kombinasi kitosan dan pektin. Pektin adalah salah satu polimer dari alam yang bersifat anionik yang dapat digunakan untuk membuat kompleks polielektrolit dengan kitosan. Dengan kombinasi kitosan pektin dalam formula nanopartikel diharapkan dapat mengemas protein dengan baik sampai ke target terapi. Pengembangan penghantaran obat tertarget bertujuan untuk meningkatkan selektivitas dan efektifitas obat yang diaplikasikan, misalnya pada obat kanker. Untuk meningkatkan keamanan penggunaan obat kanker dan untuk mencegah obat bereaksi pada tempat yang tidak diharapkan, sehingga berdampak pada matinya sel normal, maka salah satu upaya yang dikembangkan adalah dengan memanfaatkan protein sebagai konjugat pada suatu pembawa (drug carrier) yang sesuai dengan reseptor yang dimiliki sel kanker pada permukaan nanopartikel. Contoh penelitian tentang nanopartikel yang dikonjugasikan pada suatu molekul pentarget diantaranya adalah PLGA-b-PEG berisi cisplatin yang dikonjugasikan dengan molekul pentarget A10 (Dhar dkk., 2011). Nanopartikel yang dikonjugasikan dengan A10 RNA yang diimobilisasi pada permukaan nanopartikel supermagnetik besi-oksida (Min dkk., 2011). Kedua sistem tersebut ditujukan sebagai kandidat terapi tertarget pada kanker prostat (Ozalp dkk., 2011). Kombinasi dari sistem yang telah dibentuk dapat dijadikan acuan dalam mencari kombinasi baru untuk kebutuhan penghantaran lain dengan target yang sama. Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) merupakan monomer membran glikoprotein yang terdapat dalam epitel manusia normal. EpCAM berfungsi sebagai penanda molekular antara sel kanker dan sel normal. EpCAM mengalami ekspresi 3
yang berlebih pada kanker payudara (Osta dkk., 2004). Dengan pemberian antibodi anti EpCAM pada suatu nanopartikel dapat menghambat ekspresi EpCAM. Antibodi anti EpCAM yang dikonjugasikan pada nanopartikel sebagai pembawa RIP dapat membentuk sistem penghantaran obat yang tertarget dan dapat membawa RIP mencapai target tanpa merusak sel normal. Uji sitotoksik nanopartikel RIP MJ terkonjugasi anti EpCAM AUA-1 terhadap sel kanker payudara T47D menunjukkan bahwa nanopartikel RIP MJ terkonjugasi anti EpCAM AUA-1 pada konsentrasi RIP MJ 33,33 µg/ml memberikan nilai persen kematian sebesar 17,22% (Pertiwi, 2014). Pada penelitian ini dilakukan purifikasi RIP MJ menggunakan kolom CM Sepharose CL-6B menghasilkan RIP MJ-C. Untuk menjaga kestabilan RIP MJ-C, dilakukan enkapsulasi menggunakan polimer kitosan rantai pendek dan pektin metilasi rendah yang dikonjugasikan dengan antibodi anti EpCAM jenis 9C4, selanjutnya dilakukan uji sitotoksik terhadap sel T47D, sehingga diharapkan akan diperoleh nilai persen kematian sel yang lebih besar dari 17,22% dengan konsentrasi protein yang lebih kecil dari 33,33 µg/ml. 1. Rumusan Masalah Dalam penelitian ini terdapat beberapa rumusan masalah, yaitu : a. Apakah nanopartikel dengan polimer kitosan rantai pendek dan pektin metilasi rendah yang terkonjugasi antibodi anti EpCAM 9C4 dapat mengenkapsulasi RIP MJ-C? 4
b. Bagamanakah karakteristik fisik nanopartikel RIP MJ-C kitosan pektin yang meliputi morfologi nanopartikel, ukuran partikel, zeta potensial, indeks polidispersitas dan efisiensi enkapsulasi? c. Bagaimanakah efek sitotoksik yang dihasilkan dari nanopartikel RIP MJ-C yang dikonjugasikan dengan antibodi anti EpCAM 9C4 terhadap sel kanker payudara T47D? 2. Keaslian Penelitian Penelitian mengenai RIP dari daun M.jalapa L telah banyak diteliti, diantaranya adalah kemampuan RIP dalam menginduksi apoptosis pada sel HeLa dan Raji (Ikawati dkk., 2003). Penelitian lainnya adalah mengenai aktivitas RIP yang memiliki kemampuan untuk menonaktifkan ribosom dengan memodifikasi 28S rrna melalui aktivitas N-glikosidase (Ikawati dkk., 2006). Pemurnian RIP MJ menghasilkan RIP MJ-C telah diteliti untuk melihat efektifitasnya terhadap sel kanker, diantaranya adalah penelitian tentang efek sitotoksik RIP MJ-C terhadap sel kanker EVSA-T and T47D (Sudjadi dkk., 2007), penelitian tentang RIP MJ-C yang menunjukkan aktivitasnya terhadap sel HeLa, Raji, MCF7, T47D, NS-1, EVSA, WiDR dan Vero (Sismindari dkk., 2010). Penelitian lain yang mendasari dilakukannya penelitian ini adalah tentang nanopartikel kitosan sebagai sistem penghantaran obat. Beberapa penelitian tersebut adalah tentang nanopartikel kitosan sebagai sistem penghantaran baru pada amonium glycyrrhizinate (Wu dkk., 2005), aktivitas anti-tumor nanopartikel kitosan paclitaxel-loaded pada sebuah studi 5
in vitro (Li dkk., 2009), dan nanopartikel kitosan sebagai sistem penghantaran obat baru untuk anti-alzheimer (Wilson dkk., 2010). Nanopartikel kitosan yang dikombinasi dengan pektin juga telah diteliti dalam penggunaannya sebagai sistem penghantaran obat untuk obat kanker. Untuk meningkatkan keamanan penggunaan obat kanker dan untuk mencegah obat bereaksi pada tempat yang tidak diharapkan, sistem nanopartikel kitosan-pektin kemudian dikonjugasikan dengan suatu antibodi yaitu anti EpCAM. Penelitian yang telah dilakukan adalah formulasi dan uji sitotoksisitas nanopartikel pektin peanut silang kitosan rantai sedang terintegrasi RIP M.jalapa L dengan penanda anti EpCAM (Feranisa, 2014). Formulasi nanopartikel RIP M.jalapa L tertarget menggunakan kitosan rantai pendek-pektin terkonjugasi anti EpCAM dan uji sitotoksik pada sel kanker payudara T47D (Pertiwi, 2014). Pada penelitian ini dilakukan formulasi nanopartikel menggunakan kombinasi polimer kitosan rantai pendek dan pektin metilasi rendah yang dikonjugasikan dengan antibodi anti EpCAM 9C4, dan diuji daya sitotoksiknya terhadap sel kanker payudara T47D. 3. Urgensi Penelitian Dengan penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan suatu formula nanopartikel RIP MJ-C dengan polimer kitosan rantai pendek dan pektin metilasi rendah terkonjugasi antibodi anti EpCAM 9C4 yang memiliki daya sitotoksik, memiliki efektivitas dan selektivitas yang tinggi pada pengobatan kanker payudara sehingga dapat menurunkan poliferasi, migrasi dan invasi 6
pada sel kanker payudara T47D, dan tercapainya tujuan terapi tertarget untuk kanker payudara. B. Tujuan Penelitian Tujuan dilakukan penelitian ini adalah untuk: 1. Mendapatkan formula nanopartikel RIP MJ-C dengan polimer kitosan rantai pendek dan pektin metilasi rendah yang dikonjugasikan dengan antibodi anti EpCAM 9C4. 2. Mendapatkan karakteristik fisik nanopartikel RIP MJ-C kitosan-pektin yang meliputi morfologi nanopartikel, ukuran partikel, potensial zeta, indeks polidispersitas. 3. Memperoleh efek sitotoksik yang dihasilkan dari nanopartikel RIP MJ-C yang dikonjugasikan dengan antibodi anti EpCAM jenis 9C4 terhadap sel kanker payudara T47D. 7
Aktivitas RIP Nanomedisin RIP dari tanaman Mirabilis jalapa L Nanopartikel sebagai penghantar obat Nanopartikel kitosan dengan peanut silang pektin, terkonjugasi anti EpCAM Ekstrak Gubal Ribosome Inactivating Protein (RIP) dari tanaman Mirabilis jalapa L dapat menginduksi apoptosis pada sel HeLa dan Raji (Ikawati, 2003) Ribosome Inactivating Protein (RIP) merupakan kelompok enzim tanaman yang memiliki kemampuan untuk menonaktifkan ribosom dengan memodifikasi 28S rrna melalui aktivitas N- glycosidase. (Ikawati., dkk, 20006) RIP MJ-C sebagai antikanker Efek sitotoksik RIP MJ-C terhadap sel kanker EVSA-T and T47D (Sudjadi.,dkk, 2007) RIP MJ-C menunjukkan aktivitasnya terhadap sel HeLa, Raji, MCF7, T47D, NS-1, EVSA, WiDR dan Vero (Sismindari.,dkk, 2010) Nanopartikel kitosan sebagai sistem penghantaran baru pada amonium glycyrrhizinate (Wu.,dkk,2005) Aktivitas anti-tumor nanopartikel kitosan paclitaxelloaded pada sebuah studi in vitro (Li dkk.,2009) Nanopartikel kitosan sebagai sistem penghantaran obat baru untuk anti-alzheimer (Wilson dkk., 2010). Formulasi dan uji sitotoksisitas nanopartikel pektin peanut silang kitosan rantai sedang terintegrasi RIP M.jalapa L dengan penanda anti EpCAM (Feranisa, 2014) Formulasi nanopartikel RIP M.jalapa L tertarget menggunakan kitosan rantai pendek-pektin terkonjugasi anti EpCAM dan uji sitotoksik pada sel kanker payudara (Pertiwi, 2014) Formulasi dan uji sitotoksik nanopartikel RIP MJ-C menggunakan kitosan rantai pendek, dan pektin metilasi rendah terhadap sel kanker payudara MCF7 KETERANGAN Penelitian yang telah dilakukan Penelitian yang mendasari tesis Gambar 1. Bagan keaslian penelitian Penelitian yang dilakukan 8