PENYISIPAN GEN LEAFY LENGKAP TANAMAN KAKAO PADA VEKTOR EKSPRESI DAN TRANSFORMASI KE DALAM Agrobacterium sp. SAPTO GUNTORO

PENYISIPAN GEN LEAFY LENGKAP TANAMAN KAKAO PADA VEKTOR EKSPRESI DAN TRANSFORMASI KE DALAM Agrobacterium sp. SAPTO GUNTORO DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010

ABSTRAK SAPTO GUNTORO. Penyisipan Gen LEAFY Lengkap Tanaman Kakao pada Vektor Ekspresi dan Transformasi ke dalam Agrobacterium sp. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan TETTY CHAIDAMSARI. Kakao (Theobroma cacao L.) merupakan salah satu tanaman perkebunan yang peranannya cukup penting bagi perekonomian nasional. Akan tetapi, ada permasalahan yang dihadapi dalam perkebunan kakao yaitu adanya layu pentil. Layu pentil akan menurunkan tingkat produktivitas kakao. Gen pembungaan pada tanaman kakao mengatur pembentukan bunga normal. Salah satu gen yang berperan utama dalam pembentukan bunga adalah gen LEAFY. Mempelajari gen pembungaan tersebut diharapkan dapat mengetahui pengaruh gen tersebut terhadap layu pentil. Penelitian ini bertujuan menyisipkan gen LEAFY lengkap ke dalam vektor ekspresi. Gen LEAFY lengkap yang telah tersisipkan ke dalam vektor ekspresi selanjutnya ditransformasikan ke dalam Agrobacterium tumefaciens AGL-0. Penyisipan gen LEAFY ke dalam vektor ekspresi dilakukan dengan metode Gateway. Gen LEAFY lengkap yang berukuran 1200 bp terlebih dahulu disisipkan ke dalam vektor donor selanjutnya ke vektor ekspresi. Pengujian gen LEAFY yang telah tersisipkan ke dalam vektor ekspresi menggunakan PCR plasmid yang menghasilkan pita DNA berukuran 500 bp. Vektor ekspresi yang telah tersisipi gen LEAFY ditransformasikan ke dalam Agrobacterium tumefaciens AGL-0. Pengujian plasmid rekombinan setelah transformasi ke dalam Agrobacterium tumefaciens AGL-0 menggunakan PCR plasmid menghasilkan pita DNA berukuran 500 bp. Simpulan dari penelitian ini gen lengkap LEAFY telah berhasil disisipkan ke dalam vektor ekspresi dengan metode Gateway.

ABSTRACT SAPTO GUNTORO. Cloning of fulllength LEAFY Gene of Theobroma cacao L. in Expression Vector and Transformation to Agrobacterium sp. Under the direction of I MADE ARTIKA and TETTY CHAIDAMSARI. Cacao (Theobroma cacao L.) is one of the plantations that has important role for the national economy. However, one of the problems faced in the cocoa plantations is cherelle wilt. Cherelle wilt reduces the level of productivity of cocoa. Flowering genes regulate the normal flower formation in cacao. One of the genes that play a major role in the flower formation is the LEAFY gene. Studying the flowering genes are expected to elucidate the effect of these genes to cherelle wilt. The objective of this research is to construct expression vector harbouring fulllength of LEAFY gene. The fulllength of LEAFY gene that has been inserted into the expression vector was then transformed into Agrobacterium tumefaciens AGL-0. Cloning of LEAFY gene into expression vector was carried out using the Gateway technology. The full size LEAFY gene of 1200 bp was first inserted into a donor vector and then inserted into the expression vector. Characterization of expression vector inserted with LEAFY gene was carried out using the PCR plasmid technique which resulted in a DNA band of 500 bp. Expression vector inserted with LEAFY gene was transformed into the Agrobacterium tumefaciens AGL-0. Analysis of recombinant plasmid after transformation into the Agrobacterium tumefaciens AGL-0 using PCR plasmid technique result in a DNA band of 500 bp. The conclusion of this research is that the fulllength of LEAFY gene had successfully been inserted into the expression vector with Gateway technology.

PENYISIPAN GEN LEAFY LENGKAP TANAMAN KAKAO PADA VEKTOR EKSPRESI DAN TRANSFORMASI KE DALAM Agrobacterium sp. SAPTO GUNTORO Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010

Judul Skripsi : Penyisipan Gen LEAFY Lengkap Tanaman Kakao pada Vektor Ekspresi dan Transformasi ke dalam Agrobacterium sp. Nama : Sapto Guntoro NIM : G84061949 Disetujui Komisi Pembimbing Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc Ketua Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si Anggota Diketahui Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc Ketua Departemen Biokimia Tanggal lulus:

PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala limpahan dan karunia-nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Shalawat dan salam semoga tercurahkan pada Rasulallah SAW. Penelitian yang dilaksanakan sejak Februari 2010 di Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI), Bogor berjudul Penyisipan Gen LEAFY Lengkap Tanaman Kakao pada Vektor Ekspresi dan Transformasi ke dalam Agrobacterium sp. Penulis menyampaikan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyusunan karya ilmiah ini secara langsung maupun tidak langsung. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc dan Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si selaku pembimbing yang telah memberi bimbingan, masukan, dan arahan. Mba Nina, Mba Herti dan segenap staf di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika, BPBPI. Ayah, ibu, dan adik-adikku atas segala perhatian, doa, dan kasih sayang serta motivasinya. Serta rekan-rekan Biokimia 43 atas segala dorongan dan semangatnya. Penulis menyadari berbagai kekurangan dalam karya ilmiah ini. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi semua pihak yang membutuhkan. Bogor, Desember 2010 Sapto Guntoro

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Brebes pada tanggal 28 Mei 1988 dari ayah Condro Hadiwaseso dan ibu Kunaeni. Penulis merupakan putra pertama dari tiga bersaudara. Tahun 2006 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Brebes dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih program studi mayor Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam serta program studi minor Manajemen Fungsional, Fakultas Ekonomi dan Manajemen. Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi pengurus Organisasi Mahasiswa Daerah Brebes pada tahun 2006/2009. Penulis pernah menjadi anggota Unit Kegiatan Mahasiswa (UKM) Bulu Tangkis IPB pada tahun 2006/2007. Selain itu, penulis aktif dalam organisasi Dewan Perwakilan Mahasiswa, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam tahun 2007/2008. Tahun 2009 penulis pernah melakukan kegiatan praktik lapangan di Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Jalan Taman Kencana No.1 Bogor dengan judul Isolasi dan Konstruksi Fragmen Gen LEAFY pada Vektor Pengklonan dari Tanaman Kakao (Theobroma Cacao L.). Penulis pernah menjadi asisten praktikum Struktur dan Fungsi Subseluler pada tahun 2009/2010

DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR... viii DAFTAR LAMPIRAN... viii PENDAHULUAN... 1 TINJAUAN PUSTAKA Kakao (Theobroma cacao L.)... 1 Gen Pembungaan LEAFY (LFY)... 2 Metode Pengklonan Gateway... 3 Polymerase Chain Reaction (PCR)... 4 Elektroforesis Gel Agarosa... 6 Agrobacterium tumefaciens... 6 BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat... 6 Metode... 7 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Amplifikasi Gen LEAFY dengan Primer Gateway... 9 Hasil Ekstraksi dan Pemurnian DNA dari Gel... 10 Rekombinasi LEAFY pada Vektor Donor dan Vektor Destinasi... 10 Pengujian Koloni Rekombinan setelah Rekombinasi ke Vektor Donor... 11 Pengujian Koloni Rekombinan setelah Rekombinasi Vektor Destinasi... 12 Transformasi ke dalam Agrobacterium tumefaciens Galur AGL-O... 13 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan... 14 Saran... 14 DAFTAR PUSTAKA... 14 LAMPIRAN... 17

DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Pohon kakao... 2 2 Lintasan penginduksian bunga... 3 3 Reaksi BP dalam metode Gateway... 4 4 Reaksi LR dalam metode Gateway... 4 5 Proses Polymerase Chain Reaction (PCR)... 5 6 Elektroforegram amplikon gen LEAFY... 10 7 Elektroforegram ekstraksi dan pemurnian gen LEAFY... 10 8 Koloni yang tumbuh setelah reaksi BP... 11 9 Koloni yang tumbuh setelah reaksi LR... 11 10 Elektroforegram PCR koloni rekombinasi LEAFY pada vektor donor... 12 11 Elektroforegram ukuran gen sisipan pada plasmid setelah reaksi BP... 12 12 Elektroforegram ukuran gen sisipan pada plasmid setelah reaksi LR... 13 13 Elektroforegram PCR plasmid rekombinan setelah reaksi LR... 13 14 Koloni yang tumbuh setelah transformasi ke Agrobacterium... 13 15 Elektroforegram DNA plasmid setelah transformasi ke Agrobacterium... 14 16 Elektroforegram PCR plasmid setelah transformasi ke Agrobacterium... 14 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Tahapan isolasi dan kontruksi gen LEAFY ke vektor pengklonan... 18 2 Tahapan penelitian penyisipan gen LEAFY pada vektor ekspresi dan transformasi ke dalam Agrobacterium sp.... 19 3 Sepasang primer yang dirancang berdasarkan metode Gateway... 20 4 Sekuens gen LEAFY dari bantalan bunga aktif kakao... 21 5 Elektroferogram gen LEAFY... 22 6 Reaksi BP pada metode pengklonan Gateway... 23 7 Marka seleksi vektor donor (pdonr TM 221)... 24 8 Reaksi LR pada metode pengklonan Gateway... 25

1 PENDAHULUAN Salah satu tanaman perkebunan yang mempunyai peranan cukup penting bagi perekonomian nasional adalah kakao (Theobroma cacao L.). Peranan tersebut diantaranya sebagai penyedia lapangan kerja, sumber pendapatan, dan devisa negara. Perkebunan kakao telah menyediakan lapangan kerja dan sumber pendapatan bagi sekitar 900 ribu kepala keluarga petani yang sebagian besar berada di Kawasan Timur Indonesia (KTI) serta memberikan sumbangan devisa terbesar ketiga subsektor perkebunan setelah karet dan minyak sawit dengan nilai sebesar US$ 701 juta pada tahun 2002 (Deptan 2005). Indonesia termasuk dalam tiga besar produsen kakao dunia bersama Ghana dan Pantai Gading (Deptan 2005). Oleh karena itu, Indonesia harus menyediakan tanaman kakao yang mempunyai produktivitas tinggi dan kualitas biji yang baik untuk mempertahankan sebagai negara produsen kakao. Kakao mempunyai prospek yang cerah karena diperkirakan kebutuhan kakao dunia akan terus meningkat. Kebutuhan kakao yang setiap tahun meningkat menyebabkan berbagai provinsi di Indonesia melakukan ekstensifikasi areal penanaman kakao untuk meningkatkan produksi kakao nasional. Adanya ekstensifikasi areal penanaman kakao, diharapkan dapat meningkatkan produksi kakao nasional dan tetap mempertahankan produksi kakao yang tinggi, sehingga dapat bersaing dengan negara produsen lainnya. Akan tetapi solusi ini belum bisa untuk meningkatkan produksi kakao secara keseluruhan. Hal ini disebabkan karena permasalahan yang sering timbul dalam perkebunan kakao. Selain permasalahan serangan hama penggerek buah kakao (PBK). Permasalahan lain yang sering dihadapi dalam perkebunan kakao yakni sedikitnya bunga yang menjadi buah dan penyakit layu pentil. Permasalahan ini dapat menurunkan tingkat produksi kakao. Kakao dapat menghasilkan 5000-10000 bunga dalam setahun. Akan tetapi, hanya 50-1000 bunga atau sekitar 10% yang mengalami penyerbukan sedangkan sisanya yang mekar dalam 24 jam dan tidak diserbuki akan gugur. Bunga yang telah mengalami penyerbukan sekitar 10%-30% akan berkembang menjadi pentil. Selain itu, kakao mempunyai sifat melayukan sebagian besar pentil yang terbentuk dan pentil yang dilayukan tersebut disebut pentil yang mengalami layu pentil. Periode kritis terjadinya layu pentil berlangsung pada waktu buah berumur 5-10 minggu saat endosperm biji belum mengeras. Banyaknya pentil yang mengalami layu pentil dapat mencapai 70-90% dari jumlah keseluruhan pentil yang terbentuk (McKelvie 1956). Masalah layu pentil dan pembungaan yang tidak normal pada kakao dapat dipelajari dengan mempelajari fungsi gen pembungaannya. Salah satu gen yang berperan utama dalam pembentukkan bunga adalah gen LEAFY (LFY). Tanaman akan cepat berbunga dan tunas lateral akan menjadi bunga tunggal apabila gen LEAFY dibuat terekspresi. Gen LEAFY ini pertama kali dianalisis pada tanaman rumput liar Arabidopsis thaliana. Gen LEAFY ini tidak hanya terdapat pada tanaman yang sekerabat dengan Arabidopsis thaliana tetapi juga tanaman lain sehingga dengan mempelajari gen ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai gen ini sehingga dapat membantu meningkatkan hasil produksi tanaman kakao. Penelitian ini bertujuan menyisipkan gen LEAFY lengkap ke dalam vektor ekspresi dengan metode Gateway. Gen LEAFY yang telah tersisipkan dalam vektor ekspresi selanjutnya ditransformasikan ke dalam Agrobacterium tumefaciens. Hipotesis penelitian ini plasmid rekombinan untuk ekspresi gen LEAFY dapat disisipkan pada vektor ekspresi di bawah promotor 35S CaMV dengan metode Gateway. Pengujian pengaruh gen tersebut terhadap pembungaan dilakukan dengan mentransformasikan gen LEAFY ke tanaman. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai gen LEAFY dan metode Gateway sebagai salah satu metode pengklonan. TINJAUAN PUSTAKA Kakao (Theobroma cacao L.) Theobroma cacao L. merupakan nama yang diberikan untuk pohon kakao oleh Linnaeus dalam edisi pertama dari Species Plantarum yang diterbitkan pada tahun 1753. Pohon kakao merupakan pohon yang berdaun hijau (evergreen) yang berasal dari dataran rendah pegunungan Andes bagian timur di Amerika Selatan. Kakao memerlukan iklim yang hangat dan lembab, curah hujan yang teratur, dan tumbuh ditempat teduh dengan

2 suhu tidak kurang dari 20 0 C dan tidak lebih dari 28 0 C (Chaidamsari et al. 2005). Temperatur sangat berpengaruh terhadap kerusakan bunga dan pembungaan pada kakao. Temperatur yang rendah dari 10 0 C akan mengakibatkan gugur daun dan mengeringnya bunga sehingga laju pertumbuhanya berkurang. Temperatur yang tinggi akan memacu pembungaan tetapi kemudian akan segera gugur. Lingkungan hidup alami kakao adalah hutan tropis yang di dalam pertumbuhannya membutuhkan naungan untuk mengurangi pencahayaan penuh. Cahaya matahari yang terlalu banyak menyinari kakao akan mengakibatkan lilit batang kecil, daun sempit, dan tanaman relatif pendek. Kakao dapat tumbuh dengan baik pada tanaman yang memiliki ph 6-7.5 tidak lebih tinggi dari 8 serta tidak lebih rendah dari 4 paling tidak pada kedalaman 1 meter. Hal ini disebabkan terbatasnya ketersediaan hara pada ph tinggi dan efek racun dari Al, Mn, dan Fe pada ph rendah (Depperin 2007). Pohon kakao yang telah mencapai umur di atas tiga tahun akan menghasilkan banyak bunga pada musim tertentu. Bunga muncul dari bantalan bunga yaitu suatu jaringan meristem pada batang dan cabang kayu sehingga disebut bunga yang bersifat cauliflorous atau truncate. Bunga kakao mempunyai beberapa bagian bunga yaitu sepal, petal, kepala sari, tangkai sari, putik, dan ovarium. Bunganya berukuran kecil (diameternya sekitar 15 mm) dan berbentuk tangkai yang memanjang (Chaidamsari et al. 2006). Bunga kakao bersifat hemaprodit dan mempunyai susunan K5 C5 A5 + 5G (5) yaitu 5 sepal, 5 petal, 10 stamen, dan 5 carpel (Wood 1975). Pohon kakao menghasilkan buah kakao yang tumbuh dari bunga yang diserbuki. Ukuran buah jauh lebih besar dari bunganya dan berbentuk bulat hingga memanjang. Buah terdiri dari 5 daun buah dan memiliki ruang dan di dalamnya terdapat biji (Gambar 1). Kakao mempunyai sifat melayukan sebagian besar pentil yang terbentuk dalam kondisi normal, dan pentil yang dilayukan tersebut dinamakan pentil yang mengalami layu pentil (cherelle wilt). Buah yang mati karena layu pentil ditandai oleh menguningnya seluruh permukaan buah berangsur-angsur menjadi hitam dan mengeras. Buah yang hitam dan keras tersebut masih tetap menggantung di pohon (Sudarmadji et al. 1990). Berdasarkan karakteristik morfologi dan distribusi geografis, kakao dibagi menjadi tiga kelompok utama, yakni Forastero, Criollo, dan Trinitario. Forastero berasal dari daerah Amazonian, Amerika Selatan yang mempunyai kulit buah berwarna hijau dan biji dominan berwarna ungu. Criollo merupakan kakao yang pertama diidentifikasi yang berasal dari Amerika Tengah dan Amerika Selatan bagian utara. Criollo berbiji besar yang berwarna putih ataupun merah dan mempunyai aroma kakao yang menggoda. Trinitario merupakan persilangan dari Forastero dan Criollo. Jenis ini mempunyai beragam jenis buah dan biji sehingga sulit untuk membedakan dengan jenis kakao lainnya (N Goran et al. 1994). Gambar 1 Pohon kakao. Gen Pembungaan LEAFY (LFY) Gen LEAFY merupakan gen kunci dalam transisi meristem tunas jadi meristem bunga pada tanaman model Arabidopsis thaliana dan lainnya (Chaidamsari et al. 2006). Pembungaan pada Arabidopsis diinduksi oleh faktor dari dalam maupun pengaruh lingkungan seperti temperatur dan panjang hari yang mengaktifkan beberapa gen yakni LEAFY (LFY) dan APETALAI1 (AP1) yang mempengaruhi meristem pembungaan (Souer 2008). Mutasi pada gen LEAFY menyebabkan perbandingan yang besar terhadap struktur lateral yang akan berkembang menjadi bunga (Huala & Sussex 1992). Gen LEAFY menyandikan faktor transkripsi tanaman yang mempunyai fungsi utama dalam mengatur peralihan pembungaan dan pola meristem bunga muda. Sebelum pertumbuhan vegetatif tanaman, ekspresi gen LEAFY meningkatkan bentuk daun baru sampai bentuk awal tertentu dicapai. Gen LEAFY kemudian menginduksi ekspresi gen AP1 dan CAULIFLOWER (CAL) serta memicu transisi bunga secara tiba-tiba (Blazquez et al. 2006). Meristem pembungaan

3 yang dibentuk LEAFY akan menentukan pola ruang dengan menginduksi ekspresi gen homeotik ABC seperti AP1, AP3, dan AGAMOUS (AG) yang mengontrol identitas stereotip organ pembungaan (Gambar 2) (Coen & Meyerowitz 1991; Lohmann & Weigel 2002). Gen LEAFY ditemukan di seluruh tanaman terestrial mulai dari lumut sampai angiosperma, urutan sekuensnya menunjukkan tingkat konservasi tinggi dari kingdom tanaman tetapi tidak menunjukkan kesamaan protein (Maizel et al. 2005). Tidak seperti faktor transkripsi di kebanyakan tanaman yang disusun oleh perbanyakan gen (Riechmann & Ratcliffe 2000) keberadaan gen LEAFY merupakan penggandaan tunggal (single copy) di sebagian angiosperma dan mutan gen LEAFY terdapat di beberapa spesies seperti: snapdragon, petunia, tomat, dan sebagian di Arabidopsis (Souer et al. 1998). Lintasan giberelik Penyatuan pembungaan Lintasan autonomous Gen identitas meristem bunga Gen identitas organ bunga Lintasan vernalisasi Gambar 2 Lintasan penginduksian (Simpson et al. 1999). Lintasan fotoperiodik bunga Metode Pengklonan Gateway Metode pengklonan Gateway dikembangkan oleh peneliti dari perusahaan Life Technologies (Hartley et al. 2000). Metode ini merupakan suatu penerapan reaksi rekombinasi situs spesifik yang dapat balik dan terjadi sebelum integrasi ke dalam faga lamda dan pemotongan DNA dari Escherichia coli (E. coli). Bagian kromosom E. coli yang menjadi tempat rekombinasi lambda adalah attb sedangkan pada bagian DNA lambda disebut attp. Metode pengklonan Gateway pada dasarnya bergantung pada dua reaksi yakni, rekombinasi BP dan LR. B merupakan singkatan dari bakteri dan P (phage) sedangkan L (left) dan R (right). Reaksi BP pada metode pengklonan gateway terjadi penggabungan situs attp yang berukuran 242 bp dari faga lamda dan situs attb yang berukuran 25 bp dari rekombinasi E. coli dan genom faga lamda disambungkan ke genom E. coli. Hasilnya genom faga diikat oleh attl yang berukuran 100 bp dan attr yang berukuran 168 bp (Gambar 3). Kebalikanya faga lamda dipotong dari genom E. coli dengan rekombinasi di antara situs attl dan attr dalam reaksi LR. Reaksi ini merekombinasikan gen sisipan yang diikat oleh situs attl dengan vektor destinasi yang membawa situs attr. Hasilnya gen sisipan diikat oleh dua situs yakni situs attb1 dan attb2 yang selanjutnya disebut klon ekspresi (Gambar 4). Metode pengklonan Gateway menggunakan situs att dan klonase untuk mengonstruksi plasmid secara in vitro (Walhout et al. 2000). Reaksi BP dikatalisis oleh enzim BP klonase yang terdiri atas integrase fage dan protein IHF (integration host factor). Campuran BP klonase memindahkan DNA sisipan, seperti hasil PCR yang diikat oleh dua situs attb ke dalam vektor donor (pdonr) yang membawa dua situs attp. Rekombinasi DNA sisipan yang telah diikat oleh dua situs attb ke dalam vektor donor yang mempunyai dua situs attp akan menghasilkan suatu klon entri (pentr) yang diikat oleh dua situs attl. Klon entri dapat juga dirakit dengan restriksi dan ligasi DNA sisipan ke dalam vektor yang mempunyai bermacam situs pengklonan diikat oleh situs attl. Klon entri merupakan substrat kunci dalam reaksi LR yang dikatalisis oleh campuran LR klonase yang terdiri atas integrase, protein IHF, dan eksisionase fage. Campuran ini memindahkan DNA sisipan yang diikat oleh situs attl ke dalam vektor destinasi (pdest) yang membawa dua situs attr. Beberapa kasus klon entri tidak secara langsung berguna karena situs attl terlalu panjang (96 bp) untuk digantikan potongan gen sisipan. Sebagai perbandingan, situs attb hanya berukuran 21 sampai 25 pasang basa dan telah dirancang tanpa inisiasi translasi atau stop kodon (Hartley et al. 2000). Transformasi ke tanaman membutuhkan vektor biner untuk dapat ditransformasikan ke Agrobacterium tumefaciens. Beberapa faktor penting yang menjadi pertimbangan dalam membuat suatu vektor destinasi biner di

4 antaranya marka seleksi tumbuhan terdapat dalam DNA T terutama saat menyatukan lokus transgenik yang berbeda dari beberapa tanaman, lokasi di DNA T tertutup di sebelah kiri vektor destinasi karena pemindahan dari bakteri ke tanaman dimulai dari sebelah kanan vektor destinasi dan gen sisipan sebaiknya disatukan sebelum marka seleksi. Pengaturan sekuens untuk mencegah promotor virus kauliflower mosaik (CaMV) 35S yang merubah tingkat dan pola aktivitas dari promotor yang berdekatan (Zheng et al. 2007). Hasil rekombinasi dapat dengan mudah diseleksi dengan kombinasi positif (resisten terhadap antibiotik) dan seleksi negatif (gen sitotoksik ccdb) yang akan menghambat pertumbuhan Escherichia coli yang telah ditransformasi salah satu vektor (Magnani et al. 2006). Gen sitotoksik ccdb terdapat pada pada vektor donor dan vektor destinasi. Saat rekombinasi pada reaksi BP, gen ccdb akan bertukar dengan gen sisipan sehingga vektor yang tidak tersisipi gen sisipan akan mati karena gen ccdb. Begitu juga sebaliknya pada rekombinasi reaksi LR, gen sisipan yang telah diikat oleh situs attl akan bertukar dengan gen ccdb yang telah diikat oleh situs attr pada vektor destinasi (Bernard & Couturier 1992). Vektor donor Klon entri Hasil Hasil PCR Gambar 3 Reksi BP dalam metode Gateway (Magnani et al. 2006). Klon entri Klon ekspresi Hasil Vektor destinasi Gambar 4 Reksi LR dalam metode Gateway (Magnani et al. 2006). Polymerase Chain Reaction (PCR) Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik yang digunakan untuk penggandaan fragmen spesifik dari sekuens DNA secara in vitro. Metode ini melibatkan penggunaan bagian kecil dari pasangan komplementer DNA yang akan disintesis yang disebut primer dan DNA polimerase. Metode PCR sangat sensitif, sensitivitas tersebut dapat digunakan untuk melipatgandakan satu molekul DNA. Metode ini melipatgandakan DNA target dalam jumlah kecil sampai lebih dari sejuta kali sehingga menghasilkan DNA dalam jumlah yang sangat besar (Jonas 2003). Metode ini dikembangkan oleh Kary B. Mullis pada tahun 1984 dan pada akhirnya mendapatkan hadiah nobel di bidang kimia pada tahun 1993. Metode ini juga didukung oleh beberapa komponen pereaksi yang memiliki fungsi khusus, yaitu Taq DNA polimerase, cetakan DNA, oligonukleotida primer, deoxynucleotide triphosphate (dntp), dan larutan bufer. Taq DNA polimerase merupakan enzim tahan panas yang diisolasi dari bakteri termofilik Thermus aquaticus, enzim ini akan mengkatalisis pemanjangan primer pada reaksi PCR. Primer merupakan oligonukleotida pendek yang menempel pada fragmen DNA target yang diinginkan. Oligonukleotida yang digunakan sebagai primer paling sedikit merupakan gabungan dari 16 pasang basa, disarankan menggunakan 20-24 pasang basa. Primer yang terlalu

5 pendek tidak menempel secara spesifik pada DNA target sehingga akan terjadi penggandaan pada daerah yang tidak spesifik pada DNA target, sedangkan primer yang terlalu panjang akan sulit untuk menempel pada DNA target sehingga amplifikasi tidak terjadi. Keberadaan dntp dan konsentrasi larutan bufer dalam reaksi PCR, dapat mempengaruhi spesifitas amplikon. Reaksi PCR membutuhkan suatu bufer yang mengandung MgCl 2 karena aktivitas enzim polimerase dipengaruhi oleh konsentrasi ion Mg 2+. Magnesium (Mg) dapat meningkatkan aktivitas enzim secara maksimal pada konsentrasi 2 mm, konsentrasi yang lebih tinggi dapat menghambat aktivitas Taq DNA polimerase (Sambrook & Russell 2001). Metode PCR terdiri atas tiga tahap reaksi berbeda dalam satu siklus. Tahap pertama merupakan tahap denaturasi DNA yang dilakukan pada suhu 95 0 C, yang bertujuan untuk memutuskan ikatan hidrogen asam deoksiribonukleat (DNA) utas ganda menjadi utas tunggal. Tahap kedua merupakan penempelan primer (annealing), tahap ini suhu reaksi diturunkan agar nukleotida primer dapat menempel pada DNA, sehingga terbentuk ikatan hidrogen baru utas tunggal DNA target dengan oligonukleotida primer. Tahap ketiga merupakan tahap pemanjangan DNA (extension). Tahapan ini dilakukan pada kisaran suhu 70-75 0 C. Suhu ini optimum dari enzim Taq polimerase. Penggunaan suhu yang cukup tinggi ini juga dimaksudkan agar tahap denaturasi DNA untuk siklus berikutnya lebih mudah. Enzim Taq polimerase pada tahap ini akan menambahkan dntp pada ujung 3 OH primer yang komplemen dengan utas DNA target sehingga arah pertumbuhan utas DNA baru adalah dari ujung 5 P ke ujung 3 OH (Gambar 4). Suhu penempelan primer merupakan peubah kunci dalam metode PCR. Penggunaan suhu penempelan primer yang sesuai, memungkinkan masing-masing primer dapat menempel pada kedua ujung DNA cetakan. Suhu penempelan primer dapat dihitung berdasarkan urutan nukleotida primer yang digunakan. Umumnya suhu penempelan primer optimum berkisar ± 5 0 C dari suhu perhitungan penempelan primer. Jika suhu penempelan primer terlalu tinggi dari suhu optimum, menyebabkan primer tidak menempel dengan DNA cetakan. Jika suhu penempelan primer terlalu rendah dari suhu penempelan primer optimum menyebabkan mispriming, yaitu penempelan primer pada tempat yang salah pada DNA cetakan sehingga menghasilkan hasil yang tidak spesifik. Oleh karena itu diperlukan optimasi terhadap suhu penempelan primer (Yuwono 2006). Selain suhu penempelan primer perlu juga dilakukan optimasi terhadap berat DNA cetakan yang digunakan dalam reaksi PCR. Ketersediaan DNA cetakan yang cukup diperlukan agar visualisasi hasil PCR dengan etidium bromida dapat meghasilkan pita DNA yang jelas dalam metode elektroforesis. Adanya pita DNA yang jelas menunjukkan bahwa proses PCR telah berhasil mengamplifikasi fragmen DNA cetakan. Penggunaan DNA cetakan yang terlalu banyak dapat menurunkan efisiensi PCR, akibat dari meningkatnya kemungkinan kontaminasi dalam penyiapan DNA. Metode PCR dapat digunakan untuk analisis maupun untuk sintesis nukleotida. Salah satu kegunaan PCR adalah untuk identifikasi suatu gen atau DNA yang spesifik. Identifikasi keberadaan suatu gen dapat dilakukan dengan mudah bila daerah pengapit (flanking region) telah diketahui. Daerah pengapit yang spesifik ini digunakan sebagai primer. Penggunaan PCR untuk identifikasi adanya suatu patogen penyebab suatu penyakit telah banyak dilakukan, seperti hepatitis B, TBC, AIDS, atau kelainan lainnya. Perbanyakan gen untuk berbagai keperluan, pengurutan DNA, ataupun kajian keragaman molekuler dapat pula dilakukan dengan PCR (Suharsono 2000). DNA Nukleotida 8. Denaturasi Primer Proses PCR Denaturasi Penempelan primer Pemanjangan primer Gambar 5 Proses Polymerase Chain Reaction (PCR).

6 Elektroforesis Gel Agarosa Teknik elektroforesis gel agarosa merupakan suatu metode yang biasa digunakan dalam biokimia dan biologi molekuler untuk pemisahan molekul DNA dan RNA berdasarkan ukurannya (Koolman 2000). Teknik elektroforesis gel agarosa merupakan suatu teknik awal yang paling sering digunakan untuk memeriksa, mengarakteristik, dan memisahkan molekul DNA secara fisik. Kelebihan teknik elektroforesis gel agarosa, yaitu pelaksanaannya sederhana dan cepat, serta dapat memisahkan berbagai fragmen DNA yang tidak dapat dipisahkan secara tepat dengan menggunakan teknik lain seperti sentrifugasi gradien densitas. Molekul DNA yang ukurannya lebih kecil dari 20 kb dengan elektroforesis dapat dipisahkan sesuai dengan ukurannya. Pemisahan dapat terjadi akibat adanya efek penyaringan oleh matriks gel yang digunakan. Ukuran molekul DNA yang lebih besar dari pori-pori gel tidak dapat dipisahkan dengan teknik elektroforesis. Faktor yang dapat membantu berlangsungnya proses elektroforesis adalah sistem bufer, waktu, dan tegangan yang digunakan. Konsentrasi gel agarosa yang sering dipakai berkisar antara 0.8-1.5%. Konsentrasi gel yang sangat encer (0.1-0.2%) dapat meningkatkan daya pisah elektroforesis tetapi hal tersebut sulit dilakukan karena gel yang encer sangat mudah pecah. Konsentrasi gel akan berpengaruh terhadap pori-pori gel sehingga mempengaruhi bobot molekul dari senyawa yang akan dipisahkan. Menurut Yuwono (2005), larutan bufer yang digunakan dalam elektroforesis sama dengan yang digunakan untuk membuat gel. Bufer tersebut dapat dibuat seperti tris-asetat-edta (TAE) atau tris-borat-edta (TBE). Campuran agarosa dan bufer yang sudah dipanaskan kemudian dicetak dengan salah satu ujungnya dibuat berbagai sumur sebagai tempat memasukkan sampel DNA. Pengamatan hasil elektroforesis agar dapat terlihat secara visual dengan menambahkan etidium bromida (EtBr) pada gel. Etidium bromida akan menyisip ke dalam DNA sehingga bila dilihat di bawah sinar UV pita DNA menjadi terlihat karena etidium bromida akan memendarkan sinar UV. Agrobacterium tumefaciens Vektor DNA yang biasa digunakan untuk memindahkan gen ke dalam tumbuhan adalah plasmid dari bakteri Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens). Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri gram negatif yang hidup di tanah. Bakteri ini dapat memindahkan sel secara genetik pada beberapa tumbuhan dikotil serta beberapa tumbuhan monokotil dan gymnosperma. Di alam, A. tumefaciens menginfeksi tumbuhan dan menyebabkan tumor yang disebut empedu mahkota. Tumor ini dimasukkan oleh plasmid, yang disebut plasmid Ti (tumor inducing). Plasmid Ti ini mengintegrasikan segmen DNA yang dikenal DNA T ke dalam DNA kromosom sel tumbuhan inangnya (Hwang & Gelvin 2004). Plasmid Ti ditemukan pada semua galur A. tumefaciens virulen yang berukuran sekitar 200-250 kb dan stabil pada suhu di bawah 30 0 C (Tzafira & Citovsky 2002). Transformasi ke tanaman dengan Agrobacterium memerlukan keberadaan dua komponen genetik yang terdapat pada plasmid Ti yakni: (1) DNA T, bahan genetik yang dipindahkan ke genom tanaman dan (2) virulen (vir), aderah yang tersusun atas beberapa loci yang menyadikan protein DNA T dan pemindahan DNA T ke tanaman (Tzafira & Citovsky 2002). Gen asing dapat diselipkan ke dalam plasmid Ti dengan menggunakan teknik DNA rekombinan. Plasmid rekombinan ditransformasikan ke dalam Agrobacterium yang dapat digunakan untuk menginfeksi sel tumbuhan. Plasmid rekombinan akan menyelipkan dirinya ke dalam kromosom tumbuhan. Hal ini memungkinkan menghasilkan tumbuhan yang mengandung dan mengekspresikan gen asing yang dapat diwariskan ke keturunannya. BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam proses amplifikasi menggunakan kit dari Invitrogen yang memerlukan bahan-bahan seperti gen LEAFY, primer spesifik Gateway Tc-Leafy-F, primer spesifik Gateway Tc-Leafy-R, larutan bufer, MgCl 2, dntps, Taq polimerase, dan molecular water (aquabides). Bahan yang digunakan dalam elektroforesis yaitu gel agarosa (Fermentas), bufer Tris-Borate-EDTA (TBE) 0.5x, Etidium bromida (EtBr) 5 µg/100ml, loading bufer (Bromfenol biru 2.5%, sukrosa 40%), dan marker 1 kb plus DNA Ladder (Invitrogen). Ekstraksi dan Pemurnian menggunakan kit dari Invitrogen (PureLink TM Quick Gel Extraction). Isolasi DNA plasmid menggunakan kit dari

7 Fermentas (GeneJET TM Plasmid MiniPrep Kit). Bahan lainnya yang digunakan Gateway Technology, Invitrogen (vektor pdonr TM, enzim BP clonase TM, Proteinase K, enzim LR clonase TM ), sel kompeten Escherichia coli galur XL-1 Blue, sel kompeten Agrobacterium tumefaciens galur AGL-0, media Luria Bertani (LB), media Luria Agar (LA), nitrogen cair, media YEP (Yeast Extract Pepton), kanamisin 50 ppm, rifamisin 50 ppm. Alat yang digunakan untuk elektroforesis adalah sisir dan cetakan agar, bak elektroforesis, mikropipet, tabung mikro, microwave, adaptor 100 Volt, transluminator ultraviolet (UV) T2201 (Sigma). Selain itu alat yang digunakan adalah mesin PCR (Biometra T-Personal), DNA speed vacuum 110 savant, inkubator bergoyang (shacker incubator), laminar air flow cabinet, autoklaf, Eppendorf sentrifus 5417R, neraca analitik, penangas air, dan peralatan gelas seperti cawan petri, gelas piala, labu Erlenmeyer, segitiga penyebar, dan gelas ukur. Metode Sebelumnya telah dilakukan isolasi RNA total pada bantalan aktif bunga kakao sampai kemudian pengurutan basa nukleotida gen LEAFY. Penelitian ini dimulai dari amplifikasi gen LEAFY dengan primer Gateway sampai transformasi ke Agrobacterium sp. Amplifikasi Gen LEAFY dengan Primer Gateway (Invitrogen 2010) Amplifikasi gen LEAFY menggunakan kit dari Invitrogen (Platinum Taq DNA Polymerase). Amplifikasi ini menggunakan sepasang primer spesifik Gateway yakni, Gateway Tc-Leafy-Forward dan Gateway Tc-Leafy-Reverse. Proses amplifikasi dimulai dengan menyiapkan campuran reaksi (reaction mix) yang terdiri atas 2.5 µl bufer, 0.75 µl MgCl 2, 1 µl dntps, 0.25 µl Taq polimerase, dan 14.5 µl aquabides. DNA cetakan (template) dimasukkan ke dalam tabung mikro sebanyak 1 µl. Reverse primer atau primer R (Tc-Leafy-R) ditambahkan sebanyak 1 µl ke dalam tabung mikro kemudian ditambahkan pula sebanyak 1 µl forward primer atau primer F (Tc-Leafy-F) ke dalam tabung. Campuran reaksi yang telah dipersiapkan sebelumnya ditambahkan setelah penambahan cdna, primer R, dan primer F. Gen LEAFY diamplifikasi dengan mesin PCR selama ± 3 jam dengan program PCR: predenaturasi pada suhu 94 0 C selama 7 menit, denaturasi pada suhu 94 0 C selama 45 detik, penempelan primer (annealing) pada suhu 55 0 C selama 45 detik, pemanjangan primer (extension) pada suhu 72 0 C selama 2 menit, pascapemanjangan pada suhu 72 0 C selama 5 menit. Ekstraksi dan Pemurnian DNA dari Gel Agarosa (Invitrogen 2010) Ektraksi dan pemurnian DNA dari gel menggunakan kit dari Invitrogen. Gen LEAFY yang telah berhasil diamplifikasi yang ditunjukkan dengan adanya pita setelah elektroforesis kemudian diekstraksi dan dimurnikan. Gel agarosa yang telah digunakan untuk menguji hasil amplifikasi diletakkan di atas transluminator UV. Pita yang terlihat pada gel dipotong menggunakan pisau potong (scalpel). Gel hasil potongan ditambahkan bufer pelarut (Gel solubilisation buffer) sebanyak 3x volume kemudian diinkubasi pada suhu 50 0 C sampai gel tersebut larut. Gel yang telah larut dipindahkan ke kolom (Quick Plasmidmini Colums TM ) dan disentrifugasi pada 12000 rpm di suhu 25 0 C selama 2 menit kemudian ke dalam kolom ditambahkan bufer pencuci (wash buffer) dan disentrifugasi kembali pada 12000 rpm, 25 0 C selama 2 menit. Cairan yang terendapkan di bawah kolom dibuang dan kolom disentrifugasi kembali dalam keadaan kosong lalu ditambahkan bufer elusi dan diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit, kemudian kolom disentrifugasi pada 12000 rpm, 25 0 C selama 2 menit. DNA yang telah mengalami ekstraksi dan pemurnian akan larut setelah penambahan bufer elusi dan mengendap pada bagian bawah kolom setelah sentrifugasi. Hasil ekstraksi dan pemurnian DNA dari gel kemudian diuji dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Rekombinasi LEAFY pada Vektor Donor dan Vektor Destinasi (Invitrogen 2003) Gen LEAFY yang telah diekstraksi dan dimurnikan kemudian direkombinasikan ke vektor donor dan vektor destinasi dengan metode Gateway. Gen LEAFY terlebih dahulu direkombinasikan ke vektor donor kemudian direkombinasikan ke vektor destinasi. Rekombinasi LEAFY pada vektor donor dimulai dengan menyiapkan sebanyak 1 µl DNA, vektor donor (pdonr 221 TM ) sebanyak 1 µl kemudian ditambahkan bufer TE sampai volumenya menjadi 8 µl. Penambahan BP Clonase TM II sebanyak 2 µl setelah semuanya telah siap kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 25 0 C. Setelah inkubasi selesai larutan ditambahkan

8 sebanyak 2 µl Proteinase K dan diinkubasi lagi pada suhu 35 0 C selama 15 menit. Hasil rekombinasi LEAFY pada vektor Donor ditransformasikan ke Escherichia coli (E. coli) untuk pembiakan plasmid yang telah membawa gen LEAFY. Koloni bakteri E. coli yang tumbuh pada media LA dikonfirmasi dengan metode PCR. Koloni bakteri rekombinan ditandai adanya pita setelah pengujian dengan metode PCR. Koloni bakteri rekombinan kemudian diisolasi DNA plasmidnya untuk direkombinasikan ke vektor destinasi. Sebanyak 1 µl plasmid rekombinan dimasukkan ke dalam tabung mikro kemudian ditambahkan 1 µl vektor destinasi. Setelah itu ditambahkan bufer TE hingga volume larutan mencapai 8 µl. Ke dalam tabung mikro ditambahkan sebanyak 2 µl LR Clonase TM II kemudian diinkubasi pada suhu 25 0 C selama 1 jam. Setelah inkubasi larutan kemudian ditambahkan 1 µl Proteinase K yang berfungsi untuk menghilangkan protein yang ada pada DNA. Larutan yang telah ditambahkan Proteinase K diinkubasi kembali pada suhu 37 0 C selama 15 menit. Hasil rekombianasi pada vektor destinasi kemudian ditransformasikan ke dalam E. coli. Koloni bakteri yang tumbuh diisolasi DNA plasmidnya yang selanjutnya dikonfirmasi dengan metode PCR. Plasmid rekombinan hasil rekombinasi selanjutnya ditransformasikan ke Agrobacterium sp. Isolasi DNA Plasmid Rekombinan (Fermentas 2006) Isolasi DNA plasmid menggunakan GeneJET TM Plasmid Miniprep Kit (Fermentas). Koloni bakteri yang tumbuh pada media LA dikulturkan ke media LB yang telah ditambahkan antibiotik kanamisin 50 ppm (bakteri yang ditransfornasikan dengan vektor donor) dan kanamisin 500 ppm, rifamisin 50 ppm (bakteri yang ditransfornasikan dengan vektor destinasi). Bakteri diinkubasi pada inkubator bergoyang pada suhu 37 0 C selama semalam untuk pembiakan bakteri. Kultur bakteri yang telah tumbuh kemudian dipindahkan ke tabung mikro sebanyak 1.5 ml dan disentrifus pada 12000 rpm, 25 0 C selama 1 menit. Pelet yang terendapkan pada bagian bawah tabung diambil dan dilarutkan dengan larutan resuspensi sebanyak 250 µl kemudian divortex. Pelet yang telah dilarutkan tersebut ditambahkan larutan lisis sebanyak 250 µl dan dikocok bolak-balik. Larutan lisis ini berfungsi untuk melisiskan dinding sel bakteri. Agar isi sel tidak rusak karena perubahan ph selanjutnya ditambahkan larutan netralisasi sebanyak 350 µl kemudian disentrifugasi pada kecepatan dan suhu yang sama selama 5 menit. Kecepatan sentrifugasi pada isolasi DNA plasmid dengan kit Fermentas seluruhnya pada 12000 rpm dan suhu 25 0 C. Supernatan dipindahkan ke GeneJET TM Spin Column dan disentrifugasi pada kecepatan dan suhu yang sama selama 1 menit. Selanjutnya ditambahkan sebanyak 500 µl larutan pencuci dan disentrifugasi pada suhu dan kecepatan yang sama selama 1 menit (dikerjakan dua kali). Tabung disentrifugasi dalam keadaan kosong pada kecepatan dan suhu yang sama selama 1 menit untuk mengendapkan DNA plasmid. Ditambahkan bufer elusi sebanyak 50 µl dan diinkubasi selama dua menit kemudian disentrifugasi pada kecepatan dan suhu yang sama selama 2 menit. Hasil isolasi DNA plasmid dikonfirmasi dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Transformasi Plasmid Rekombinan ke dalam Escherichia coli XL-1 Blue (Doyle 1996) Transformasi Gen LEAFY ke dalam E. coli menggunakan metode Doyle (1996). Gen LEAFY yang telah direkombinasikan ke vektor donor maupun vektor destinasi kemudian ditransformasikan ke E. coli untuk pembiakan sel pembawa plasmid rekombinan. Sebanyak 5 µl hasil rekombinasi ditransformasikan ke dalam 200 µl sel kompeten E. coli XL-1 Blue dikocok perlahan hingga tercampur rata kemudian diinkubasi di dalam es selama 30 menit. Larutan hasil rekombinasi dan sel kompeten diberi kejut panas (heat shock) pada suhu 42 0 C selama 50 detik yang selanjutnya segera dimasukkan ke dalam es selama 10 menit. Perlakuan kejut panas ini agar membran sel bakteri mudah ditembus (permeable) terhadap DNA yang akan dimasukkan. Setelah itu ditambahkan 800 µl SOC atau Luria Bertani (LB) + glukosa 20 mm kemudian diinkubasi ke dalam inkubator bergoyang (shacker incubator) selama ± 1.5 jam pada suhu 37 0 C dengan kecepatan 150 rpm untuk menyediakan aerasi. Setelah dikocok dengan inkubator bergoyang, sebanyak 100 µl hasil kultur di sebar dengan segitiga penyebar ke dalam media LA dan sisa kultur sebanyak 900 µl di sentrifugasi pada 3500 rpm di suhu 25 o C

9 selama 5 menit. Supernatan dibuang ± 800 µl sedangkan sisa supernatan 100 µl dan pelet diresuspensi kemudian disebar ke dalam media LA. Media LA yang digunakan terdiri atas tripton 10 g/l, yeast extract 5 g/l, NaCl 5 g/l dan bakto agar 15 g/l. Media diinkubasi dalam kondisi 37 0 C selama 16-20 jam kemudian dilihat koloni yang tumbuh. Seleksi transforman dilakukan dengan pengamatan terhadap koloni yang terbentuk. Pengujian Koloni Transforman yang Membawa Fragmen Sisipan Koloni bakteri yang tumbuh setelah transformasi dianalisis dengan metode PCR koloni. Koloni yang tumbuh pada media LA diambil dengan menggunakan tusuk gigi kemudian dipindahkan ke tabung Eppendorf. Pemindahan koloni dilakukan secara steril dalam laminar air flow cabinet. Persiapan PCR koloni dengan menyiapkan campuran reaksi yang terdiri atas, aquabides 2.75 µl, buffer complete 1.5 µl, dntps 0.3 µl, primer F 0.15 µl, primer R 0.15 µl, Taq polimerase 0.15 µl. Konfirmasi koloni dengan metode PCR pada vektor donor menggunakan primer M13F dan M13R, sedangkan untuk konfirmasi koloni pada vektor destinasi digunakan primer TcLFY-09F1 dan TcLFY- GWRev4. Tahap pertama PCR koloni untuk melisiskan dinding sel yaitu pengaturan program lisis 96 0 C selama 5 menit, 50 0 C selama 1 menit 30 detik, 96 0 C selama 1 menit 30 detik, 45 0 C selama 1 menit 30 detik, 96 0 C selama 1 menit, 40 0 C selama 1 menit. Program dihentikan sejenak untuk penambahan sebanyak 5 µl campuran reaksi ke dalam masing-masing tabung. Kemudian program PCR dilanjutkan kembali dengan program PCR yakni, 94 0 C selama 30 detik, 55 0 C selama 1 menit, 72 0 C selama 2 menit. Setelah pengujian koloni transforman dengan metode PCR selesai kemudian dielektroforesis dengan gel agarosa untuk mengetahui hasilnya. Transformasi Vektor Rekombinan ke dalam Agrobacterium tumefaciens Galur AGL-O (Doyle 1996) Setelah berhasil direkombinasikan ke vektor destinasi dan transformasi ke E. coli, tahap selanjutnya transformasi ke dalam Agrobacterium tumefaciens galur AGL-0. Transformasi ke Agrobacterium tumefaciens dilakukan dengan cara sebanyak 5-10 µl DNA plasmid dimasukkan ke dalam 500 µl sel kompeten, didiamkan di dalam es selama 15 menit. Setelah itu, diinkubasi kembali selama 5 menit di dalam nitrogen cair dan setelahnya 5 menit pada suhu 37 0 C. Lonjakan suhu dari nitrogen cair yang bersuhu sekitar - 196 0 C ke penangas air yang bersuhu 37 0 C bertujuan agar membran sel mudah ditembus DNA yang akan disisipkan. Sebanyak 1 ml YEP (Yeast Extract Pepton) ditambahkan ke dalam campuran sel kompeten dan DNA plasmid dan dikocok pada inkubator bergoyang selama 3 jam pada suhu 28 0 C. Setelah dikocok, larutan tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 3 menit. Supernatan yang dihasilkan sebagian dibuang dan sebanyak ± 200 µl supernatan yang tersisa diresuspensikan dengan pelet yang terbentuk lalu disebar ke dalam media LA yang telah berisi antibiotik kanamisin 25 ppm dan rifamisin 50 ppm. Inkubasi selama 2 hari pada suhu 28 0 C dalam kondisi gelap. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Amplifikasi Gen LEAFY dengan Primer Gateway Pemilihan primer oligonukleotida berguna untuk polymerase chain reaction (PCR), hibridisasi oligo dan sekuensing DNA. Desain primer yang tepat merupakan salah satu faktor penting dalam keberhasilan isolasi gen dan sekuensing DNA. Syarat oligonukleotida dapat digunakan sebagai primer untuk PCR bergantung pada beberapa faktor yakni, pergerakan asosiasi dan disosiasi cetakan primer ganda pada suhu penempelan primer dan pemanjangan primer, kestabilan ganda nukleotida mismatched dan lokasinya, efisiensi polimerase yang dapat mengenali dan memperpanjang mismatched duplex (Abd- Elsalam 2003). Amplikasi gen LEAFY bertujuan untuk menggandakan gen tersebut secara in vitro. Amplifikasi menggunakan kit dari Invitrogen dengan primer spesifik Gateway Gateway Tc- Leafy-Forward dan Gateway Tc-Leafy- Reverse. Primer tersebut disusun berdasarkan perancangan primer pada metode Gateway. Empat basa nukleotida GGGG diikuti situs attb kemudian ditambahkan 18-25 urutan basa nukleotida spesifik gen LEAFY. Urutan situs attb dan urutan basa nukleotida gen LEAFY dapat dilihat pada lampiran 3. Situs attb ditambahkan pada masingmasing primer, yakni attb1 pada bagian

10 forward dan attb2 pada bagian reverse. Situs attb ini disebut sebagai tempat pengikatan lamda (lamda attachment site) yaitu tempat integrasi DNA lamda ke dalam kromosom E. coli yang terletak di antara operon gal dan operon biotin (Yuwono 2005). Hasil amplifikasi gen LEAFY kemudian dielektroforesis dengan konsentrasi gel agarosa 0.8% untuk mengetahui gen tersebut teramplifikasi atau tidak. Hasil pengujian dengan elektroforesis gel agarosa menunjukkan pita berukuran sekitar 1200 pb (Gambar 6). Berdasarkan ukuran pita yang terlihat setelah elektroforesis dan dengan membandingkan tingkat kehomologian ukuran pita dengan berbagai gen yang terdapat dalam situs http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi. gen tersebut merupakan gen LEAFY. Ukuran ini mirip dengan cds berbagai gen yang mempunyai fungsi sejenis dari spesies tanaman lainnya seperti 1182 bp pada FLORICAULA/LEAFY-like protein 3 dari Buddleja davidii (Adkins et al. 2005), 1179 bp pada floricaula dari Titanotrichum oldhamii (Wang et al. 2004), 1194 bp pada LEAFY dari Clausena lansium (He et al. 2006), dan 1197 bp pada LEAFY dari Citrus sinensis (Pillitteri et al. 2004). Urutan sekuens basa nukleotida gen LEAFY dapat dilihat pada lampiran 4. Gen LEAFY telah teramplifikasi selanjutnya diekstraksi dan dimurnikan. 1200 bp (Gambar 6). Pita DNA yang terlihat setelah pengujian dengan gel agarosa selanjutnya diekstraksi dan dimurnikan. Gel diletakkan di atas transluminator ultraviolet (UV) T2201 untuk melihat pita yang akan dipotong. Pita DNA yang terlihat setelah penyinaran sinar UV dipotong dengan pisau potong (scalpel) kemudian diekstraksi dan dimurnikan. Ekstrasi dan pemurnian bertujuan untuk memurnikan DNA dari berbagai pengotor yang tidak diinginkan seperti protein dan RNA. Ukuran pita DNA hasil ekstraksi dan pemurnian hampir sama dengan ukuran pita setelah amplifikasi karena esktraksi dan pemurnian hanya menghilangkan pengotor yang ada pada DNA. Hasil ekstraksi dan pemurnian dielektroforesis dengan gel agarosa dan menghasilkan pita berukuran 1200 bp (Gambar 7). Hasil ekstraksi dan pemurnian kemudian direkombinasikan ke dalam vektor donor menggunakan metode Gateway. 1200 bp 12000 bp 1650 bp 1000 bp 850 bp 12000 bp 300 bp 200 bp 100 bp 1200 bp 1650 bp 1000 bp 850 bp 300 bp 200 bp 100 bp a M Gambar 6 Elektroforegram amplikon gen LEAFY dengan primer Gateway; (a) gen LEAFY berukuran 1200 bp, (M) marker 1 kb plus DNA Ladder. Hasil Ekstraksi dan Pemurnian DNA dari Gel Elektroforegram amplifikasi gen LEAFY menunjukkan gen tersebut berada pada ukuran a M Gambar 7 Elektroforegram ekstraksi dan pemurnian gen LEAFY dari gel; (a) gen LEAFY berukuran 1200 bp, (M) marker 1 kb plus DNA Ladder. Rekombinasi LEAFY pada Vektor Donor dan Vektor Destinasi Rekombinasi LEAFY pada vektor donor dan vektor destinasi pada dasarnya merupakan teknik pengklonan. Tujuan dari tahap ini adalah untuk memperbanyak dan mengisolasi DNA yang diklon. Pengklonan gen LEAFY sampai pada vektor destinasi menggunakan metode Gateway. Teknik pengklonan dengan metode Gateway diawali dengan rekombinasi pada vektor donor dan dilanjutkan dengan rekombinasi ke dalam vektor destinasi (vektor ekspresi).

11 Gen LEAFY yang telah diikat situs attb1 dan attb2 pada saat amplifikasi diekstraksi dan dimurnikan terlebih dahulu. Hasil amplifikasi yang telah mengalami ekstraksi dan pemurnian kemudian direkombinasikan ke dalam vektor donor pdonr TM 221. Vektor donor mempunyai situs attp1 dan situs attp2 yang merupakan tempat untuk rekombinasi dengan hasil PCR yang telah mempunyai situs attb1 dan situs attb2. Adanya situs untuk rekombinasi ini kemungkinan salah orientasi gen yang direkombinasikan tidak ada. Reaksi rekombinasi ini dikatalisis oleh enzim BP Clonase TM sehingga dalam metode Gateway reaksi rekombinasi pada vektor donor disebut reaksi BP (BP reaction). Reaksi BP pada metode Gateway dapat dilihat pada lampiran 6. Hasil rekombinasi gen LEAFY pada vektor donor kemudian ditransformasikan ke sel kompeten E. coli galur XL-1 Blue yang ditumbuhkan pada media LA yang telah ditambahkan antibiotik kanamisin 50 ppm. Penambahan kanamisin dikarenakan vektor donor yang digunakan mempunyai marka seleksi resisten terhadap antibiotik tersebut. Oleh karena itu, seleksi transforman dilakukan dengan mengamati koloni yang tumbuh setelah masa inkubasi. Marka seleksi vektor donor pdonr TM 221 dapat dilihat pada lampiran 7. Tidak seperti metode pengklonan biasa yang terkadang terdapat koloni putih dan koloni biru, akan tetapi koloni yang tumbuh dengan metode pengklonan Gateway semuanya berwarna putih (Gambar 8). Koloni putih yang tumbuh pada media seleksi diduga kuat membawa gen target. Untuk menguji koloni yang membawa gen sisipan (koloni rekombinan) dilakukan PCR koloni dengan sepasang primer universal M13. Koloni yang terbukti rekombinan setelah pengujian dengan PCR koloni diisolai DNA plasmidnya selanjutnya direkombinasikan ke vektor destinasi (vektor ekspresi). Plasmid rekombinan yang telah diikat oleh situs attl1 dan attl2 direkombinasikan ke vektor destinasi yang membawa situs attr1 dan attr2. Reaksi ini dikatalisis oleh enzim LR Clonase TM II sehingga dalam metode Gateway reaksi rekombinasi ini disebut reaksi LR (LR reaction). Mekanisme reaksi LR dapat dilihat pada lampiran 8. Vektor detinasi yang telah mengandung gen LEAFY (vektor rekombinan) ditransformasikan ke E. coli XL-1 Blue untuk pembiakan sel. Hasil rekombinasi ke vektor destinasi kemudian ditransformasikan ke sel kompeten E. coli galur XL-1 Blue yang ditumbuhkan pada media LA. Media ini ditambahkan antibiotik kanamisin 50 ppm. Hal ini dikarenakan pada vektor destinasi mengandung marka seleksi resisten terhadap antibiotik tersebut sehingga seleksi transforman dengan melihat koloni yang dapat tumbuh pada media tersebut (Gambar 9). Koloni yang tumbuh setelah reaksi LR lebih sedikit jumlahnya dibandingkan dengan koloni yang tumbuh setelah reaksi BP. Hal ini dikarenakan koloni rekombinan telah mengalami penyeleksian. Gambar 8 Koloni yang tumbuh setelah reaksi BP pada metode Gateway. Gambar 9 Koloni yang tumbuh setelah reaksi LR pada metode Gateway. Hasil Pengujian Koloni Rekombinan setelah Rekombinasi ke dalam Vektor Donor Hasil rekombinasi ke dalam vektor donor ditransformasikan ke E. coli yang bertujuan untuk pembiakan sel. Koloni bakteri yang tumbuh setelah transformasi ke dalam E. coli diuji dengan metode PCR koloni untuk memastikan koloni tersebut mengandung plasmid rekombinan. Pengujian koloni yang mengandung plasmid rekombinan dengan metode PCR koloni menggunakan sepasang primer universal M13. Elektroforegram PCR koloni menunjukkan bahwa dari sebelas koloni yang diujikan hanya ada empat koloni yang rekombinan yang ditunjukkan dengan adanya pita setelah elektroforesis (Gambar 10). Keberhasilan proses PCR koloni dapat diamati dari ukuran klon transforman. Ukuran pita yang terdapat pada elektroforegram menunjukkan ukuran sekitar 1650 bp. Terjadi

12 penambahan ukuran pita sekitar 450 bp dari ukuran pita awal setelah amplifikasi. Penambahan ukuran ini disebabkan karena primer yang digunakan primer universal M13 forward dan M13 reverse. Posisi kedua primer tersebut pada vektor donor terletak pada arah yang berlawanan sehingga kedua primer tersebut ikut teramplifikasi saat PCR koloni. Koloni rekombinan yang telah diuji dengan metode PCR koloni selanjutnya dikulturkan ke dalam media Luria Bertani (LB) untuk dijadikan sumber DNA. Media LB merupakan media kompleks yang terdiri atas tripton, ekstrak khamir, dan NaCl. Tripton berfungsi menyediakan asam amino dan peptida pendek sedangkan ekstrak khamir sebagai sumber nitrogen, gula, dan nutrisi organik maupun anorganik. Hasil kultur bakteri yang ditumbuhkan dari media LB kemudian diisolasi DNA plasmidnya untuk rekombinasi ke vektor destinasi. Secara prinsip isolasi DNA plasmid hampir sama dengan isolasi DNA kromosom. Perbedaan yang menonjol di antara keduanya ialah segi ukuran antara DNA plasmid dan DNA kromosom. DNA plasmid memiliki ukuran yang lebih kecil dibandingkan dengan DNA kromosom. Selain itu, DNA plasmid memiliki perbedaan konformasi dengan DNA kromosom. Hasil isolasi DNA plasmid dielektroforesis menggunakan gel agarosa 1%. Elektroforegram menunjukkan bahwa pita berada pada 2500 bp (Gambar 11). Ukuran ini menunjukkan ukuran gen sisipan yang berada pada plasmid rekombinan. DNA plasmid yang telah diisolasi selanjutnya direkombinasikan ke dalam vektor destinasi. 12000 bp 1650 bp 1650 bp 850 bp 300 bp 200 bp 100 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M Gambar 10 Elektroforegram PCR koloni rekombinasi LEAFY pada vektor donor; (1-11) koloni bakteri, (M) marker 1 kb plus DNA Ladder. 12000 bp 2500 bp 1650 bp 1000 bp 850 bp 300 bp 200 bp 100 bp 1 2 3 4 M Gambar 11 Elektroforegram ukuran gen sisipan pada plasmid rekombinan setelah reaksi BP; (1-4) gen sisipan LEAFY berukuran 2500 bp, (M) marker 1 kb plus DNA Ladder. Hasil Pengujian Koloni Rekombinan setelah Rekombinasi ke dalam Vektor Destinasi Pembiakan sel setelah rekombinasi ke dalam vektor destinasi yaitu dengan mentransformasikan vektor rekombinan ke dalam E. coli. Koloni bakteri yang tumbuh setelah transformasi ke dalam E. coli diisolasi DNA plasmidnya menggunkan kit dari Fermentas. Elektroforegram DNA plasmid menunjukkan pita berukuran sekitar 3000 bp (Gambar 12). Terdapat penambahan pita sekitar 1800 bp dari ukuran pita setelah amplifikasi. Ukuran pita ini menunjukkan gen sisipan yang berada pada plasmid rekombinan. Pengujian plasmid rekombinan yang telah diisolasi dilakukan dengan metode PCR plasmid. Pengujian dengan metode PCR plasmid ini menggunakan sepasang primer spesifik LEAFY, yakni TcLFY-09F1 + TcLFYGWRev4. Elektroforegram PCR plasmid menunjukkan bahwa ukuran pita DNA yang didapatkan sekitar 500 bp (Gambar 13). Pegurangan ukuran ini disebabkan karena primer yang digunakan dalam PCR plasmid disusun berdasarkan daerah yang menunjukkan homologi sekuens yang rendah di antara seluruh sekuens yang ada (less conserve region) dari gen LEAFY. Tidak seperti pengujian pada vektor donor yang menggunakan PCR koloni untuk menguji

13 plasmid rekombinan. Pengujian plasmid pada vektor destinasi menggunakan metode PCR plasmid dikarenakan gen sisipan turut serta diperbanyak. Sepasang primer spesifik gen LEAFY akan menempel pada DNA target dan memperbanyak DNA tersebut. 12000 bp 3000 bp 1650 bp 1000 bp 850 bp 300 bp 200 bp 100 bp 1 2 3 4 M Gambar 12 Elektroforegram gen sisipan pada plasmid rekombinan setelah reaksi LR; (1-4) gen sisipan LEAFY berukuran 3000 bp (M) marker 1 kb plus DNA Ladder. 12000 bp 1650 bp 1000 bp 500 bp 300 bp 200 bp 100 bp M a Gambar 13 Elektroforegram PCR plasmid pada reaksi LR; (M) marker 1 kb plus DNA Ladder, (a) gen LEAFY berukuran 500 bp. Hasil Transformasi Vektor Rekombian ke dalam Agrobacterium tumefaciens Galur AGL-O Transformasi ke dalam Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) bertujuan untuk menguji ekspresi pengaruh gen tersebut ke tanaman. Sel Agrobacterium yang membawa plasmid rekombinan digunakan untuk menginfeksi protoplast tanaman. Penggunaan Agrobacterium galur AGL-0 karena galur ini mempunyai virulensi yang tinggi dibandingkan galur Agrobacterium lainnya. DNA plasmid setelah rekombinasi pada vektor destinsi diisolasi kemudian ditransformasikan ke Agrobacterium dengan metode kejut dingin. Hal ini dikarenakan terjadi lonjakan suhu dari nitrogen cair yang bersuhu sekitar -1960C ke penangas air yang bersuhu 370C. Lonjakan suhu tersebut akan menjadikan membran sel Agrobacterium menjadi tidak selektif terhadap molekul asing sehingga DNA sisipan dapat masuk. Hasil transformasi menunjukkan bahwa koloni bakteri yang tumbuh selama inkubasi ± 2 hari hanya terdapat 2 koloni (Gambar 14). Proses inkubasi ditempatkan pada ruang gelap yang bertujuan untuk menyesuaikan kondisi Agrobacterium yang hidup dalam tanah. Koloni yang tumbuh dimedia seleksi lebih sedikit dibandingkan koloni yang tumbuh saat transformasi ke E. coli. Hal ini dikarenakan A. tumefaciens memiliki jumlah salinan yang lebih (copy number) sedikit dibandingkan E. coli. Koloni yang tumbuh diisolasi DNA plasmidnya untuk menguji koloni tersebut rekombinan. Hasil isolasi DNA plasmid menunjukkan pita yang terlihat berukuran sekitar 12000 bp (Gambar 15). Isolasi DNA plasmid saja tidak cukup kuat untuk membuktikan bahwa koloni tersebut rekombinan. Oleh karena itu, perlu diuji kembali menggunakan metode PCR plasmid. Pengujian dengan metode PCR plasmid ini menggunakan primer spesifik LEAFY, yakni TcLFY-09F1 + TcLFY-GWRev4. Sepasang primer ini akan menempel pada cetakan DNA yang memiliki urutan basa yang komplementer dengan urutan basa primer. Primer akan membentuk utas DNA baru dengan bantuan enzim Taq polimerase. Hasil PCR plasmid menunjukkan bahwa pita yang di dapatkan berukuran sekitar 500 bp (Gambar 15). Gambar 14 Koloni bakteri yang tumbuh setelah transformasi ke dalam Agrobacterium tumefaciens.

14 Ukuran pita gen LEAFY setelah PCR plasmid setelah transformasi ke Agrobacterium menjadi kecil dibandingkan ukuran pita setelah amplifikasi. Ukuran pita gen LEAFY pada saat amplifikasi berukuran 1200 bp sedangkan hasil PCR plasmid ukuran pita berubah menjadi 300 bp. Hal ini dikarenakan kedua PCR plasmid tersebut menggunakan primer khusus ekspresi. Primer tersebut disusun berdasarkan daerah yang menunjukkan homologi sekuens yang rendah di antara seluruh sekuens yang ada (less conserve region) dari gen tersebut. 12000 bp 12000 bp 1650 bp 1000 bp 850 bp 300 bp 200 bp 1650 bp 1000 bp 850 bp 500 bp 300 bp 100 bp 200 bp 100 bp 1 2 3 4 M 1 2 M a b Gambar 15 Elektroforegram (a) DNA plasmid setelah transformasi ke dalam Agrobacterium; (1-4) DNA plasmid berukuran 12000 bp, (M) marker 1 kb plus DNA Ladder, (b) plasmid setelah PCR plasmid; (1-2) DNA plasmid LEAFY berukuran 500 bp, (M) marker 1 kb plus DNA Ladder. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Gen LEAFY lengkap telah berhasil disisipkan pada vektor ekspresi menggunakan metode Gateway. Ukuran gen LEAFY pada plasmid rekombinan setelah reaksi BP sebesar 2500 bp sedangkan setelah reaksi LR sebesar 3000 bp. Hasil PCR plasmid setelah rekombinasi ke vektor ekspresi dan transformasi ke dalam Agrobacterium diperoleh ukuran pita sekitar 500 bp. Saran Saran yang dapat diberikan yaitu DNA rekombinan yang telah ditransformasikan ke Agrobacterium tumefaciens galur AGL-0 perlu ditransformasikan ke tanaman untuk mengetahui pengaruh gen LEAFY terhadap pembungaan pada tanaman. DAFTAR PUSTAKA Abd-Elsalam KA. 2003. Bioinformatics tools and guideline for PCR primer design. African journal of Biotechnology 2:93-95. Adkins JA, Williamson JD, Werner DJ. 2005. Cloning and expression analysis of FLORICAULA/LEAFY homologs in Buddleja davidii (Unpublished). Submitted (07-Sep-2005) Plant Science University of Rhode Island. Bernard P, Couturier M. 1992. Cell killing by the F plasmid ccdb protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. J Mol Biol 226:735-745. Blazquez MA, Ferrandiz C, Madueno F, Parcy F. 2006. How floral meristems are built. Plant Mol Biol 60: 855-870. Chaidamsari et al. 2006. Isolation and characterization of an AGAMOUS homologue from cocoa. Plant Sci 170: 968-975. Chaidamsari T. 2005. Biotechnology for cocoa pod borer resistance in cocoa [tesis]. Wageningen: Wageningen University. Coen ES, Meyerowitz EM. 1991. The war of the whorls: genetic interactions

15 controlling flower development. Nature 353: 31 37. [Depperin] Departemen Perindustrian. 2007. Gambaran sekilas industri kakao. [terhubung berkala]. http://www.depperin.go.id [30 Agustus 2010]. [Deptan] Departemen Pertanian. 2005. Prospek dan arah pengembangan agribisnis kakao. [terhubung berkala]. http://www.deptan.go.id [30 Agustus 2010]. Doyle K. 1996. Promega Protocol and Application Guide. Third Edition. USA: Promega Corporation. Hlm 41-54. Fermentas. 2006. GeneJet TM plasmid miniprep kit. Life Science. Hartley JL, Temple GF, Brasch MA. 2000. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res 10:1788-1795. He XH, Guo YZ, Li YR. 2006. Study on LFY homolog genes of several fruit trees (Unpublished). Submitted (17-APR- 2006) Department of Horticulture, GuangXi University. Huala E, Sussex IM. 1992. LEAFY interacts with floral homeotic genes to regulate Arabidopsis floral development. The Plant Cell 4:901-913. Hwang HS, Gelvin SB. 2004. Plant proteins that interact with virb2, the Agrobacterium tumefaciens pilin protein, mediate plant transformation. The Plant Cell 20:2661-2680. Invitrogen. 2003. Gateway technology: a universal technology to clone DNA sequences for functional analysis and expression in multiple systems. California: Life Technologies. Invitrogen. 2010. PureLink TM quick gel extraction kit. California: Life Technologies. Invitrogen. 2010. Platinum Taq DNA polymerase. California: Life Technologies. Jonas NL. 2003. PCR: Principles, procedures, and parameters. Di dalam: Theophilus BDM, Ralpley R, editor. Methods in Molecular Biology: PCR Mutation Detection Protocols. New Jersey: Humana Pr. Hlm 37-46. Karimi M, Decpiker A, Hilson P. 2007. Recombinational cloning with plant gateway vectors. Plant Physiology 145:1144-1154. Koolman Jan, Klaus HR. 2000. Atlas Berwarna dan Teks Biokimia. Wanandi SI, penerjemah; Jakarta: Hipokrates. Terjemahan dari: Color Atlas of Biochemistry. Lohmann JU, Weigel D. 2002. Building beauty: the genetic control of floral patterning. Dev Cell 2: 135 142. Magnani E, Bartling L, Hake S. 2006. From gateway to multisite gateway in one recombination event. BMC Molecular Biology 7: 1-7. Maizel A. 2005. The floral regulator LEAFY evolves by substitutions in the DNA binding domain. Science 308: 260-263. N Goran JAK, Laurent V, Risterucci AM, Lanaud C. 1994. Comparative genetic diversity studies of Theobroma cacao L. using RFLP dan RAPD markers. Heredity 7: 589-597. Pillitteri LJ, Walling IL, Lovatt CJ. 2004. Characterization of cslfy and csap1, homologs LEAFY and APETALA1, from Washington navel orange (Unpublished). Submitted (08-JUL- 2003) Botany and Science, University of California. Riechmann JL, Ratcliffe OJ. 2000. A genomic perspective on plant transcription factors. Curr Opin Plant Biol 3: 423-434. Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular Cloning a Laboratory Manual. Ed ke-3. New York: Cold Spring Harbor Laboratory. Simpson GG, Gendall AR, Dean C. 1999. When to switch to flowering. Annu Rev Cell Dev Biol 15:519:50. Souer E et al.. 2008. Patterning of inflorescences and flowers by the F-box protein double top and the LEAFY homolog aberrant leaf and flower of petunia. The Plant Cell 20 :2033-2048. Souer E et al.. 1998. Genetic control of branching pattern and floral identity during Petunia inflorescence development. Development 125: 733-742.

16 Sudarmadji D, Sosromarsono S, Wardojo S, Mattjik AA. 1990. Pengaruh Serangan Helopeltis Antonii terhadap tingkat layu pentil dan berat kering biji kakao. Menara Perkebunan 58: 51-55. Suharsono S. 2000. Prinsip Amplifikasi DNA dengan PCR. Bogor: Pusat Antar Universitas Bioteknologi IPB. Tzafira T, Citovsky V. 2002. Partners in infection: Host proteins involved in the transformation of plant cells by Agrobacterium. Trends Cell Biol 12:121-129. Walhout AJM et al.. 2000. Protein interaction mapping in C. elegans using proteins involved in vulval development. Science 287: 116-122. Wang CN, Moller M, Cronk QC. 2004. Altered expression of GFLO, the Gesneriaceae homologue of FLORICAULA/LEAFY is associated with the transition to bulbil formation in Titanotrichum oldhamii. Dev. Genes Evol 3:121-127. Wood GAR, Lass RA. 1985. Cocoa. London: Longman Group Limited. Yuwono T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta: Andi. Yuwono T. 2005. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga. Zheng X et al.. 2007. The cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter sequence alters the level and patterns of activity of adjacent tissue- and organspecific gene promoters. Plant Cell Rep 26:1195 1203.

LAMPIRAN 17

18 Lampiran 1 Tahapan isolasi dan kontruksi gen LEAFY ke vektor pengklonan Isolasi RNA total bantalan bunga kakao Sintesis utas pertama cdna Amplifikasi fragmen gen LEAFY Elektroforesis gel agarosa 1% Ekstraksi dan pemurnian fragmen gen LEAFY dari gel Pengklonan ke vektor pgem-t Easy Analisis koloni transforman dengan teknik PCR (PCR koloni) Isolasi DNA plasmid Sekuensing Analisis hasil sekuensing

19 Lampiran 2 Tahapan penelitian penyisipan gen LEAFY pada vektor ekspresi dan transformasi ke dalam Agrobacterium sp. Desain primer untuk Gateway Amplifikasi LEAFY dengan primer Gateway Ekstraksi dan pemurnian dari gel Rekombinasi LEAFY pada vektor donor dan vektor destinasi Transformasi pada E. coli XL-1 Blue Isolasi DNA plasmid Konfirmasi plasmid rekombinan dengan teknik PCR Transformasi LEAFY pada ke dalam Agrobacterium tumefaciens AGL-0 Isolasi DNA plasmid Konfirmasi plasmid rekombinan dengan teknik PCR

20 Lampiran 3 Sepasang primer yang dirancang berdasarkan metode Gateway Forward primer: attb1 Gateway Tc-Leafy-F 5 -GGGG CCA ACT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T ATGGATCCGGAGGCCTTCAC-3 18-25 basa nukleotida gen LFY Reverse primer attb2 Gateway Tc-Leafy-R 5 - GGGG CC AAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT GGTGACCTTACAGCGTGACA-3 18-25 basa nukleotida gen LFY

Lampiran 4 Sekuens gen LEAFY dari bantalan bunga aktif kakao >dg-2488_m13f&r (alignment dgn dg-260) CAACCATGGATCCGGAGGCCTTCACTACTGGGGGCTTCTTCAAGTGGG ACCCAAGAGGAGTAGTGGCGCCAACCCCGGCGCGCTTGATGGAGGCT GTGGCGCCTCCTCAGCCGCAGACGGCTGCTGCGGTTGCGGCTGCTTAC ATGGGGAGGGCGCCTAGGGAGCTCGGAGGGATAGAGGAGTTGTTTCA AGCTTATGGGATCAGATACTACACTGCTGCGAAGATAGCCGAGTTAGG GTTCACTGTGAGCACCCTTTTAGGCATGAAGGAGGAGGAGCTAGATGA GATGATGAATAGCGTGTCGCANATATTCAGGTGGGAGCTGCTANTGGG TGAGAGGTATGGTATTAAGGCGGCTGTTAGAGCTGAAAGGAGAAGGC TTGAAGAAGAGGATTCTAGGCGGCGACACCTGGTTTCAGGTGACACCA CCAACGCTCTTGATGCCCCCTCCCAGGAAGGTTTTATCAGAGGAGCCA GTGCAGCAAGAGAAAGAGGCGGCAGGGAGCGGTGGAGGGGGCACGT GGGAGGTGGTAGTAGCTGGGGGAAGGAAGAAACAGCGGCGCAGGAA AGGGGCCGAAGAAAGTGGTAGAAGTTGATAATGAAGATGAATTAGAA GGTGCTGAAGATGATGAAAATGGTGATATTGGAGGCTACGAGAGACA GCGAGAGCACCCGTTCATTGTCACAGAGCCTGGTGAGGTAGCACGAG GCAAAAAGAACGGTCTCGATTACCTCTTCCATCTCTACGAGCAATGCC GGGAGTTCTTGATTCAAGTCCAAAACATTGCCAAGGAGCGTGGGGAA AAATGCCCTACGAAGGTGACCAATCAAGTTTTCAGGTATGCTAAGAAG GCTGGGGCAAGCTACATTAACAAACCCAAGATGCGACACTACGTGCAT TGCTATGCCCCGCACTGCCTTGACGAGGAGGCATCGAATGCGCTGAGG AGAGCTTTCAAGGAGAGAGGCGAGAATGTTGGGGCTTGGAGACAGGC CTGCTACAAGCCTCTTGTGGCCATAGCGGCGCGCCAGGGTTGGGACAT TGATGCAATTTTCAATGCTCATCGCCGTCTTGCTATTTGGTATGTTCCC ACCAAGCTCCGACAGCTTTGTCACGCTGTAAGGTCACC 1131 21

Lampiran 5 Elektroferogram gen LEAFY 22

23 Lampiran 6 Reaksi BP pada metode pengklonan Gateway Vektor Donor Klon Entri 90-99% klon positif

Lampiran 7 Marka Seleksi vektor donor (pdonr TM 221) 24