PENGARUH LEVEL GLISEROL DALAM PENGENCER TRIS- KUNING TELUR TERHADAP MEMBRAN PLASMA UTUH DAN RECOVERY RATE SPERMA KAMBING PERANAKAN ETAWAH POST THAWING THE EFFECT OF GLYCEROL LEVEL ON TRIS-YOLK EXTENDER TO INTACT PLASMA MEMBRANE AND RECOVERY RATE SPERM ETAWAH CROSSBREED GOAT POST THAWING Rona Irawan*, Siti Darodjah Rasad**, Nurcholidah Solihati** Universitas Padjajaran *Alumni Fakultas Peternakan Universitas Padjajaran Tahun 2016 **Dosen Fakultas Peternakan Universitas Padjajaran e-mail: ronairawan11@gmail.com ABSTRAK Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh level gliserol dalam pengencer tris-kuning telur terhadap kualitas Membran Plasma Utuh (MPU) dan Recovery Rate (RR) sperma Kambing Peranakan Etawah (PE) post thawing. Penelitian ini menggunakan metode Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan lima perlakuan yaitu P1 = 5% gliserol, P2 = 6% gliserol, P3 = 7% gliserol, P4 = 8% gliserol, dan P5 = 9% gliserol dengan lima kelompok. Hasil penelitian menunjukkan bahwa persentase MPU dan RR spermatozoa post thawing pada level gliserol 6% (masing-masing 50,90% dan 56,30%) nyata lebih tinggi dibandingkan dengan level gliserol 5% (masing-masing 43,20% dan 47,69%), 7% (masing-masing 43,60% dan 49,59%), 8% (masing-masing 40,40% dan 46,46%) dan 9% (masing-masing 40,70% dan 40,64%). Berdasarkan hasil pengamatan, dapat disimpulkan bahwa gliserol dalam pengencer tris-kuning telur berpengaruh positif sampai level tertentu terhadap MPU dan RR dengan level gliserol sebesar 6% dapat memberikan hasil terbaik terhadap MPU dan RR sperma kambing Peranakan Etawah post thawing. Kata kunci : gliserol, membran plasma utuh, post thawing, recovery rate ABSTRACT The aim of the research was to determine the effect of glycerol in tris-yolk extender on Intact Plasma Membrane (IPM) and Recovery Rate (RR) Etawah Crossbreed goat sperm post thawing. The experiment was used Randomized Block Design (RBD) with five treatment that is P1 = 5% glycerol, P2 = 6% glycerol, P3 = 7% glycerol, P4 = 8% glycerol and P5 = 9% glycerol with five block. The result showed that level glycerol 6% (50,90% and 56,30% respectively) were significantly higher than that found in glycerol 5% (43,20% and 47,69% respectively), 7% (43,60% and 49,59% respectively), 8% (40,40% and 46,46% respectively), and 9% (40,70% and 40,64% respectively). According to the results, it was concluded that glycerol in tris-yolk extender was significantly positive effect until certain level on IPM and RR with level glycerol 6% was the best level on IPM and RR Etawah Crossbreed goat sperm post thawing. Keyword : glycerol, intact plasma membrane, post thawing, recovery rate
PENDAHULUAN Kualitas semen beku yang rendah merupakan salah satu faktor pembatas terhadap keberhasilan program Inseminasi Buatan (IB) pada kambing. Semen kambing mudah mengalami kerusakan selama proses pembekuan karena terjadinya pembentukan kristalkristal es yang dapat menyebabkan kematian sperma. Dengan adanya faktor pembatas dalam keberhasilan IB pada kambing khususnya kambing Peranakan Etawah (PE), maka perlu dilakukan perbaikan dan peningkatan dalam kontrol perlakuan selama IB. Penambahan gliserol sebagai krioprotektan dapat membantu untuk mengatasi kualitas semen beku pada kambing. Hal ini didasarkan pada peranan gliserol dalam melindungi membran plasma, mencegah kerusakan fisik dan fungsional sel sperma selama proses pembekuan semen akibat terbentuknya kristal-kristal es. Dengan adanya proses pencegahan kerusakan fisik yang diakibatkan oleh pembentukan kristal-kristal es, maka keutuhan dari sperma kambing akan meningkat. Penambahan gliserol memiliki batas level tertentu sehingga gliserol yang ditambahkan pada semen tidak bersifat toksik pada sperma. Pembatasan level gliserol perlu dilakukan untuk mencari sampai mana batas level gliserol akan memberikan dampak toksik terhadap sperma. Perbedaan level gliserol yang diberikan pada setiap parameter diduga akan memberikan hasil yang berbeda terhadap parameter yang diukur. Pemberian level gliserol yang berbeda pada pengencer yang digunakan akan memberikan daya kerja dalam melindungi membran plasma dari sperma pada pengamatan Membran Plasma Utuh (MPU) dan memberikan perlindungan pada sperma untuk hidup kembali setelah dibekukan yang dilakukan pada pengamatan Recovery Rate (RR). Pengaruh level gliserol yang optimal terhadap kualitas sperma belum banyak dilaporkan. Oleh karena itu penelitian ini dilakukan untuk melihat pengaruh level gliserol dalam pengencer tris-kuning telur terhadap Membran Plasma Utuh dan Recovery Rate sperma Kambing Peranakan Etawah post thawing. BAHAN DAN METODE Objek penelitian yang digunakan yaitu semen kambing jantan peranakan etawah yang berasal dari lima ekor kambing pejantan sehat dengan bahan dan alat yang digunakan yaitu gliserol, tris, kuning telur, vaseline, air hangat, pewarna eosin, nitrogen (N 2 ) cair, penicillin dan streptomycin, vagina buatan, gelas objek, mikroskop, kamar hitung Neubauer, dan lainlain. Semen segar ditampung menggunakan vagina buatan sebanyak satu kali ejakulasi. Semen yang telah ditampung segera dilakukan pengamatan makroskopis meliputi warna, bau, ph, konsistensi dan volume dan mikroskopis meliputi gerakan massa, konsentrasi total sperma, motilitas, membran plasma utuh dan abnormalitas. Semen yang telah dievaluasi kemudian diencerkan dalam pengencer tris-kuning telur dengan komposisi 3,634 gram kristal tris (hydroxymethyl aminomethane), 0,5 gram kristal fruktosa, 1,99 gram asam sitrat monohidrat, aquabidest 100 ml, kuning telur 20%, 1000 IU penicilin dan 1 mg streptomycin.
Semen encer dibagi kedalam lima tabung dan ditambahkan gliserol sesuai perlakuan yaitu sebesar 5%, 6%, 7%, 8% dan 9%. Semen cair yang telah disiapkan kemudian dikemas kedalam straw yang selanjutnya dilakukan tahap ekuilibrasi selama 4 jam dalam suhu 5 o C. Straw kemudian dilanjutkan oleh proses pre freezing selama 8-9 menit pada suhu -80 o C sampai -100 o C. Setelah proses pre freezing straw dimasukkan kedalam nitrogen cair untuk dibekukan pada suhu -196 o C selama 30 menit. Straw beku kemudian dicairkan kembali (thawing) dalam air hangat dengan suhu 37-38 o C selama 30 detik. Semen hasil thawing diamati dibawah mikroskop dengan parameter motilitas, membran plasma utuh dan recovery rate sperma. Masing-masing perlakuan diulang selama 5 kali. Data yang diperoleh dianalisis dengan metode Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan uji lanjut jarak berganda Duncan. HASIL DAN PEMBAHASAN Karakteristik Semen Segar Karakteristik semen segar digunakan sebagai standar kelayakan semen untuk diproses lebih lanjut. Selain sebagai standar kelayakan, karakteristik semen segar digunakan sebagai dasar perhitungan komposisi pengencer yang akan digunakan. Evaluasi semen segar dilakukan secara makroskopis dan mikroskopis. Hasil evaluasi semen segar kambing PE disajikan dalam Tabel 2. Tabel 2. Rataan Nilai Karakteristik Semen Segar Kambing Peranakan Etawah (PE) Karakteristik Semen Kelompok 1 2 3 4 5 Volume (ml) 1,00 0,80 1,80 0,80 0,70 Warna Putih susu Putih susu Putih susu Putih Putih susu susu Konsistensi Kental Kental Kental Kental Kental ph 6,5 6,7 7 6,8 6,5 Gerakan Massa +++ +++ +++ +++ +++ Konsentrasi Total Sperma (x 356 364 349 335 346 10 7 sel/ml) Motilitas (%) 80,33 82,77 80,51 81,19 79,20 Membran Plasma Utuh (%) 85,00 85,50 87,50 86,50 79,50 Abnormalitas (%) 1,00 2,00 1,50 1,50 1,50 Pengaruh Level Gliserol Dalam Pengencer Tris-Kuning Telur Terhadap Membran Plasma Utuh (MPU) Sperma Kambing Peranakan Etawah Post Thawing Membran Plasma Utuh (MPU) dapat diamati dengan menggunakan metode Hypoosmotic Swelling (HOS test). Evaluasi MPU dapat diamati dengan cara membandingkan sperma yang memiliki ekor melingkar dengan sperma yang memiliki ekor lurus. Hasil
persentase membran plasma utuh dalam pengencer tris-kuning telur dengan pengaruh level gliserol dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3. Persentase Membran Plasma Utuh (MPU) Semen Beku Post Thawing Kambing PE pada Berbagai Level Gliserol Kelompok Perlakuan Total P1 P2 P3 P4 P5 Kelompok.(%)... 1 42,00 53,50 43,00 36,50 39,50 214,50 2 42,50 47,00 42,00 40,00 42,00 213,50 3 40,00 48,00 43,50 43,00 40,00 214,50 4 46,50 55,00 45,50 40,00 38,00 225,00 5 45,00 51,00 44,00 42,50 44,00 226,50 Jumlah 216,00 254,50 218,00 202,00 203,50 1094,00 Rataan 43,20±2,56 50,90±3,44 43,60±1,29 40,40±2,58 40,70±2,33 218,80 Keterangan : P1 = Penambahan gliserol 5% P2 = Penambahan gliserol 6% P3 = Penambahan gliserol 7% P4 = Penambahan gliserol 8% P5 = Penambahan gliserol 9% Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa perlakuan level gliserol dalam pengencer triskuning telur memiliki pengaruh yang berbeda nyata (p < 0,05) terhadap membran plasma utuh sperma kambing Peranakan Etawah (PE) post thawing. Menurut Sukmawati, dkk. (2014) proses pembekuan menyebabkan membran plasma rusak sebagai akibat terbentuknya peroksidasi lipid yang mengakibatkan perubahan struktur dan fungsi membran dan ketika dicairkan kembali menyebabkan perubahan aktivitas protein dan perubahan permeabilitas terhadap air dan zat terlarut. Bentuk dan ciri kerusakan sel sperma akibat peroksidasi lipid ialah menurunnya motilitas dan kapasitas fertilisasi, kerusakan enzim intraseluler dan kerusakan struktur membran plasma (Guthrie dan Welch, 2012). Menurut Parks dan Graham (1992) gliserol dalam melindungi membran plasma akan mengikat gugus pusat fosfolipid sehingga mengurangi ketidakstabilan membran dan berinteraksi dengan membran untuk mengikat protein dan glikoprotein sehingga menyebabkan partikel-partikel antar membran terkumpul. Gliserol juga akan masuk ke dalam membran plasma dengan jalan menyeimbangkan konsentrasi intra dan ekstraseluler. Cairan yang tadinya keluar dengan cara eksoosmosis akan masuk kembali ke dalam membran dan selanjutnya menyeimbangkan kandungan air intra dan ekstraseluler (Tambing, dkk., 2000).
Pengaruh Level Gliserol Dalam Pengencer Tris-Kuning Telur Terhadap Recovery Rate (RR) Sperma Kambing Peranakan Etawah Post Thawing Recovery Rate perlu diamati untuk mengetahui sejauh mana laju penurunan motilitas sperma yang terjadi. Hasil persentase recovery rate dalam pengencer tris-kuning telur dengan pengaruh level gliserol dapat dilihat pada Tabel 5. Tabel 5. Persentase Recovery Rate (RR) Semen Beku Post Thawing Kambing PE pada Berbagai Level Gliserol Kelompok Perlakuan Total P1 P2 P3 P4 P5 Kelompok.(%)... 1 49,79 62,24 51,87 44,09 40,53 248,54 2 49,43 53,69 48,33 46,99 38,15 236,58 3 41,40 54,34 49,68 51,76 47,77 244,95 4 49,27 55,98 50,72 47,37 38,49 241,83 5 48,56 55,24 47,35 42,08 38,26 231,49 Jumlah 238,45 281,49 247,95 232,29 203,20 1203,39 Rataan 47,69±3,55 56,30±3,43 49,59±1,81 46,46±3,67 40,64±4,10 240,68 Keterangan : P1 = Penambahan gliserol 5% P2 = Penambahan gliserol 6% P3 = Penambahan gliserol 7% P4 = Penambahan gliserol 8% P5 = Penambahan gliserol 9% Hasil penelitian ini memperlihatkan perlakuan P2 yang memiliki persentase RR paling tinggi. Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa perlakuan level gliserol dalam pengencer tris-kuning telur memiliki pengaruh yang berbeda nyata (p < 0,05) terhadap recovery rate sperma kambing Peranakan Etawah (PE) post thawing. Sperma sangat cepat terpengaruh oleh perbedaan suhu baik selama proses pendinginan, pembekuan ataupun thawing. Sperma akan beradaptasi dengan pengencernya pada saat ekulibrasi, sehingga dapat menurunkan persentase motilitas sperma pada saat pembekuan. Kerusakan sel akibat pembekuan dapat terjadi karena dehidrasi, peningkatan konsentrasi elektrolit, serta terbentuknya kristal es intraseluler yang dapat mempengaruhi permeabilitas dinding sel dan pada akhirnya sperma kehilangan daya motilitasnya (Zelpina, dkk., 2012). Hilangnya daya motilitas sperma selama proses pembekuan akan berpengaruh terhadap laju pemulihan (recovery rate) sperma setelah mengalami pencairan kembali (Hafez, 2000). Menurut Mumu (2009) penggunaan gliserol sampai pada tingkat 7% kedalam pengencer tris-kuning telur masih mampu untuk mencegah terjadinya kejutan dingin (cold shock) sehingga daya tahan hidup spermatozoa masih dapat dipertahankan. Perlindungan yang tidak optimal kemungkinan disebabkan oleh penggunaan level gliserol yang berlebihan sehingga menyebabkan efek toksisitas. Efek toksisitas dari gliserol adalah memodifikasi
struktur membran plasma dan pada konsentrasi yang tinggi menghambat metabolisme energi (Tambing, dkk., 2000). SIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian dapat ditarik kesimpulan bahwa: 1. Level gliserol dalam pengencer tris-kuning telur berpengaruh positif sampai level tertentu terhadap keutuhan membran plasma dan recovery rate sperma kambing Peranakan Etawah post thawing. 2. Level gliserol sebesar 6% dalam pengencer tris-kuning telur memberikan hasil terbaik terhadap keutuhan membran plasma dan recovery rate sperma kambing Peranakan Etawah post thawing. SARAN Penggunaan level gliserol sebesar 6% dalam pengencer tris-kuning telur dapat digunakan untuk pembuatan semen beku oleh para peneliti yang akan melakukan pembibitan pada kambing Peranakan Etawah (PE) dengan menggunakan program Inseminasi Buatan (IB). UCAPAN TERIMAKASIH Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian penugasan ALG Laboratorium Reproduksi Ternak dan Inseminasi Buatan yang telah memberikan dukungan materi penelitian. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada Dr. agr. Ir. Rd. Siti Darodjah Rasad, MS., selaku Pembimbing Utama, Dr. Nurcholidah Solihati, S.Pt., M.Si., selaku Pembimbing Anggota, tim Laboratorium Reproduksi Ternak dan Inseminasi Buatan, kedua orang tua penulis dan rekan-rekan yang tidak dapat disebutkan satu persatu. DAFTAR PUSTAKA Guthrie, H. D. and Welch, G. R. 2012. Effects of reactive oxygen species on sperm funtion. Sci Verse Science Direct. Theriogenol. 78:1700-1708. Hafez, E. S. E. 2000. Preservation and cryopreservation of gametes and embryos. In: B. Hafez and E. S. E Hafez (Ed) Reproduction in Farm Animals. 7 th edition. Lippincot Williams & Wilkins. Philadelphia. Mumu, I. M. 2009. Viabilitas semen sapi Simmental yang dibekukan menggunakan krioprotektan gliserol. J. Agroland. 16 (2): 172-179. Parks, J.E. and J.K. Graham. 1992. Effects of cryopreservation procedures on sperm membranes. Theriogenology, 38 : 209-222.
Sukmawati, E, R. I. Arifiantini dan B. Purwantara. 2014. Daya Tahan Spermatozoa terhadap Proses Pembekuan pada Berbagai Jenis Sapi Pejantan Unggul. JITV 19(3): 168-175 Tambing, S. N, M. R. Toelihere, T. L. Yusuf dan I. K. Sutama. 2000. Pengaruh Gliserol Dalam Pengencer Tris Terhadap Kualitas Semnien Beku Kambing Peranakan Etawah. Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner Vol. 5 No. 2 Hal. 1-8 Zelpina, E, B. Rosadi dan T. Sumarsono. 2012. Kualitas Sperma Post Thawing dari Semen Beku Sapi Perah. Jurnal Ilmu-Ilmu Peternakan Vol. XV No. 2 : 94-102.
LEMBAR PENGESAHAN PEMBIMBING DAN PERNYATAAN PENULIS Yang bertanda tangan di bawah ini, saya: Nama : Rona Irawan NPM : 200110120129 Judul Skripsi : Pengaruh Level Gliserol Dalam Pengencer Tris-Kuning Telur Terhadap Membran Plasma Utuh Dan Recovery Rate Sperma Kambing Peranakan Etawah Post Thawing Menyatakan bahwa artikel ini merupakan hasil penelitian penulis, data dan tulisan ini bukan hasil karya orang lain, ditulis dengan kaidah-kaidah ilmiah dan belum pernah dipublikasikan. Demikian pernyataan ini dibuat dengan sebenar-benarnya, tanpa tekanan dari pihak manapun. Penulis bersedia menanggung konsekuensi hukum apabila ditemukan kesalahan dalam pernyatan ini. Dibuat di Jatinangor, Mei 2016 Mengetahui Pembimbing Utama, Penulis, Dr. agr. Ir. Rd. Siti Darodjah Rasad, MS Rona Irawan Pembimbing Anggota, Dr. Nurcholidah Solihati, S.Pt., M.Si