III. METODE PENELITIAN A. Materi, lokasi, dan waktu penelitian 1. Materi penelitian 1.1. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah labu Erlenmeyer, beaker glass, tabung reaksi, cawan petri, tangkai Drugalsky, pipet ukur, pipet tetes, mikropipet, tip, filler, spatula, jarum inokulasi, kompor gas, timbangan analitik, hot plate and magnetic stirer, kulkas standar, burret, autoclave, oven, kertas cakram, shaker incubator, inkubator, blender, saringan, corong, dandang, pembakar spirtus, gunting, mikroskop, sprayer alkohol, tabung ependorf, baki, penggaris, spectrophotometer, dan ph universal. 1.2. Bahan Bahan-bahan yang digunakan terdiri susu kedelai, kultur bakteri Bacillus cereus (koleksi Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Unsoed), isolat terbaik kultur Bifidobacterium sp. (koleksi Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Unsoed) dari penelitian sebelumnya, kultur Lactobacillus bulgaricus dan kultur Streptococcus thermophillus (koleksi Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Unsoed), indikator phenolptalein, susu bubuk skim, sukrosa, ekstrak ragi 0,1%, NaOH 0,1 N, Media Nutrient Agar (NA), media Nutrient Broth (NB), media de Mann Rogosa Sharpe Agar (MRSA), media de Mann Rogosa Sharpe Broth (MRSB), anaerob jar, alumunium foil, spirtus, kapas, tissue, label, wrapper, akuades steril, alkohol 70%. 2. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto selama bulan Juli Desember 2014.
B. Metode Penelitian 1. Rancangan percobaan Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial. Faktor pertama yaitu lama inkubasi soyghurt yang diberi penambahan Bifidobacterium sp. pada suhu 37 o C dan faktor kedua adalah perbandingan konsentrasi Bifidobacterium sp. pada soyghurt. Setiap perlakuan diulang sebanyak 3 kali. a. Lama inkubasi soyghurt pada suhu 37 o C: T 0 = 0 jam T 1 = 4 jam T 2 = 8 jam T 3 = 12 jam T 4 = 16 jam T 5 = 20 jam T 6 = 24 jam b. Konsentrasi Bifidobacterium sp. pada soyghurt : K 0 = S. thermophillus : L. bulgaricus : Bifidobacterium sp. (1:1:0) K 1 = S. thermophillus : L. bulgaricus : Bifidobacterium sp. (1:1:1) K 2 = S. thermophillus : L. bulgaricus : Bifidobacterium sp. (1:1:2) sehingga diperoleh 21 kombinasi sebagai berikut: Tabel 3.1. Dua puluh satu Kombinasi Rancangan Percobaan Konsentrasi Bifidobacterium sp. pada soyghurt Lama inkubasi soyghurt pada suhu 37 o C T 0 T 1 T 2 T 3 T 4 T 5 T 6 12 16 18 24 0 jam 4 jam 8 jam jam jam jam jam K0 T0K0 T1K0 T2K0 T3K0 T4K0 T5K0 T6K0 K1 T0K1 T1K1 T2K1 T3K1 T4K1 T5K1 T6K1 K2 T0K2 T1K2 T2K2 T3K2 T4K2 T5K2 T6K2 2. Variabel dan parameter penelitian Variabel bebas yang digunakan adalah lama inkubasi soyghurt dengan penambahan Bifidobacterium sp. dan konsentrasi Bifidobacterium sp. pada soyghurt, ada pun variabel tergantung adalah aktivitas antimikroba soyghurt dengan penambahan Bifidobacterium sp. terhadap B. cereus. Parameter utama yang diamati adalah: daya hambat soyghurt dengan tambahan Bifidobacterium sp. terhadap B. cereus (Uji difusi) dengan parameter pendukung yaitu kadar asam laktat dan uji organoleptik. 7
3. Bagan Alir Penelitian Pembuatan Media Peremajaan S. thermophillus, L. bulgaricus, dan Bifidobacterium sp. (Kusnawati, 2004 dalam Akmar, 2006). Peremajaan B. cereus Pembuatan suspensi biakan S. thermophillus, L. bulgaricus, dan Bifidobacterium sp. Produksi kultur starter Pembuatan starter S. thermophillus (Koroleva, 1991). Pembuatan starter L. bulgaricus dan Bifidobacterium sp. (Koroleva, 1991). Produksi Soyghurt Soyghurt standar S. thermophillus : L. bulgaricus (1:1) (modifikasi Bagiastra, 1984) Soyghurt dengan penambahan Bifidobacterium sp. dengan berbagai konsentrasi Penambahan 3 ml total starter S. thermophillus : L. bulgaricus : Bifidobacterium sp. ( 1:1:1) (K 1 ) Penambahan 3 ml total starter S. thermophillus : L. bulgaricus : Bidifobacterium sp. (1:1:2) (K 2 ) Lama inkubasi suhu 37 o C 0 jam 4 jam 8 jam 12 jam 16 jam 20 jam 24 jam Pengamatan Parameter yang diamati Uji Organoleptik (Soekarto, 1985). Pengukuran kadar asam laktat (AOAC, 1995). Daya hambat soyghurt Bifidobacterium sp terhadap B. cereus (Uji Difusi) Data dianalisis menggunakan analisis ragam Uji F dan dilanjutkan uji Beda Nyata Jujur (BNJ). Rasa asam pada lama inkubasi 24 jam Aroma agak tajam pada lama inkubasi 24 jam Disukai pada lama inkubasi 0 jam Warna putih kekuningan pada lama inkubasi 20 jam Kadar asam laktat tertinggi pada lama inkubasi 24 jam dengan konsentrasi L. bulgaricus : S. thermophillus : Bifidobacterium sp. (1:1:2) yaitu 0,786% 8 Zona jernih yang terbentuk paling luas yaitu pada lama inkubasi 24 jam dengan perbandingan L. bulgaricus : S. thermophillus : Bifidobacterium sp. (1:1:1) sebesar 9,17 mm.
4. Cara kerja 4.1 Pembuatan media (Lampiran 1) Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah demann Rogosa Sharpe Agar (MRSA), demann Rogossa Sharpe Broth (MRSB), Nutrient Agar (NA), dan medium Nutrient Broth (NB). 4.2 Peremajaan S. thermophillus, L. bulgaricus, dan Bifidobacterium sp. (Modifikasi Kusnawati dalam Akmar, 2006) Isolat S. thermophillus, L. bulgaricus, dan Bifidobacterium sp. masingmasing diambil sebanyak 1 ose kemudian digoreskan secara zig-zag (streak goresan) ke dalam tabung reaksi yang berisi demann Rogossa Sharpe Agar (MRSA) miring secara aseptis, lalu diinkubasi pada suhu 37 o C selama 2 hari. 4.3 Peremajaan B. cereus Kultur B. cereus sebelum diregenerasi ke media Nutrient Broth (NB), ditumbuhkan terlebih dahulu pada media Nutrient Agar (NA) dengan cara digoreskan (streak plate) maupun metode sebar (spread plate). 4.4 Pembuatan suspensi biakan S. thermophillus, L. bulgaricus dan Bifidobacterium sp. (Oxoid, 1980) S. thermophillus, L. bulgaricus, dan Bifidobacterium sp. masing-masing diinokulasikan pada media MRS Broth sebanyak 1 ose secara terpisah dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 1-2 hari hingga terbentuk kekeruhan pada media. Kultur murni pada media demann Rogosa Sharpe Broth (MRSB) inilah yang akan digunakan dalam tahapan pembuatan starter soyghurt. 4.5 Produksi starter (Lampiran 2) Pembuatan starter S. thermophillus, L. bulgaricus dan Bifidobacterium sp. memerlukan 3 tahapan yaitu kultur induk, feed starter, dan bulk starter. 4.5.1 Pembuatan starter S. thermophillus (Koroleva, 1991) Proses pembuatan starter S. thermophillus sebanyak 8,5 g susu bubuk skim, 10 g sukrosa, 0,1 g ekstrak ragi, dan akuades 100 ml disterilisasi dengan autoklaf kemudian ditambah dengan 1% S. thermophillus yang telah diukur OD ± 0,5 ( = 600 nm) dan dinamakan media tumbuh baru (Media A). Setelah itu diinkubasi selama 9
12 jam dengan suhu 37 o C dan kultur tersebut disebut kultur induk. Proses selanjutnya membuat feed starter yaitu dengan cara menambahkan 3 ml kultur induk kedalam media tumbuh baru (Media B) sebanyak 97 ml kemudian diinkubasi selama 6 jam dengan suhu 37 o C sampai terkoagulasi. Kultur ini selanjutnya akan dijadikan bulk starter yaitu dengan cara menambahkan 3 ml feed starter ke dalam media tumbuh baru (Media C) sebanyak 97 ml selanjutnya diinkubasi selama 8 jam pada suhu 37 o C. 4.5.2 Pembuatan starter L. bulgaricus dan Bifidobacterium sp. (Koroleva, 1991) Proses pembuatan starter yaitu 8,5 g susu bubuk skim dan 100 ml akuades dicampur lalu sterilisasi menggunakan autoklaf, kemudian ditambah dengan 1% L. bulgaricus dan Bifidobacterium sp. yang telah diukur OD ± 0,5 ( = 600nm) dan dinamakan media tumbuh baru (Media A). Kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37 o C dan kultur tersebut disebut kultur induk. Proses selanjutnya membuat feed starter yaitu dengan cara menambahkan 3 ml kultur induk ke dalam media tumbuh baru (Media B) sebanyak 97 ml kemudian diinkubasi selama 29 jam dengan suhu 37 o C sampai terkoagulasi. Kultur ini yang selanjutnya akan dijadikan bulk starter yaitu dengan cara menambahkan 3 ml feed starter ke dalam media tumbuh baru (Media C) sebanyak 97 ml lalu diinkubasi selama 9 jam yang bersuhu 37 o C. 4.6 Produksi soyghurt memakai starter S. thermophillus, L. bulgaricus, dan Bifidobacterium sp. (Lampiran 3) 4.6.1 Soyghurt standar (modifikasi Bagiastra, 1984) Susu kedelai yang telah disiapkan dalam botol bening, ditambahkan dengan susu skim 5% dan sukrosa sebanyak 5% dilarutkan hingga volume akhir 1000 ml, diaduk sampai larut. Kemudian dipasteurisasi pada suhu 80-90 o C selama 30 menit dan dilakukan pendinginan sampai suhu 45 o C. Selanjutnya diinokulasi dengan starter yoghurt sebanyak 3 ml dengan perbandingan S. thermophillus dan L. bulgaricus sebanyak 1:1. Kemudian di kocok beberapa kali, lalu inkubasi pada suhu 37 o C selama 24 Jam (K 0 ). 10
4.6.2 Soyghurt dengan penambahan Bifidobacterium sp. pada berbagai konsentrasi hanya : Perlakuan K 1 dan K 2 dilakukan pekerjaan yang sama seperti 3.6.1. a. Penambahan 3 ml total starter, dengan perbandingan S. thermophillus : L. bulgaricus : Bifidobacterium sp. sebanyak 1 : 1 : 1 diinokulasikan kedalam susu kedelai (K 1 ). b. Penambahan 3 ml total starter, dengan perbandingan S. thermophillus : L. bulgaricus : Bifidobacterium sp. sebanyak 1 : 1 : 2 diinokulasikan kedalam susu kedelai (K 2 ). Kemudian ketiga produk soyghurt dengan berbagai konsentrasi tersebut dikocok beberapa kali, lalu diinkubasi dengan suhu 37 o C selama 1 X 24 jam. 4.7 Pengujian aktivitas antimikroba produk soyghurt yang ditambah kultur Bifidobacterium sp. pada B. cereus 4.7.1 Pembuatan suspensi bakteri B. cereus Sebelum uji hambat, kultur B. cereus diregenerasi dalam 100 ml Nutrient Broth (NB) steril pada Erlenmeyer 200 ml. Selanjutnya diinkubasi dalam inkubator bergoyang (shaker incubator) dengan kecepatan 150 rpm selama 24 jam. 4.7.2 Daya hambat soyghurt Bifidobacterium sp. terhadap B. cereus (Uji difusi) (modifikasi Yang et al., 1992 dan Biswas et al., 1991) Masing-masing soyghurt standar dan soyghurt yang diberi penambahan Bifidobacterium sp. diambil 4,5 ml. Soyghurt disentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 15 menit. Masing-masing supernatan diukur ph, sampai ph-nya 6,5. Kemudian dipanaskan pada suhu 100 o C selama 15 menit. Sebanyak 0,1 ml suspensi B. cereus diinokulasikan pada medium Nutrient Agar (NA) (spread plate) kemudian diratakan. Selanjutnya 0,2 µl dari supernatan B. cereus diteteskan di atas kertas cakram steril dengan diameter 6 mm, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C, ada tidaknya penghambatan ditandai dengan terbentuknya daerah bening pada bekas tetes (spot) supernatan. 11
Pengamatan uji aktivitas antimikroba dilakukan denga mengukur diameter daerah hambat (DDH) pertumbuhan bakteri yang terbentuk di sekitar kertas cakram dengan penggaris. Pengukuran dilakukan dalam satuan milimeter (mm) dengan menggunakan rumus : Keterangan : D 1 : Diameter zona jernih horizontal D 2 : Diameter zona jernih vertikal 4.8 Pengukuran kadar asam laktat soyghurt (AOAC, 1995)... (3-1) Soyghurt standar dan soyghurt yang diberi penambahan Bifidobacterium sp. telah siap, maka masing-masing kadar asam laktat yang terkandung dihitung setiap 4 jam sekali selama 1 x 24 jam. Sampel diambil sebanyak 10 ml dan dimasukkan kedalam labu Erlenmeyer lalu ditambahkan 90 ml akuades untuk dititrasi dengan NaOH 0,1 N. Indikator yang digunakan adalah phenolphtalein 1% sebanyak 3 tetes dengan perubahan warna dari tak berwarna menjadi merah muda. Menurut syarat mutu yoghurt pada SNI 01-2981-1992, jumlah asam laktat adalah 0,5-2%. Konsentrasi total asam laktat dihitung dengan persamaan : Keterangan : Vol. NaOH N NaOH Mr. As. Laktat Vol. Sampel ( ) ( ) : Volume NaOH yang terpakai (ml) : Konsentrasi NaOH (N) : 90g/ekivalen : Volume sampel yang dianalisis (ml) 4.9 Uji Organoleptik (Soekarto, 1985)... (3-2) Pengujian organolpetik soyghurt S. thermophillus : L. bulgaricus : Bifidobactreium sp. (1:1:0, 1:1:1, 1:1:2) dilakukan dengan uji mutu hedonik kepada 10 panelis. Masing-masing soyghurt dimasukan kedalam wadah dan diberi label, lalu diambil satu sendok. Soyghurt yang diberi perlakuan diuji mutu hedonik terhadap tingkat keasaman, kesukaan, aroma, dan warna, kemudian para panelis diberi lembar 12
penilaian. Penilaian dilakukan menggunakan skala numerik sebagai berikut : Tabel 3.2. Skala numerik uji hedonik tingkat keasaman Skala Hedonik Skala Numerik Tidak asam 1 Agak asam 2 Asam 3 Sangat Asam 4 Tabel 3.3. Skala numerik uji hedonik kesukaan Skala Hedonik Skala Numerik Tidak Suka 1 Agak Suka 2 Suka 3 Sangat Suka 4 Tabel 3.4. Skala numerik uji hedonik aroma Skala Hedonik Skala Numerik Tidak Tajam 1 Agak Tajam 2 Tajam 3 Sangat Tajam 4 Tabel 3.5. Skala numerik uji hedonik warna Skala Hedonik Skala Numerik Putih 1 Putih kekuningan 2 Kuning pucat 3 Kuning 4 13
C. Metode Analisis Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam (ANOVA) atau uji F pada tingkat kesalahan 1 % dan 5 %, hasil perlakuan menunjukkan berpengaruh nyata dan sangat nyata sehingga dilanjutkan uji Beda Nyata Jujur (BNJ) (Steel dan Torrie, 1993). 14