BAHAN DAN METODE PENELITIAN

34 BAHAN DAN METODE PENELITIAN TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mutu dan Keamanan Pangan, SEAFAST Center, Institut Pertanian Bogor (IPB), Laboratorium Kimia Pangan, Departemen Ilmu Teknologi Pangan (ITP), IPB, serta Laboratorium Gizi Masyarakat dan Sumberdaya Keluarga (GMSK), IPB. Adapun lama penelitian berlangsung sekitar 10 bulan dari Oktober 2005 sampai Juli 2006. BAHAN DAN ALAT Bahan Bahan baku yang digunakan adalah buah vanili segar dan kering jenis Vanila planifolia ANDREWS yang diperoleh dari Desa Tundagan, Kecamatan Ciniru, Kabupaten Kuningan, Provinsi Jawa Barat. Buah vanili segar merupakan buah vanili hijau berusia buah 7-8 bulan dengan karakteristik seragam yakni warna buah hijau, polong penuh, utuh, tanpa cacat atau pecah, panjang minimum 15 cm dan diameter minimum 10 mm. Sedangkan buah vanili kering merupakan buah yang telah mengalami proses kuring dan termasuk mutu II berdasarkan SNI 01-0010-1990 (BSN 1990), dengan syarat umum buah kering memiliki wangi khas vanili, hitam mengkilat, penuh berisi, berminyak, lentur, bebas kapang dan benda asing. Syarat khusus antara lain buah utuh atau terpotong-potong, ukuran polong utuh minimum 8 cm, ukuran polong terpotong-potong tidak disyaratkan, polong utuh yang pecah dan terpotong tidak disyaratkan, kadar air maksimum 30%bb, kadar vanilin minimum 1.5%bk dan kadar abu maksimum 9%bk. Seluruh buah vanili segar dan kering melalui proses pengeringan beku selama 52 jam. Selanjutnya digiling dan diayak dengan saringan berukuran 32 mesh. Pengemasan dilakukan menggunakan plastik rapat dengan keberadaan silica gel, lalu disimpan dalam freezer hingga percobaan dilakukan. Pada Gambar 20 dapat dilihat buah Vanilla planifolia Andrews segar dan kering yang digunakan dalam penelitian ini. Disamping bahan baku, diperlukan juga bahan untuk analisis kimia yakni analisis serat pangan (buffer Na 2 PO 4, HCl, NaOH, etanol, aseton Puriss, petroleum eter, enzim Termamyl, Pepsin, Pankreatin, kertas saring), analisis vanilin (standar vanilin, kertas saring Whatman No.1), analisis glukosa yang terdiri dari pereaksi

35 Nelson (asam molibdat, H 2 SO 4 pekat, Na arsenal), Somogy I (Na 2 SO 4, KNa Tartart, Na 2 CO 3, NaHCO 3 ), Somogy II (Na 2 SO 4, CuSO 4 ), bahan untuk pembuatan buffer sitrat (asam sitrat dan Na-sitrat) serta bahan untuk ekstraksi enzimatik dan optimasi ekstraksi enzimatik yang terdiri dari Celluclast L. (Novo), Viscozyme L. (Novo), β-glukosidase (SIGMA), etanol 95% dan alumunium foil. (a) Gambar 20 Buah Vanilla planifolia Andrews segar (a) dan kering (b) (b) Viscozyme adalah pektinase komersial campuran arabinase, selulase, hemiselulase, silanase dan β-glukanase dari Aspergillus aculeatus dengan aktifitas optimum pada ph 3.3-5.5 dan suhu 25-55 0 C. Viscozyme mengandung 120 FBG/ml dan 32.2 unit aktivitas enzim β-glukosidase (1 unit akan membebaskan 1.0 µmol glukosa dari selobiosa per menit pada ph 4 dan suhu 45 0 C). Sedangkan Celluclast adalah selulase komersial yang memiliki aktifitas selulase dari Trichoderma reesei dengan ph optimum 4.5-6 dan suhu 50-60 0 C. Celluclast mengandung 840 EGU/ml dan 27.7 unit aktivitas enzim β-glukosidase (1 unit akan membebaskan 1.0 µmol glukosa dari selobiosa per menit pada ph 4 dan suhu 45 0 C). Enzim β-glukosidase komersial berasal dari buah almond dengan ph optimum 5. Adapun unit aktivitas enzim β-glukosidase yang terkandung dalam 1 ml enzim adalah 10 unit (1 unit akan membebaskan 1.0 µmol glukosa dari salisin per menit pada ph 5). Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi peralatan gelas, ph meter, refraktometer, termometer, shaker water bath, spektrofotometer double

36 beam, refrigerator, alat pengeringan beku, alat penyaring vakum, timbangan analitik, cawan alumunium, desikator, oven dan krusibel. PROSEDUR PENELITIAN Pada Gambar 21 dapat dilihat bahwa prosedur penelitian terbagi ke dalam 5 tahap yakni; (1) Karakterisasi kimia buah vanili segar dan kering, (2) Penentuan suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase, (3) Ekstraksi enzimatik buah vanili segar; (a) Satu jenis enzim komersial dengan pelarut air dan atau etanol serta (b) Dua atau tiga jenis enzim komersial dengan pelarut etanol, (4) Optimasi ekstraksi enzimatik dan (5) Pengamatan terhadap kadar air, serat pangan, vanilin, glukosa dan padatan terlarut. Buah Vanili Kering Segar Tahap 1: 1.Karakterisasi kimia - Air - Serat pangan - Vanilin 2.Ekstraksi vanili kering tanpa enzim komersial dengan pelarut etanol Parameter : Vanilin Tahap 2: Penentuan suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase Parameter : Vanilin Tahap 3: Ekstraksi enzimatik 1.Satu jenis enzim komersial dengan pelarut etanol/air 2.Dua/tiga jenis enzim komersial dengan pelarut etanol Parameter: Vanilin Ekstrak Terbaik Tahap 4: Optimasi ekstraksi enzimatik 1.Penentuan konsentrasi enzim Parameter : Vanilin 2.Penentuan waktu inkubasi enzim Parameter : Vanilin Ekstrak Terbaik Gambar 21 Diagram alir tahapan penelitian

37 Karakterisasi Kimia Buah Vanili Segar dan Kering Karakterisasi kimia buah vanili segar dan kering merupakan tahap awal dari penelitian ini. Karakterisasi kimia bertujuan untuk mengetahui kadar senyawasenyawa penting dalam buah vanili segar dan kering, yang dapat mendukung penelitian. Analisis kimia yang dilakukan antara lain kadar air dengan metode gravimetri, serat pangan metode enzimatik dan vanilin metode spektrofotometri. Disamping itu, pada tahap ini pun dilakukan penentuan kadar vanilin dari ekstrak vanili kering yang berfungsi sebagai kontrol terhadap kadar vanilin ekstrak vanili segar yang diproses secara enzimatik. Prosedur ekstraksi vanili kering antara lain dengan menimbang sejumlah vanili kering (perhitungan bahan kering disamakan dengan bahan kering vanili segar), lalu dimasukkan ke dalam tabung tertutup dan ditambahkan aquadest 10 ml. Reaksi dibiarkan berlangsung selama 8 jam pada suhu 50 0 C menggunakan shaker water bath 150 rpm. Kemudian ekstraksi dilanjutkan dengan penambahan etanol 47.5%v/v selama 30 menit. Campuran diencerkan dengan aquadest sampai tanda batas 25 ml labu ukur. Setelah itu ekstrak disaring melalui kertas saring Whatman No.1 dan diukur kadar vanilinnya dengan metode spektrofotometri. Penentuan Suhu Inkubasi Optimum Enzim b-glukosidase Penentuan suhu optimum aktifitas enzim β-glukosidase dilakukan dengan memvariasikan suhu inkubasi pada 30, 37, 45 dan 50 0 C. Prosedurnya antara lain dengan menimbang 3.33 g vanili segar (dikonversikan menjadi berat vanili segar setelah pengeringan beku), lalu dimasukkan ke dalam tabung tertutup dan ditambahkan enzim β-glukosidase 1 ml serta aquadest 9 ml. Reaksi enzimatik dibiarkan berlangsung selama 8 jam pada suhu 30, 37, 45 dan 50 0 C menggunakan shaker water bath 150 rpm dan dilanjutkan 30 menit dengan penambahan etanol 47.5%v/v. Setiap hasil ekstraksi yang diperoleh, diencerkan dengan aquadest sampai tanda batas 25 ml labu ukur. Ekstrak disaring melalui kertas saring Whatman No.1 dan diukur kadar vanilinnya dengan metode spektrofotometri. Suhu inkubasi enzim β-glukosidase yang menghasilkan kadar vanilin tertinggi dianggap sebagai suhu optimum bagi aktifitas enzim β-glukosidase dan kondisi suhu tersebut digunakan untuk inkubasi enzim β-glukosidase pada tahapan

38 penelitian berikutnya yakni ekstraksi enzimatik serta optimasi ekstraksi enzimatik buah vanili segar. Ekstraksi Enzimatik Buah Vanili Segar Ekstraksi enzimatik buah vanili segar bertujuan untuk mengetahui bagaimana pengaruh penggunaan enzim komersial tunggal atau kombinasinya dengan atau tanpa etanol terhadap kadar vanilin ekstrak vanili segar. Pada tahap ini digunakan konsentrasi enzim, jumlah vanili segar, suhu, waktu inkubasi serta konsentrasi larutan etanol berdasarkan hasil penelitian Ruiz-Teran et al. (2001) sebagai acuan. Ekstraksi enzimatik buah vanili segar terdiri dari 2 bagian yakni; Penambahan Satu Jenis Enzim Komersial dengan Pelarut Air dan atau Etanol Tahap ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh penggunaan enzim selulase, pektinase dan β-glukosidase komersial secara tunggal serta pelarut yakni air dan atau etanol terhadap kadar vanilin ekstrak vanili segar. Pada tahap ini terdapat 2 prosedur berdasarkan jenis pelarut yang digunakan. Prosedur pertama adalah ekstraksi enzimatik yang menggunakan air sebagai pelarut yakni dengan menimbang 3.33 g vanili segar (dikonversikan menjadi berat vanili segar setelah pengeringan beku) lalu dimasukkan ke dalam tabung tertutup dan ditambahkan 1 jenis enzim sebanyak 1 ml serta aquadest 9 ml. Reaksi enzimatik dibiarkan berlangsung selama 8 jam pada suhu 50 0 C menggunakan shaker water bath 150 rpm. Sebagai prosedur kedua adalah ekstraksi enzimatik yang menggunakan air dan etanol 95% sebagai pelarut. Prosedurnya sama dengan prosedur 1, namun setelah reaksi berlangsung selama 8 jam, ditambahkan 10 ml etanol 95% dan proses ekstraksi dilanjutkan selama 30 menit. Disamping itu, dilakukan ekstraksi menggunakan pelarut air dengan atau tanpa etanol, tapi tanpa penambahan enzim. Setiap hasil ekstraksi yang diperoleh dari kedua prosedur di atas, diencerkan dengan aquadest sampai tanda batas 25 ml labu ukur. Ekstrak disaring melalui kertas saring Whatman No.1 dan diukur kadar vanilinnya dengan metode spektrofotometri. Pada Tabel 1 dapat dilihat perlakuan penggunaan 1 jenis enzim komersial berikut perlakuan pelarut untuk ekstraksi.

39 Tabel 1 Rekapitulasi perlakuan 1 jenis enzim komersial dengan pelarut air dan atau etanol untuk ekstraksi Perlakuan Penambahan 1 2 3 4 5 6 7 8 air a air+etanol b selulase+air c selulasel+air+etanol pektinase+air pektinase+air+etanol β-glukosidase+air β-glukosidase+air+etanol 1. a air 10 ml ditambahkan pada 3.33 g vanili segar, lalu reaksi berlangsung 8 jam pada suhu 50 0 C. b air 10 ml diditambahkan pada 3.33 g vanili segar, setelah reaksi berlangsung 8 jam pada suhu 50 0 C, ditambahkan 10 ml etanol 95% dan reaksi dilanjutkan selama 30 menit. c selulase 1 ml ditambahkan pada 9 ml air lalu reaksi berlangsung 8 jam pada suhu 50 0 C. 2. Jumlah vanili (3.33 g) dikonversikan terlebih dahulu, apabila digunakan vanili yang telah melalui proses pengeringan beku. Misalnya: berat vanili segar sebelum pengeringan beku adalah 3.33 g dengan kadar air 82.28%, maka berat keringnya 0.5901. Jika digunakan vanili segar setelah pengeringan beku dengan berat kering yang sama, maka jumlah yang digunakan sebesar 0.6464 g. Hasil dari penelitian tahap ini akan memberikan informasi jenis pelarut yang mampu menghasilkan kadar vanilin lebih tinggi, sehingga selanjutnya jenis pelarut tersebut digunakan pada perlakuan ekstraksi dengan penambahan kombinasi enzim. Disamping itu, kadar vanilin ekstrak yang dihasilkan dari setiap perlakuan penggunaan enzim tunggal, selanjutnya dibandingkan dengan perlakuan kombinasi enzim. Kemudian dilakukan optimasi konsentrasi dan waktu inkubasi enzim terhadap perlakuan ekstraksi enzimatik yang menghasilkan kadar vanilin tertinggi, sehingga diperoleh kadar vanilin ekstrak optimum. Penambahan Dua atau Tiga Jenis Enzim Komersial dengan Pelarut Air dan Etanol Tahap ini dilakukan untuk mengetahui efek sinergisme enzim selulase, pektinase dan β-glukosidase sehingga dapat ditentukan apakah ketiga enzim komersial tersebut lebih efektif digunakan secara tunggal atau kombinasi. Pada tahap ini terdapat 2 prosedur berdasarkan jumlah enzim yang digunakan. Prosedur pertama adalah ekstraksi enzimatik menggunakan 2 jenis enzim yakni dengan menimbang 3.33 g vanili segar (dikonversikan menjadi berat vanili segar

40 setelah pengeringan beku) lalu dimasukan ke dalam gelas tertutup dan ditambahkan enzim I dan enzim II masing-masing sebanyak 1 ml dan aquadest 8 ml. Reaksi enzimatik dibiarkan berlangsung selama 8 jam pada suhu 50 0 C menggunakan shaker water bath 150 rpm. Setelah ekstraksi enzimatik, ditambahkan 10 ml etanol 95%, lalu proses ekstraksi dilanjutkan selama 30 menit. Sebagai prosedur kedua adalah ekstraksi enzimatik yang menggunakan 3 jenis enzim, dimana prosedurnya sama dengan prosedur 1, tapi ditambahkan enzim III yakni β-glukosidase sebanyak 1 ml sehingga jumlah air yang digunakan adalah 7 ml. Reaksi enzimatik dibiarkan berlangsung selama 8 jam pada suhu 50 0 C. Setelah ekstraksi enzimatik, ditambahkan 10 ml etanol 95%, lalu proses ekstraksi dilanjutkan selama 30 menit. Setiap hasil ekstraksi yang diperoleh dari kedua prosedur di atas, diencerkan dengan aquadest sampai tanda batas 25 ml labu ukur. Ekstrak disaring melalui kertas saring Whatman No.1 dan diukur kadar vanilinnya dengan metode spektrofotometri. Pada Tabel 2 dapat dilihat perlakuan penggunaan 2 atau 3 jenis enzim komersial untuk ekstraksi. Tabel 2 Rekapitulasi perlakuan 2 atau 3 jenis enzim komersial dengan pelarut air dan etanol untuk ekstraksi Perlakuan Penambahan 1 2 3 4 selulase+pektinase a selulase+β-glukosidase pektinase+β-glukosidase selulase+pektinase+β-glukosidase b 1. a selulase 1 ml dan pektinase 1 ml ditambahkan pada 8 ml air, setelah reaksi berlangsung 8 jam pada suhu 50 0 C, ditambahkan 10 ml etanol 95% dan reaksi dilanjutkan selama 30 menit. b selulase 1 ml, pektinase 1 ml dan β-glukosidase 1 ml ditambahkan pada 7 ml air, setelah reaksi berlangsung 8 jam pada suhu 50 0 C, ditambahkan 10 ml etanol 95% dan reaksi dilanjutkan selama 30 menit. 2. Jumlah vanili (3.33 g) dikonversikan terlebih dahulu, apabila digunakan vanili yang telah melalui proses pengeringan beku.. Misalnya: berat vanili segar sebelum pengeringan beku adalah 3.33 g dengan kadar air 82.28%, maka berat keringnya 0.5901. Jika digunakan vanili segar setelah pengeringan beku dengan berat kering yang sama, maka jumlah yang digunakan sebesar 0.6464 g.

41 Kadar vanilin ekstrak yang dihasilkan dari setiap perlakuan kombinasi enzim, selanjutnya dibandingkan dengan perlakuan penggunaan enzim tunggal. Kemudian dilakukan optimasi konsentrasi dan waktu inkubasi enzim terhadap perlakuan ekstraksi enzimatik yang menghasilkan kadar vanilin tertinggi, sehingga diperoleh kadar vanilin ekstrak optimum. Optimasi Ekstraksi Enzimatik Pada tahap ini dilakukan optimasi ekstraksi enzimatik untuk memperoleh kadar vanilin ekstrak optimum dengan penambahan enzim komersial secara efisien. Adapun optimasi ekstraksi enzimatik yang dilakukan antara lain; Penentuan Konsentrasi Optimum Enzim Terbaik Berdasarkan hasil percobaan pada tahap 3 akan diketahui ekstrak terbaik dengan kadar vanilin tertinggi yang diperoleh melalui penambahan enzim tertentu dengan pelarut air dan atau etanol. Selanjutnya untuk menentukan unit aktifitas enzim optimum dilakukan prosedur percobaan yang sama, tapi unit aktifitas enzim yang ditambahkan divariasikan. Dari percobaan ini akan diketahui berapa jumlah enzim yang diperlukan agar seluruh substrat yang terdapat dalam buah dapat berikatan dengan enzim secara optimal, dimana hal ini ditunjukkan dengan kadar vanilin bebas dalam ekstrak yang mencapai batas optimum. Penentuan Waktu Inkubasi Optimum Enzim b-glukosidase Setelah diketahui konsentrasi enzim optimum, lalu dilakukan penentuan waktu inkubasi optimum dengan prosedur yang sama. Hal ini bertujuan untuk meningkatkan efisiensi ekstraksi enzimatik. Pada tahap ini waktu inkubasi divariasikan, lalu ekstrak diukur kadar vanilinnya dengan metode spektrofotometri. Pengamatan Pengamatan yang dilakukan meliputi analisis kadar air, serat pangan, vanilin, glukosa dan padatan terlarut dalam ekstrak. Kadar Air Metode Gravimetri (Apriyantono dkk. 1989) Penetapan kadar air buah vanili segar dan kering sebelum dan sesudah pengeringan beku dilakukan dengan metode gravimetri. Cawan alumunium

42 kosong dikeringkan dalam oven selama 15 menit dan didinginkan dalam desikator selama 10 menit kemudian ditimbang. Selanjutnya sampel sebelum pengeringan beku ditimbang sebanyak kurang lebih 5 g untuk analisis kadar air buah awal dan sampel setelah pengeringan beku ditimbang kurang lebih 0,5 g. Setelah itu dimasukkan ke dalam oven selama sekitar 16 jam hingga diperoleh berat tetap. Cawan beserta isinya dipindahkan ke dalam desikator, didinginkan lalu ditimbang. Perhitungan: w % kadar air (berat kering) = 3 x100 w w % kadar air (berat basah) = 3 x100 w 2 1 w 1 = berat sampel (g) w 2 = berat sampel setelah dikeringkan(g) = kehilangan berat (g) w 3 Kadar Serat Pangan Metode Enzimatik (Asp et al. 1993) Serat pangan (serat makanan) adalah bagian dari makanan yang tidak dapat dihidrolisis oleh enzim-enzim pencernaan, meliputi selulosa, hemiselulosa, lignin, pentosan, gum dan senyawa pektik. Analisis serat pangan meliputi homogenisasi dan liofilisasi. Prosedur analisisnya antara lain; sampel digiling menggunakan petroleum eter pada suhu kamar selama 15 menit (40 ml petroleum eter per gram sampel). Lalu ditimbang 1 g sampel dan dimasukan ke dalam erlenmeyer. Kemudian ditambahkan 25 ml 0.1 M buffer Na 2 PO 4 ph 6 dan diaduk merata. Enzim Termamyl ditambahkan 0.1 ml dan erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil. Lalu diinkubasi di dalam penangas air pada suhu 100 0 C selama 15 menit. Campuran dibiarkan dingin dan ditambahkan 20 ml air destilata, atur ph menjadi 1.5 menggunakan HCl. Kemudian ditambahkan 100 mg Pepsin, erlenmeyer ditutup dan diinkubasi di dalam penangas air bergoyang pada suhu 40 0 C selama 60 menit. Setelah itu 20 ml air destilata ditambahkan dan atur ph menjadi 6.8 menggunakan NaOH. Sebanyak 100 mg Pankreatin ditambahkan, erlenmeyer ditutup dan diinkubasi di dalam penangas air bergoyang pada suhu 40 0 C selama 60 menit. Lalu ph diatur menggunakan HCl. Campuran kemudian disaring

43 menggunakan crucible (porosity 2) yang telah diketahui beratnya dan mengandung 0.5 celite kering, lalu dibilas dengan 2x10 ml air destilata. - Residu (serat yang tidak larut) Dari prosedur di atas, selanjutnya residu (serat yang tidak larut) dibilas dengan 2x10 ml etanol 95% dan 2x10 ml aseton. Kemudian dikeringkan pada suhu 105 0 C sampai mencapai berat konstan (semalam). Lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang (D1). Selanjutnya diabukan pada suhu 550 0 C selama 5 jam. Lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang (I1). - Filtrat (serat yang larut) Volume filtrat diatur menjadi 100 ml. Selanjutnya 400 ml etanol 95% hangat (60 0 C) ditambahkan dan dibiarkan mengendap selama 1 jam. Larutan disaring menggunakan crucible (porosity 2) yang telah diketahui beratnya dan mengandung 0.5 celite kering. Serat yang larut dibilas dengan 2x10 ml etanol 78%, 2x10 ml etanol 95% dan 2x10 ml aseton. Kemudian dikeringkan pada suhu 105 0 C selama semalam. Lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang (D2). Selanjutnya diabukan pada suhu 550 0 C selama 5 jam. Lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang (I2). Blanko untuk serat yang tidak larut dan serat larut diperoleh melalui cara yang sama dengan prosedur untuk sampel, tapi tanpa sampel (B1 dan B2). Nilai blanko ini sewaktu-waktu harus dicek. Perhitungan: D1 I1 B1 % serat pangan tidak larut = x100 W D2 I2 B2 % serat pangan larut = x100 W D I B % serat pangan total = x100 W W = berat sampel (g) D = berat setelah pengeringan (g) I = berat setelah pengabuan (g) B = berat blanko bebas abu (g)

44 Kadar Vanilin Buah Vanili Metode Spektrofotometri (Hayani dan Fatimah 2002) Kurva standar vanilin yang digunakan untuk penentuan kadar vanilin buah adalah sama dengan kurva standar yang dipakai untuk penentuan kadar vanilin dalam ekstrak vanili. Adapun penentuan kadar vanilin dalam buah dilakukan dengan menimbang 5 g vanili kering. Jumlah ini dikonversikan dulu apabila digunakan buah vanili segar atau kering yang telah melalui perlakuan pengeringan beku (Lampiran 5). Selanjutnya buah vanili direndam selama 24 jam dengan 70 ml alkohol 60% di dalam erlenmeyer tertutup. Campuran disaring dengan kertas saring Whatman No.1 menggunakan alat penyaring vakum dan dibilas dengan alkohol 60%, lalu ditepatkan dengan penambahan alkohol 60% hingga tanda batas dalam labu ukur 100 ml. Kemudian larutan dipipet sebanyak 10 ml, dimasukan ke dalam labu ukur 100 ml dan ditambahkan aquadest hingga tanda batas (larutan X). Larutan X dipipet sebanyak 2 ml, dimasukan ke dalam labu ukur 25 ml dan ditambahkan aquadest hingga tanda batas. Disisi lain, larutan X dipipet sebanyak 2 ml, dimasukan ke dalam labu ukur 25 ml, ditambahkan 1 ml NaOH 0.1N dan diencerkan dengan aquadest hingga tanda batas. Perhitungan : Kadar vanilin atas dasar bahan kering (µg/g) = X x fpx 25 M (100% H %) X = konsentrasi larutan sampel yang terbaca di spektrofotometer (µg/ml) fp = faktor pengenceran (500) M = massa sampel (g) H% = kadar air setelah pengeringan beku Kadar Vanilin Ekstrak Metode Spektrofotometri (AOAC 36.2.07 1995, revisi Maret 1998) Sampel ekstrak vanili segar yang telah disaring dengan kertas saring Whatman No.1 menggunakan alat penyaring vakum, selanjutnya dianalisis dengan spektrofotometer double beam. Sebanyak 10 ml larutan sampel dipipet ke dalam 100 ml labu ukur, diencerkan dengan aquadest hingga tanda batas. Pada labu ukur lainnya, ditambahkan 80 ml aquadest dan 1 ml NaOH 0.1N, lalu diencerkan dengan aquadest hingga tanda batas. Pengenceran dapat disesuaikan,

45 agar sampel memiliki nilai absorbansi antara 0.2-0.8. Nilai absorbansi dari larutan basa ditentukan pada 348 nm menggunakan larutan netral sebagai blanko. Lalu kandungan vanilin sampel diukur melalui kurva standar. Kurva standar dibuat dengan cara melarutkan 0.1 g vanilin dengan 5 ml alkohol 99.8% di dalam labu ukur 100 ml. Lalu larutan dipipet 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 dan 10 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Aquadest ditambahkan hingga tanda batas (larutan X). Kemudian masing-masing larutan X dipipet sebanyak 5 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Aquadest ditambahkan hingga tanda batas. Disisi lain, larutan X dipipet masing-masing 5 ml lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Setelah itu, sebanyak 1 ml NaOH 0.1 N ditambahkan dan larutan diencerkan dengan aquadest hingga tanda batas. Nilai absorbansi dari larutan basa ditentukan pada 348 nm menggunakan larutan netral sebagai blanko, lalu dibuat kurva standar. Kadar Glukosa Ekstrak Vanili Metode Somogy-Nelson (Unpas 2003) Metode ini cukup akurat untuk mengukur kadar gula pereduksi karena warna yang terbentuk stabil. Kurva standar dibuat dengan cara melarutkan 0.02 g glukosa standar dengan air bebas mineral di dalam labu ukur 100 ml. Larutan tersebut dipipet 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 dan 2 ml, lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan air bebas mineral hingga mencapai 2 ml. Kemudian ke dalam setiap tabung yang berisi larutan glukosa tersebut ditambahkan pereaksi Somogy I sebanyak 1.6 ml dan Somogy II sebanyak 0.4 ml. Lalu larutan dikocok secara homogen dan ditutup dengan kelereng. Setelah itu dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Lalu didinginkan dan ditambahkan pereaksi Nelson sebanyak 2 ml serta air bebas mineral 4 ml. Larutan dikocok hingga gas CO 2 keluar dan nilai absorbansi diukur pada? 520 nm. Blanko dibuat sama dengan di atas, tapi sampel diganti dengan air bebas mineral. Prosedur analisis gula pereduksi yang terdapat dalam ekstrak vanili pun sama dengan pembuatan standar. Larutan sampel (ekstrak vanili) sebanyak 10 ml dimasukan ke dalam labu ukur 25 ml. Kemudian larutan Pb asetat jenuh dan air bebas mineral ditambahkan kedalamnya hingga tanda batas. Larutan dikocok merata dan disaring dengan kertas saring Whatman No.1 menggunakan alat penyaring vakum. Untuk menghilangkan kelebihan Pb yang digunakan dalam

46 penjernihan, ditambahkan Na oksalat anhidrat 1 g ke dalam filtrat. Larutan kemudian disaring kembali dengan kertas saring Whatman No.1 menggunakan alat penyaring vakum sebanyak 2 kali agar filtrat benar-benar jernih. Selanjutnya filtrat dipipet sebanyak 1 ml dan diencerkan dengan air bebas mineral hingga tanda batas labu ukur 50 ml. Lalu sebanyak 1 ml larutan dimasukan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan air bebas mineral 1 ml, lalu dilakukan prosedur analisis seperti pada pembuatan standar gula pereduksi. Perlu diperhatikan bahwa sampel harus bebas impuritas dan pemanasan serta pendinginan sampel dengan standar harus seragam. Perhitungan : X x fpxva Kadar glukosa atas dasar bahan kering ekstrak (µg/ml) = Vs X = konsentrasi larutan sampel yang terbaca di spektrofotometer (µg/ml) fp = faktor pengenceran Va = volume akhir Vs = volume sampel (ml) Kadar Padatan Terlarut Kadar padatan terlarut dalam ekstrak vanili segar dan kering diukur dengan 2 metode yakni gravimetri dan refraktrometri. Pengukuran kadar padatan terlarut dengan metode gravimetri dilakukan untuk perhitungan kadar vanilin ekstrak atas dasar berat kering. Prosedurnya antara lain; cawan porselen dikeringkan dalam oven selama 24 jam dan didinginkan dalam desikator selama 10 menit kemudian ditimbang. Selanjutnya ekstrak vanili segar sebanyak 2.5 g dimasukan ke dalam cawan. Lalu dikeringkan menggunakan oven suhu 105 0 C selama sekitar 20 jam hingga diperoleh berat tetap. Cawan beserta isinya dipindahkan ke dalam desikator, didinginkan lalu ditimbang. Perhitungan: w % kadar padatan terlarut = 2 x100 w w 1 = berat sampel (g) = berat sampel setelah dikeringkan (g) w 2 1