BAB IV METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini terdiri dari 2 kegiatan penelitian, yaitu sebagai berikut : 1. Penelitian tahap I yaitu penelitian eksplorasi untuk melihat hasil modifikasi fisik kitosan memiliki karaterisasi nanopartikel dan memilki kemampuan menghambat pertumbuhan P.aeruginosa ATCC 27853. 2. Penelitian tahap II yaitu penelitian eksperimental laboratoris untuk mengetahui hubungan konsentrasi nano kitosan terhadap pertumbuhan P.aeruginosa ATCC 27853. B. Sampel Penelitian dan Bahan Uji Sampel penelitian yang digunakan adalah bakteri P. aureginosa ATCC 27853 yang didapat dari Departemen Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Sedangkan Pembuatan nano kitosan menggunakan eksoskeleton kumbang tanduk (Xylotrupes gideon L) dari pucuk tanaman kelapa di Laboratorium Biokimia THP IPB. C. Waktu dan Tempat Pembuatan nano kitosan dilakukan di Laboratorium Biokimia Teknologi Hasil Perairan Fakultas Ilmu Perikanan dan Kelautan Institut Pertanian Bogor. Uji Particle Size Analizer (PSA) dilakukan di Analisis bahan FMIPA, IPB. Uji Scanning Electron Microscope (SEM) dilakukan di Laboratorium Scanning Electron Microscope (SEM) Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Institut Teknologi Bandung (ITB). Uji aktivitas partikel nano kitosan dengan metode difusi dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia pada bulan Oktober sampai Desember 2014. 17
D. Variabel Penelitian Variabel bebas : Nano kitosan yang di ekstrak dari eksoskeleton Kumbang Tanduk (Xylotrupes Gideon L) Variabel tergantung : Pertumbuhan Pseudomonas aureginosa ATCC 27853 E. Definisi Operasional 1. Xylotrupes gideon merupakan kumbang tanduk dan hama yang menyerang pucuk kelapa 2. Kitosan merupakan polimer alami yang memiliki keunggulan sebagai antibakteri 3. Nano kitosan hasil pemecahan partikel kitosan yang berukuran antara 10-1000 nm, dan mengandung gugus asetil yang rendah (melalui proses deasetilasi). Kemudian diencerkan dengan aquabidestilata menjadi beberapa konsetrasi 3000 ppm, 2000 ppm, 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm (w/v) dengan menggunakan skala rasio. 4. Antibakteri adalah zat yang dapat membunuh atau menekan pertumbuhan bakteri. 5. Pseudomonas aeruginosa adalah bakteri berbentuk batang, motil dan berukuran sekitar 0,6x 2 mm. bakteri gram negatif dan dapat muncul dalam bentuk tunggal, berpasangan atau kadang dalam bentuk rantai pendek. F. Alat dan Bahan Penelitian Alat : Magnetic stirrer Magnetic bar BSC (Biosafety Cabinet) Spektrofotometri Neraca digital ph universal Yellow Tip dan white tip Tabung reaksi Botol Semprot Anaerobic Jar Gas pack Inkubator Autoclaf Bunsen Batang ose Botol kaca steril 18
Mikropipet Pipet 10 μl Kertas saring Vortex Cawan petri Spatula/ Batang L Alumunium foil Spidol marker Pinset Sprektrofotometri Sarung tangan dan masker steril Lemari pendingin Bahan : Nano kitosan eksoskeleton kumbang tanduk (Xylotrupes gideon L) NaCl 0,85% Larutan Mc Farland 0,5 Bakteri P.aeruginosa ATCC 27853 Centrimide agar Paper disc Alkohol Asam asetat 1 N Aqua bidestilata G. Cara Kerja 1. Persiapan Alat dan Bahan a. Sterilisasi alat dan bahan Sterilisasi alat dengan alkohol dan autoklaf b. Pembuatan kitin/kitosan 1) Demineralisasi Penghilangan mineral dilakukan pada suhu 90 C dengan menggunakan larutan HCl 1 N dengan perbandingan sampel dengan larutan HCl = 1:7 (gr serbuk/ml HCl) sambil diaduk selama 60 menit. Kemudian disaring untuk diambil endapannya. 19
2) Deproteinasi Proses ini dilakukan pada suhu 90 C dengan menggunakan larutan NaOH 3 N dengan perbandingan serpihan serangga dengan NaOH = 1:10 (gr serbuk/ml NaOH) sambil diaduk selama 60 menit. 3) Dekolorisasi Endapan hasil deproteinsasi ditambahkan dengan 4% NaOCl (w/v) selama 10 menit pada suhu kamar. Perbandingan solid dan solven 1:10 (w/v). 4) Deasetilasi Proses ini dilakukan pada suhu 90 C dengan menggunakan larutan NaOH 50% dengan perbandingan serpihan serangga dengan NaOH = 1:10 (gr serbuk/ml NaOH) sambil diaduk selama 60 menit. c. Pembuatan nano kitosan Kitosan yang berupa serbuk diambil sebanyak 1,5 gram, kemudian larutkan dalam asam asetat 1-2% sebanyak 50-100 ml. Setelah itu, masukkan aqua destilata sampai volume di 500 ml. kemudian masukkan magnetic bar 3 cm. lakukan stirrer dengan menggunakan magnetic bar selama 2 jam. Kemudian masukkan tween 0,1 % sebanyak 0,1 ml. Stirer kembali selama 30 menit. Setelah itu masukkan TPP 100 ml (drop to drop). Stirer kembali selama 1 jam. Kitosan yang didapat pada konsentrasi 3000 ppm (sesuai dengan pengenceran),dilakukan analisis untuk ukuran partikel menggunakan SEM dan PSA menunjukkan partikel yang dihasilkan dalam bentuk nano kitosan, Nano kitosan selesai dan siap digunakan. Bila tidak langsung digunakan, nano kitosan dapat disimpan di tempat yang steril. Cara pembuatan pengenceran larutan nano kitosan: Rumus pengenceran M1 x V1 = M2 x V2 Larutan nano Kitosan 3000 ppm Larutan nano kitosan 2000 ppm: 1,33 ml nano kitosan dicampur 0,67 ml aquabidestilata lalu divortex. Larutan nano kitosan 1000 ppm : 0,67 ml nano kitosan dicampur 1,33 ml aquabidestilata lalu divortex. 20
Larutan nano kitosan 500 ppm : 0,3 ml nano kitosan dicampur 1,7 ml aquabidestilata lalu divortex. Larutan nano kitosan 250 ppm : 0,167 ml nano kitosan dicampur 1,833 ml aquabidestilata lalu divortex. d. Peremajaan bakteri Membakar 2 batang ose hingga ada nyala api, kemudian menunggu hingga dingin. Mengambil bakteri dari cawan yang berisi bakteri P.aeruginosa ATCC 27853 dengan batang ose pertama. Menggoreskan batang ose pertama pada media agar hingga setengah cawan, kemudian ose dibakar hingga ada nyala api. Mengambil batang ose kedua dan menggoreskan pada agar, dimulai dari bekas goresan batang ose pertama hingga daerah agar yang belum tergores. Memasukkan media agar tersebut ke dalam inkubator 37ºC selama 18-24 jam 2. Metode Difusi Cakram a. Persiapan media padat Media padat yang digunakan adalah Cetrimide agar. Media Centrimide agar dibuat dengan cara melarutkan Cetrimide ke dalam aquabides. Larutan tersebut ditempatkan di dalam labu ukur dan ditutup kain kasa. Lalu larutan ini dimasak pada suhu 100ºC. setelah dihomogenkan secara manual dengan tangan di dalam air mengalir. Larutan kemudian dipipet 20 ml dan dimasukan kedalam tabung reaksi steril. Untuk membuat agar miring dalam tabung, larutan tersebut dipipet sebanyak 5 CC dan masing-masing tabung ditutup menggunakan kapas dan alumunium foil. Media tersebut disterilisasikan dengan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit. Setelah itu, 20 ml agar yang sudah di pindahkan ke dalam cawan petri steril. Media didiamkan dalam cawan petri steril sampai agar beku. Tabung yang berisi 5 CC Cetrimide dimiringkan dan didiamkan sampai agar membeku. Apabila media sudah beku, media disimpan dalam kulkas. 21
b. Persiapan suspensi bakteri Pertama-tama dilakukan kultur bakteri dengan mengambil satu sengkelit bakteri dengan kawat inokulasi steril. Masukkan ke dalam tabung yang berisi Cetrimide agar padat dengan cara digoreskan. Inkubasi bakteri selama 24 jam pada suhu 37ºC. Persiapan suspensi bakteri yang telah dikultur, terlebih dahulu distandarisasi dengan menggunakan 0,5 Mc Farland. Ambil satu sengkelit bakteri dan masukkan ke dalam tabung berisi 0,85% ml NaCl, kemudian ukur tingkat kekeruhannya dengan alat pengukur Mc Farland yaitu spektrofotometri hingga menunjukkan angka 0,5. Bandingkan juga tingkat kekeruhannya dengan 0,5 Mc Farland sampai menunjukkan tingkat kekeruhan yang sama. Bila kekeruhannya kurang dari standar maka dapat ditambah bakteri, bila kekeruhannya melebihi standar maka ditambahkan NaCl. Tingkat kekeruhan bakteri yang sama dengan kekeruhan standar menunjukkan kerapatan bakteri sama dengan standar Mc Farland 10 8 CFU/ml. Bakteri sudah siap digunakan dalam penelitian. c. Pengujian antibakteri Larutan nano kitosan, paper disc, antibiotik, media Cetrimide agar dan asam asetat 1 N harus dalam keadaan suhu ruang sebelum digunakan. Tahap pertama pada uji aktivitas antibakteri ini adalah sebanyak 20 ml media Cetrimide agar dalam keadaan padat yang telah dingin dan steril ditambahkan 100 μl bakteri uji menggunakan pipet mikro. Bakteri uji diletakan diatas permukaan media agar padat dengan teknik streak kontinyu dengan batang L. Setelah itu masing-masing paper disc diletakkan dipermukaan cawan petri berisi agar dan bakteri dengan menggunakan pinset dan ose steril. Sedikit menekan supaya paper disc itu benar-benar menempel pada agar. Tahap selanjutnya, meneteskan larutan nano kitosan yang telah dilakukan pengenceran lima konsentrasi pada setiap paper disc sebanyak 20 μl sehingga didapat konsentrasi larutan nano kitosan per paper disc dengan menggunakan pipet mikro. Untuk kontrol paper disc diteteskan antibiotik dan asam asetat 1 N sebanyak 20 μl lalu dibiarkan menyerap selama 10 menit. Dalam satu cawan ditempelkan 1 atau dua paper disc 22
dengan konsentrasi berbeda dalam satu cawan. Penelitian ini dilakukan tiga kali perlakuan dengan metode yang sama (triplo). Cawan tersebut kemudian diinkubasi dalam keadaan terbalik dalam waktu 1x 24 jam dengan suhu 37ºC. aktivitas antibakteri dapat dilihat dengan mengamati zona hambatan yang terbentuk di sekeliling paper disc. Antibakteri dikatakan positif jika terbentuk zona hambatan di sekeliling paper disc dan antibakteri negatif ditandai dengan tidak terbentuknya zona hambat. Diameter zona hambat yang terbentuk diukur lebarnya menggunakan penggaris atau jangka sorong. Besar diameter zona hambat dihitung dengan cara mengurangi diameter zona hambat yang terbentuk pada cawan petri uji dengan diameter paper disc. 23
H. Alur Penelitian Eksoskeleton kumbang tanduk Demineralisasi Deproteinisasi Dekolorisasi Netralisasi Deasetilasi KITOSAN Kitosan dilarutkan dalam asam asetet Metode Magnetic stirer Ditambahkan emulsifier (Tween 80) 0,2% secara tetes demi tetes Didiamkan selama 30 menit Ditambahkan tripoliphospat 0,1% Didiamkan selama 30 menit Larutan Nano Kitosan Dikeringkan dengan spray dryer Uji SEM Uji PSA Serum Nano Kitosan yang stabil Uji Aktivitas Antibakteri Difusi Mendapatkan Konsentrasi Terbaik dalam menberikan zona hambat Gambar 7. Alur Penelitian 24